El método proporciona información sobre los efectos del tratamiento dependiente del ciclo celular y permite y en un estudio en profundidad de la interacción entre la proliferación celular y los mecanismos de afrontamiento contra el daño del ADN. Este método combina puntos finales importantes de la respuesta al daño del ADN, incluyendo el reconocimiento y reparación de fragmentos de doble cadena, los efectos del ciclo celular y la muerte celular eventual por apoptosis en un ensayo completo. Hemos utilizado esta técnica principalmente para investigar las respuestas específicas del tratamiento y los efectos secundarios de los tratamientos radioquiterapéuticos en oncología clínica.
El ensayo es muy útil para estudios correlativos en los campos de la radiobiología y la radioterapia, pero también se puede aplicar a varias otras áreas de la oncología. Después de recoger las células del cultivo de acuerdo con los procedimientos estándar de recolección celular, resuspendir el pellet en un mililitro de PBS. Y transfiera las células a dos mililitros de solución de fijación en una campana.
Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, recoger las células por centrifugación y decantar el sobrenadante. Es importante fijar las celdas como una suspensión de una sola célula, y mantener el tiempo de fijación constante para todas las muestras. Dé a las células adherentes suficiente tiempo para separarse para obtener células bien redondeadas para su análisis.
A continuación, afloje el pellet tocando y resuspender las células en tres mililitros de 70%etanol. Para lavar las células antes de la tinción, sedimentar las células por centrifugación, y aflojar el pellet tocando. A continuación, resuspender las células con dos lavados consecutivos con tres mililitros de solución de lavado y un lavado con un mililitro de solución de lavado.
Descartar el sobrenadante entre cada lavado. Después del último lavado, aspira cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet y resuspender el pellet lucento en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de interés. Después de una hora a temperatura ambiente, recoger las células por centrifugación y aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet.
Luego, resuspender el pellet aflojado en 100 a 250 microlitros de solución de tinción de ADN y dispensar las células a través de la tapa del colador celular de un tubo de muestra con un tamaño de poro de malla de 35 micrómetros. Para analizar las celdas por citometría de flujo, abra la pestaña de parámetros en la ventana del citometro y seleccione los parámetros como se indica en la tabla. A continuación, abra la ventana de la hoja de cálculo y cree trazados como se indica.
Cargue una muestra de control en el citometro y pulse el botón ejecutar. Seleccione el primer tubo en la ventana del navegador y haga clic en el nombre del tubo. Ajuste los voltajes del detector para la dispersión hacia delante y hacia el lado y DAPI en la pestaña de parámetros de la ventana del inspector.
Presione el botón de espera para continuar con la configuración de la hoja de trabajo en el software. Utilice la herramienta de puerta poligonal para definir la población de celdas en el área de dispersión hacia delante frente a la gráfica de área de dispersión lateral y utilice la herramienta de puerta rectangular para definir la población de celdas individuales en el gráfico de área DAPI frente a DAPI. Presione el control G para mostrar la jerarquía de población y haga clic en los nombres de puerta predeterminados para cambiarles el nombre.
Posteriormente, haga clic con el botón derecho en todos los histogramas para seleccionar mostrar poblaciones y celdas individuales en el menú contextual. Adquiera muestras de control y tratadas para optimizar los voltajes del detector de los fluoróforos acoplados a anticuerpos para cubrir todo el rango dinámico de la señal. Para medir las muestras, pulse el botón Ejecutar en el citómetro y utilice el panel de adquisición del software para medir las muestras.
A continuación, seleccione archivo, exportación y experimentos para seleccionar la exportación de directorios en el cuadro de diálogo para guardar los datos como archivos FCS de punto. Para evaluar los datos, arrastre y suelte los archivos FCS de punto en el navegador de muestras del software de análisis citométrico de flujo. Y utilice la herramienta de polígono para definir la población de celdas en el trazado de área de dispersión hacia delante frente a lado y para excluir los desechos del análisis.
En el trazado de área DAPI frente a DAPI, utilice la herramienta rectángulo para definir la población de celdas individuales y excluir cualquier doblete o grupo de celdas del análisis. En el histograma de área DAPI, utilice la herramienta bisector para distinguir células individuales con un contenido normal de ADN de las células apoptóticas con ADN degradado. Seleccione la biología de la herramienta y el ciclo celular para abrir la herramienta de modelado del ciclo celular y seleccione Dean-Jett Fox para estimar la frecuencia de las células en las fases G uno S y G dos M.
Cree puertas de fase G one S y G two y M en el DAPI con la gráfica de área DAPI frente a daPI de la población del ciclo celular para permitir una medición específica de gamma H dos A X de un ciclo celular. Utilice la herramienta bisector para distinguir las células fosfohistone H tres células positivas y negativas en el histograma de área De Alexa 555 de la población del ciclo celular y para distinguir la base CAS de tres celdas positivas y negativas en el histograma de área Alexa 647 de la población de células individuales. Presione el control T para abrir el editor de tablas y configurar la tabla como se indica.
A continuación, seleccione Para archivo para establecer el formato y el destino en la sección de salida de la cinta de opciones de menú y exportar los datos a una hoja de pliegos. Los iones de carbono inducen niveles máximos de gamma H dos AX más altos en las células del glioblastoma que disminuyen más lentamente y permanecen significativamente elevados en 24 a 48 horas en comparación con la radiación fotónica a la misma dosis física. Tanto para los iones de carbono como para la radiación fotónica, los niveles de gamma H dos AX fueron más altos en las células de una fase G probablemente porque la reparación de la rotura de doble hebra de ADN se limita a la vía de unión final nohomojosa en esta etapa del ciclo celular.
En línea con la mayor tasa de inducción de doble hebra y cinética de reparación más lenta, los iones de carbono inducen una detención del ciclo celular más fuerte y más duradera en G dos fases y una tasa más alta de apoptosis que los fotones. Dependiendo de la fuerza del efecto de tratamiento, la resolución de las diferentes fases del ciclo celular puede ser difícil. En algunas líneas celulares, la concentración de DAPI tiene un gran impacto en la calidad del perfil del ciclo celular y necesita ser ajustada.
Las diapositivas se pueden preparar a partir de las muestras restantes después de la citometría de flujo para evaluar el número, el tamaño y la forma de gamma H dos focos de AX y para distinguir entre la tinción focal y la gamma F de dos ejes. Usando nuestro método, podríamos mostrar que las células madre mesenquimales son relativamente resistentes contra las radiaciones ionizantes y la inhibición de la topoisomerasa pero sensibles a la gliomiacina. Como los humos de PFA son tóxicos, utilice siempre una campana de humos al preparar la solución de fijación y durante el paso de fijación.
También recuerde usar guantes al manipular DAPI.
