Este trabajo fue apoyado por una beca de LP Wellcome Trust

1. Equipos y Materiales <ol><li> Estos experimentos utilizar una configuración estándar de electrofisiología compone de un estimulador, una unidad de aislamiento de estímulos, dos amplificadores de microelectrodos, un sistema de adquisición de datos y un ordenador con el software de colección. El equipamiento adicional incluye una jaula de Faraday, un microscopio estereoscópico con un codo, una mesa de aislamiento de vibración, una fuente de luz, y una plataforma de grabación. </li><li> Cinco micromanipuladores se utilizan. Dos micromanipuladores requieren controles muy bien para el posicionamiento de los electrodos de registro, mientras que los otros tres micromanipuladores sólo requieren controles a la posición bruta de los dos electrodos de estimulación y el electrodo de masa. El micromanipulador para el electrodo de registro DLM se coloca en el extremo final de la preparación (a la izquierda del experimentador) y el micromanipulador para el electrodo de registro TTM se coloca entre el experimentador y el lado de la preparación (un poco a la izquierda del experimentador). Los dos micromanipuladores que llevará a cabo la simulación de electrodos se colocan a la cabeza de la preparación (a la derecha del experimentador). El micromanipulador para el electrodo de masa se coloca en el extremo de la preparación </li><li> Tire de microelectrodos de vidrio de grabación con resistencias de 40 a 60 mW y almacenar planos en un plato con el apoyo de la cera. Para la estimulación, dos electrolíticamente (NaOH) afilado de electrodos de tungsteno se utilizan. Un alambre de tungsteno, o un tercer electrodo fabricado electrolíticamente se usa como base. Los electrodos de estimulación y el suelo está preparado y unido a la micromanipuladores antes del inicio de la sesión experimental y no necesitan ser sustituidos por la duración de la sesión. </li></ol> 2. Preparación de la D. melanogaster <ol><li> Una vez que su equipo está configurado, es el momento de preparar las moscas. Anestesiar a las moscas por el enfriamiento de hielo sobre ellos o mediante el uso de CO 2. Si el CO 2 es utilizado, entonces el tiempo suficiente (unos 20 minutos) para los efectos del gas a desaparecer antes de comenzar el experimento. </li><li> El uso de fórceps para la transferencia de las moscas suavemente por sus piernas a un plato que contiene una plataforma de cera pendiente suave en un ángulo de aproximadamente 45 °. Los siguientes cuatro pasos se realizan bajo un microscopio de disección lejos (pero cerca de) el equipo de grabación. </li><li> El siguiente paso es asegurar la marcha de cera. Oriente el lado ventral volar hacia abajo, hacia arriba con su anterior frente a la pendiente. Con un par de pinzas finas, se extienden hacia afuera las piernas, en parejas, y empujarlos en la cera. </li><li> Familiarícese con la ubicación de los músculos que se registró a partir de: el músculo longitudinal dorsal, o DLM, y el músculo tergotrochanteral o TTM. Los sitios de fijación subcuticular de la DLMS se corresponden con la zona comprendida entre la línea media dorsal y la parte dorsal anterior cerdas (o setas). Los sitios de unión de TTM se encuentran el dorso de la parte posterior y anterior supra-alar cerdas. Asegurarse de que las alas no se obstruya el acceso a las fibras de DLM o TTM, mantener las alas hacia el exterior y &quot;pegar&quot; a la cera. </li><li> El uso de un buen par de pinzas, tire de la trompa hacia afuera con cuidado, y seguro que mediante la inmersión en la cera. Este es un paso crítico que requiere una cierta práctica, ya que la trompa es suave y se desprende fácilmente del resto de la cabeza. Si eso ocurre, deseche la marcha y empezar de nuevo. La falta de seguro de la cabeza de esta manera da lugar a problemas al insertar los electrodos de estimulación a través de los ojos. </li></ol> 3. La colocación de los electrodos <ol><li> Una vez que la mosca está anclada a la cera, la transferencia de la fuente con la marcha unida bajo el microscopio estereoscópico que se encuentra dentro de la jaula de Faraday. Orientar la marcha hacia un lado con la cabeza de la mosca a la derecha del experimentador. </li><li> El siguiente paso es insertar los electrodos. Electrodos de tierra y estimulante puede ser insertado sin mirar por el microscopio. Buenas grabaciones se basan en el empalamiento precisa, por lo que es una buena idea a la práctica el manejo del micromanipulador. Lleve los electrodos cerca de los sitios de inserción con la ayuda de micromanipulador para facilitar su adecuada colocación y grabaciones posteriores. </li><li> Baje el electrodo de tierra en el extremo posterior del abdomen mediante las ruedas de ajuste en el micromanipulador. Para colocar los electrodos de tungsteno afilada estimulante en el cerebro, el uso del micromanipulador a la posición de la punta de uno de los electrodos por lo que sólo toca uno de los ojos de mosca. Haga lo mismo con el otro para los dos electrodos son sólo tocar la parte exterior de cada ojo. A continuación, pulse los electrodos, a su vez, a través de cada ojo para que las puntas de los electrodos de llegar al cerebro situada en la parte posterior de la cápsula de la cabeza (alrededor de 2 a 3 mm). </li><li> Electrodos colocados correctamente se activará el sistema de fibra gigante. Para probar que los electrodos de estimulación se colocan correctamente, aplique un poco (0,03 ms) Estímulo de 30 a 60 V a través de los electrodos de estimulación, y buscar el movimiento de las alas y espasmos de los músculos de vuelo / la pierna &quot; </li><li> El siguiente paso es hacer una copia de llenar los microelectrodos de vidrio con KCl 3M con un Hamilton o el calor-sacó una jeringa de plástico, y los situará en el micromanipulador de control fino. Microelectrodos insertado correctamente puede ser utilizado para varias series de experimentos. </li><li> La primera grabación de electrodos se inserta en una fibra de DLM. Hay dos DLMS bilateralmente simétricas, cada una se compone de seis fibras musculares individuales. Las grabaciones se puede hacer desde cualquiera de los seis fibras, sin embargo, las más utilizadas son las fibras de DLM 45 bis y debido a su buena accesibilidad a través de la cara dorsal de la cutícula dorsal 45 B, y el hecho de que tanto las fibras están inervadas por el mismo motorneuron . </li><li> Utilizando el micromanipulador en el lado más alejado de usted, insertar un electrodo de registro en fibra de DLM 45 bis o b. La pendiente de la plataforma permite que el electrodo DLM para entrar en la cutícula dorsal en un ángulo de ~ 60 a 90, que ayuda a la penetración. Utilizar el software en modo osciloscopio y mirar el monitor de la computadora mientras que la inserción de electrodos de registro en el tórax. Cuando el electrodo ha entrado en un músculo de la línea de base se reducirá a cerca de cero o un valor negativo. Prueba con un único estímulo para ver si se puede observar la respuesta muscular. </li><li> Inserte el electrodo de grabación en la TTM más cercana a usted. Este electrodo se introduce lateralmente, en frente de usted, debido a la ubicación del sitio de unión del músculo. Una vez más observe el monitor mientras se hace esto y se prueba con un único estímulo una vez que la traza indica el electrodo se encuentra en el músculo. </li></ol> 4. Estimulación y registro <ol><li> Ahora está listo para comenzar a estimular el cerebro y registrar las respuestas de la pierna y los músculos de vuelo. Aplicar un corto (0,03 m) de estímulo a través de los electrodos de estimulación a partir de 30 V y el aumento de 60 V hasta que se observe una respuesta (es decir, una contracción muscular, y una despolarización de las células musculares como se observa en el monitor de la computadora). Para el resto del experimento, establecer el voltaje de 5.10 V por encima del umbral de respuesta. </li><li> Para medir la latencia de respuesta, con un mínimo de 5 estímulos individuales con un período de descanso de 5 segundos entre cada estímulo. </li><li> Determinar la &quot;frecuencia de la siguiente&quot; mediante trenes de estímulos a diferentes velocidades. Suele ser de 10 trenes de 10 estímulos se dan a 100 Hz (10 ms entre cada estímulo), 200Hz (5 ms entre cada estímulo) y 300Hz (3 ms entre cada estímulo). Permitir un período de descanso de 2 segundos entre cada tren de estímulos. </li></ol> 5. Resultados: las latencias de respuesta de frecuencia y de continuación en el Camino de fibra gigante <ol><li> La latencia de respuesta es el tiempo entre la estimulación del cerebro y la despolarización del músculo. Esta cifra se compara las latencias de respuesta de DLM y TTM a un único estímulo. Latencias entre 0.7 y 1.2 ms para la vía de GF-TTM y entre el 1,3 y 1,7 ms para la vía de GF-DLM indican una preparación saludable y de la técnica de grabación adecuado. Las latencias puede variar con el genotipo, los antecedentes genéticos, la temperatura y la edad. Figura 1 (A y B). Representante huellas que muestran las respuestas registradas en el TTMs DLMS y después de un estímulo único a nivel del cerebro. </li><li> Como se muestra aquí, las grabaciones de la TTM muestran una mayor variabilidad en términos de amplitud y la forma del potencial postsináptico (PSP) en comparación con los de las fibras de DLM grandes, lo que la mayor variabilidad se debe al pequeño tamaño de las fibras musculares TTM. Esta variabilidad, sin embargo, no afecta a los valores de latencia de respuesta para el gigante de fibra-a-TTM vía. Figura 1 (C y D). Más información &quot;latencia de respuesta&quot; huellas de cuatro moscas individuales, tanto para el TTM y DLM. Tenga en cuenta la variabilidad TTM presentan huellas en forma de PSP, pero la latencia de respuesta se ve afectada. Para DLM hay menos variabilidad en la forma de PSP. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="Figura 1-D" /> </li><li> Comparar la &quot;frecuencia de las siguientes&quot; a 100 Hz, 200 Hz y 300 Hz mediante el cálculo de la proporción de respuestas exitosas (de 10), tanto para DLM y las vías de TTM en cada frecuencia de estimulación. A 100 Hz, tanto TTM y DLM seguir las 01:01 estímulos. En las frecuencias de estimulación por encima de 100 Hz, las respuestas DLM comienzan a mostrar fallas porque la sinapsis química intermediario entre dos interneuronas no tiene suficiente tiempo para recuperarse entre los estímulos. Las respuestas de TTM, sin embargo, siguen siendo de 1:1 con estímulos incluso más allá de 300Hz. Figura 2. Huellas Representante mostrar la &quot;frecuencia de seguir&quot; las grabaciones. A 100 Hz, tanto TTMs DLMS y responder a los 10 estímulos (izquierda). A 200Hz, las respuestas DLM empiezan a fallar (asterisco). <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Figura 2"> </li></ol> 6. Resultados representante De tipo salvaje de corta latencia respuestas (electrodos estimulados se colocan en los ojos, por encima de los receptores sensoriales y la activación del circuito de GF directamente) depende del genotipo, los antecedentes genéticos, la temperatura y la edad, y oscilan entre 0,7 y 1,2 ms para la vía de GF-TTM y 1,3 ms and1.7 de la vía GF-DLM (Tanouye y Wyman, 1980; Thomas y Wyman, 1984; Engel y Wu, 1992; Allen y Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, inédito). . Esta latencia TTM muy corto se debe a la fuerte sinapsis GF-TTMn electroquímica de la vía monosináptico y la latencia ya DLM se produce debido a la naturaleza disynaptic de la vía, así como la presencia de una sinapsis química (PSI-DLMn). Intermedia y larga latencia respuestas (&gt; 3 m) el resultado de la activación de los aferentes GF y se consiguen ya sea mediante la estimulación de baja intensidad o la prestación de un control visual (&quot;light-off&quot;) de la señal. A 100 Hz, tanto TTM y DLM debe seguir las 01:01 estímulos. Por encima de 100Hz respuestas DLM comenzará a mostrar fallos en la sinapsis química entre el PSI y el DLMns no tiene suficiente tiempo para recuperarse entre los estímulos a menos de 10 milisegundos de diferencia. TTM respuestas, sin embargo, seguirá siendo de 1:1 con estímulos incluso más allá de 300Hz (Tanouye y Wyman, 1980; Engel y Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martínez et al, 2007). Las mutaciones en el gen shakB, que codifica una Drosophila brecha cruce del canal (&quot;innexin&quot;), aumenta significativamente la latencia de respuesta de la vía de GF-TTM (alrededor de 1,5 ms), mientras que la rama de GF-DLM no responde (Allen y Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). La respuesta mutante puede ser restaurada mediante la estimulación de los ganglios torácicos directamente, lo que demuestra que el efecto de retraso no se debe a la transmisión neuromuscular alterado. La capacidad de seguir la estimulación de alta frecuencia se ve afectada también en estos mutantes en comparación con las moscas de tipo salvaje, donde las vías de GF-DLM y GF TTM-suelen ser capaces de seguir 10 estímulos con una relación 1:1 hasta 100 Hz y 300 Hz, respectivamente. Es importante señalar que estas frecuencias están muy por encima de las frecuencias de estimulación normal recibidas por la contracción muscular durante el vuelo sostenido (3-10 Hz) (Hummon y Costello, 1989). Otro parámetro utilizado para describir el comportamiento de las salidas del GFS es el &quot;período refractario&quot;, o el mínimo de tiempo entre los pulsos de estímulo gemelas que todavía produce dos respuestas de los músculos. El período refractario varía entre 1.4 ms para TTMs y 15.7 ms para DLMS. El período refractario relativamente largo para DLMS se debe a la relativamente lábil sinapsis químicas en el cruce de PSI-DLMn (Tanouye y Wyman, 1980; Gorczyca y Hall, 1984; Engel y Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen y Godenschwege, 2010).

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	<li>Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Drosophila+Giant+Fiber+System.">Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System.</a> Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual. , (2010).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter.">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li><li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila.">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li><li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila.">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li><li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis.">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li><li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila:+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers.">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li><li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila:+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target.">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li><li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway.">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li><li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila.">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li><li>Miller, A., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 502-503 (1965).</li><li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system.">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li><li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect,+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila.">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li><li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila.">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li></ol>

Una de las cosas más importantes que hay que prestar atención a la hora de obtener grabaciones de alta calidad es la orientación adecuada y la salud de la preparación. Idealmente, la mosca debe seguir con vida al final de la sesión de grabación y responder a estímulos eléctricos. Para los electrodos de registro de manera más eficiente penetrar en el exoesqueleto torácico, la mosca se debe pegar a la superficie de tal manera que forman un ángulo recto con los electrodos, si es necesario, la inserción de los electrodos puede ser facilitado mediante la eliminación de una parte de la cutícula dorsal torácica con un bisturí de tungsteno lo que expone el músculo de vuelo DLM (este paso ofrece una ventaja adicional de hacer más difícil para las puntas de los electrodos de vidrio se rompa). Además, el debe tener cuidado para evitar pulsar los electrodos a través de la DLMS subcuticular encuentra y TTMs. La cabeza de la mosca debe estar bien asegurado para permitir la electrodos de estimulación que se ha insertado correctamente en el cerebro y para evitar que se salga durante la sesión de grabación. Debido a su tamaño y morfología, así descrita, la EFP representa una de las vías neuronales más accesible en la Drosophila. La permeabilidad de las sinapsis eléctricas a los pequeños tintes de peso molecular marcador permite la visualización de neuronas acopladas eléctricamente, y varias líneas GAL4 disponibles permiten manipular los niveles de expresión génica en un subgrupo de células o grupos de células (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) Además de las ventajas antes mencionadas, los dos componentes aferentes y torácica de las propiedades del circuito de pantalla, como la habituación, la recuperación espontánea y deshabituación, haciendo que el GFS Drosophila un modelo de sistema conveniente para el estudio de la plasticidad neuronal (Engel y Wu, , 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> NOMBRE </td><td> EMPRESA </td><td> CAT. # </td><td> COMENTARIOS </td></tr><tr><td> S48 Plaza de estimulador de impulsos </td><td> Grass Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> Estimulación unidad </td><td> Grass Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RF unidad de aislamiento del transformador </td><td> Grass Instruments </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A de dos canales del amplificador de microelectrodos intracelulares </td><td> Obtención de Instrumentos </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A sistema de adquisición de datos </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Analógico-digital Digidata 1320 y el software Axoscope 9.0 </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Grabación manual de plataforma con micromanipulador </td><td> Narishige, Sutter Ins., Ins World Precision. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Fuente de luz </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> Salvaje M5 estereomicroscopio </td><td> Salvaje Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> Vibraciones mesa aislamiento </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> Tubos de borosilicato de microelectrodos </td><td> Sutter Instrumento </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P-95 Micropipeta extractor </td><td> Sutter Instrumento </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil 34 calibre 67 mm (de relleno del electrodo) </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> MF34G-5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Herramientas de microdisección (pinzas, ...) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> Disección (estéreo) microscopio </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> Jaula de Faraday </td><td> Fabricante desconocido </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Otros: jeringas de plástico, cable de tierra de tungsteno y NaOH afilado de electrodos de tungsteno, KCl, la plataforma de cera, una PC con monitor ...

electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. melanogaster

Cuando se asustan adultos de D. melanogaster reaccionar saltando en el aire y volando. En muchas especies de invertebrados, entre ellos D. melanogaster, el &quot;escape&quot; (o &quot;susto&quot;) la respuesta en la etapa adulta es mediado por el circuito neuronal multi-componente llamado el sistema de fibra gigante (GFS). El tamaño relativo grande de las neuronas, su morfología distintiva y una conectividad sencilla que el GFS un sistema atractivo modelo para el estudio de circuitos neuronales. La vía de las EFP se compone de dos simetría bilateral gigante de fibra (FC) interneuronas cuyos axones descienden del cerebro a lo largo de la línea media en el ganglio torácico a través de la conectivo del cuello uterino. En el neuromere mesothoracic (T2) de los ganglios ventrales la forma FC electro-químicas sinapsis con 1) la dendrita gran medial de la motorneuron ipsilateral (TTMn) que impulsa el músculo tergotrochanteral (TTM), el principal extensor de fémur mesothoracic / pierna , y 2) la contralateral interneurona periférica sinapsis (PSI), que a su vez en forma química (colinérgico) sinapsis con las motoneuronas (DLMns) de los músculos dorsales longitudinales (DLMS), los depresores del ala. La vía neuronal (s) a los músculos dorsovental (DVMS), los ascensores del ala, todavía no se ha resuelto (la DLMS y veterinarios son conocidos conjuntamente como los músculos de vuelo indirecto - que no están vinculados directamente a las alas, sino que se mueven los alas indirectamente al distorsionar la cutícula dorsal cercana) (King y Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). La activación de di-sináptica de la DLMS (a través de PSI) provoca un pequeño retraso, pero importante, en el momento de la contracción de estos músculos en relación con la activación monosináptico de TTM (~ 0,5 ms), que permite la TTMs extender primero el fémur y en impulsar la volar fuera de la tierra. El TTMs al mismo tiempo se extienden a activar el DLMS que a su vez entre sí se extienden a activar el vóltmetros digitales para la duración del vuelo. La vía de GF puede ser activado ya sea indirectamente mediante la aplicación de una experiencia sensorial (por ejemplo, &quot;soplo de aire&quot; o &quot;luces-off&quot;) de estímulo, o directamente por un estímulo supra-umbral eléctrica en el cerebro (que se describe aquí). En ambos casos, un potencial de acción llega a la TTMs DLMS y exclusivamente a través de la FC, PSI, y motoneuronas TTM / DLM, aunque el TTMns y DLMns tienen otros, aún no identificado, los estímulos sensoriales. Medir &quot;la respuesta de latencia&quot; (el tiempo entre el estímulo y la despolarización del músculo) y el &quot;después de la estimulación de alta frecuencia&quot; (el número de respuestas exitosas a un cierto número de estímulos de alta frecuencia) proporciona una forma de evaluar de forma reproducible y cuantitativamente el estado funcional de los componentes EFP, incluyendo tanto las sinapsis central (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) y la química (glutamatérgicas) las uniones neuromusculares (TTMn-TTM y DLMn DLM-). Se ha utilizado para identificar los genes implicados en la formación de sinapsis central y para evaluar la función del SNC.

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Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

El sistema de fibra gigante es un circuito simple neuronal de los adultos<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Que contiene la mayor neuronas de la mosca. Se describe el protocolo para la supervisión de la transmisión sináptica a través de esta vía mediante el registro de los potenciales postsinápticos en el dorsal longitudinal (DLM) y los músculos tergotrochanteral (TTM) después de la estimulación directa de las interneuronas de fibra gigante.

Registros electrofisiológicos de la ruta de fibra gigante de D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

14.5K vistas.  University College London - UCL. El sistema de fibra gigante es un circuito simple neuronal de los adultos Drosophila melanogaster Que contiene la mayor neuronas de la mosca. Se describe el protocolo para la supervisión de la transmisión sináptica a través de esta vía mediante el registro de los potenciales postsinápticos en el dorsal longitudinal (DLM) y los músculos tergotrochanteral (TTM) después de la estimulación directa de las interneuronas de fibra gigante.

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection parejas y Ensayo de electrofisiología para la detección de bioactividad de compuestos utilizando el Drosophila melanogaster Sistema de fibra gigante

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultánea pre-y post-sináptica de registro electrofisiológico<em&gt; Xenopus</em&gt; Músculo Nervio-Co-culturas

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic targeting for microcircuit dissection and disease modeling. The introduction of optogenetics, for example, has allowed for bidirectional manipulation of genetically-identified neurons, at an unprecedented temporal resolution. To capitalize on these tools and gain insight into dynamic interactions among brain microcircuits, it is essential that one has the ability to record from ensembles of neurons deep within the brain of this small rodent, in both head-fixed and freely behaving preparations. To record from deep structures and distinct cell layers requires a preparation that allows precise advancement of electrodes towards desired brain regions. To record neural ensembles, it is necessary that each electrode be independently movable, allowing the experimenter to resolve individual cells while leaving neighboring electrodes undisturbed. To do both in a freely behaving mouse requires an electrode drive that is lightweight, resilient, and highly customizable for targeting specific brain structures.
A technique for designing and fabricating miniature, ultralight weight, microdrive electrode arrays that are individually customizable and easily assembled from commercially available parts is presented. These devices are easily scalable and can be customized to the structure being targeted; it has been used successfully to record from thalamic and cortical regions in a freely behaving animal during natural behavior.

Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.

Diseño y fabricación de Ultralight Peso, ajustables Sondas Multi-electrodos para electrofisiológicos grabaciones en ratones

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

La visualización directa de la murino Dorsal coclear Núcleo de optogenética La estimulación de la vía auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos<em&gt; En Vivo</em&gt; registros intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using 'SpikeSorter'

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be user friendly with a graphical user interface, able to read data files in a variety of formats, and provide users with a flexible set of tools giving them the ability to detect and sort extracellular voltage waveforms from different units with some degree of reliability. Previously published spike sorting methods are now available in a software program, SpikeSorter, intended to provide electrophysiologists with a complete set of tools for sorting, starting from raw recorded data file and ending with the export of sorted spikes times. Procedures are automated to the extent this is currently possible. The article explains and illustrates the use of the program. A representative data file is opened, extracellular traces are filtered, events are detected and then clustered. A number of problems that commonly occur during sorting are illustrated, including the artefactual over-splitting of units due to the tendency of some units to fire spikes in pairs where the second spike is significantly smaller than the first, and over-splitting caused by slow variation in spike height over time encountered in some units. The accuracy of SpikeSorter's performance has been tested with surrogate ground truth data and found to be comparable to that of other algorithms in current development.

The article shows how to use the program SpikeSorter to detect and sort spikes in extracellular recordings made with multi-electrode arrays.

Una Guía Visual de Ordenación de Registros electrofisiológicos El uso de &#39;SpikeSorter&#39;

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...