Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust uma subvenção para LP

1. Equipamentos e Materiais <ol><li> Estas experiências usam uma configuração padrão de eletrofisiologia composto por um estimulador, uma unidade de isolamento de estímulo, dois amplificadores de microeletrodos, um sistema de aquisição de dados e um computador com software de coleta. Equipamento adicional inclui uma gaiola de Faraday, um estereomicroscópio em um suporte de boom, uma mesa de isolamento de vibração, uma fonte de luz, e uma plataforma de gravação. </li><li> Cinco micromanipuladores são usados. Dois micromanipuladores exigem controles finos para posicionar os eletrodos de gravação, enquanto os outros três micromanipuladores só exigem controles bruta para posicionar os dois eletrodos de estimulação eo eletrodo terra. O micromanipulador para o eletrodo de registro DLM é colocado no fim da cauda da preparação (à esquerda do experimentador) eo micromanipulador para o eletrodo de registro TTM é colocado entre o pesquisador eo lado da preparação (um pouco à esquerda do experimentador). Os dois micromanipuladores que irá manter os eletrodos são colocados simulação na cabeça da preparação (direito de pesquisador). O micromanipulador para o eletrodo terra é colocado no lado mais distante da preparação </li><li> Puxe microeletrodos de gravação de vidro com resistências de 40-60 mohms e armazenar apartamento em um prato apoiado por cera. Para a estimulação, dois eletrodos de tungstênio eletroliticamente (NaOH) afiadas são usadas. Um fio de tungstênio, ou um terceiro eletrodo eletroliticamente fabricada é usada como um terreno. Os eletrodos estimulantes e solo são preparados e anexado ao micromanipuladores antes do início da sessão experimental e não precisa ser substituído para a duração da sessão. </li></ol> 2. Preparando o D. melanogaster <ol><li> Uma vez que seu equipamento está configurado, é hora de preparar as moscas. Anestesiar as moscas de resfriamento de gelo sobre eles ou usando CO 2. Se o CO 2 é usado, então que haja tempo suficiente (cerca de 20 minutos) para os efeitos do gás a desgastar antes do início do experimento. </li><li> Use uma pinça para transferir as moscas suavemente as pernas para um prato contendo uma plataforma de cera macia inclinada em um ângulo de aproximadamente 45 °. As próximas quatro etapas são feitas sob um microscópio de dissecação longe (mas perto), o equipamento de gravação. </li><li> O próximo passo é garantir a voar em cera. Orientar o lado ventral voar baixo, com a sua anterior cima enfrentando na encosta. Usando uma pinça fina, estender para fora das pernas, em pares, e empurrá-los para a cera. </li><li> Familiarize-se com a localização dos músculos para ser gravado a partir de: o músculo dorsal longitudinal, ou DLM, eo músculo tergotrochanteral, ou TTM. Os locais de fixação subcuticular da DLMS corresponder com a região entre a linha média dorsal do tórax e do anterior cerdas (ou cerdas). Os locais de fixação TTM estão localizados dorsalmente do posterior e anterior supra-alar cerdas. Certificando-se que as asas não obstrua o acesso ao DLM fibras ou TTM, mantenha as asas para fora e &quot;cola&quot;-los para a cera. </li><li> Usando um belo par de fórceps, puxar a tromba para fora com cuidado, e segura-lo por imersão na cera. Este é um passo crítico que requer alguma prática desde a tromba é macio e é facilmente retirado do resto da cabeça. Se isso acontecer, descarte a voar e começar de novo. Incapacidade de proteger a cabeça desta forma leva a problemas ao inserir os eletrodos estimulando através dos olhos. </li></ol> 3. Colocação dos eletrodos <ol><li> Uma vez que o fly está ancorada a cera, a transferência do prato com a mosca anexado abaixo do estereomicroscópio que está localizado dentro da gaiola de Faraday. Orientar a voar para os lados com a cabeça da mosca para a direita do experimentador. </li><li> O próximo passo é inserir os eletrodos. Eléctrodos de massa e estimulante pode ser inserido sem olhar através do microscópio. Boas gravações contam com empalamento precisas, por isso é uma boa idéia para a prática de manipulação do micromanipuladores. Traga os eletrodos perto dos locais de inserção com a ajuda de micromanipuladores para facilitar sua colocação adequada e gravações subseqüentes. </li><li> Abaixe o eletrodo terra na extremidade posterior do abdome utilizando as rodas de ajuste no micromanipulador. Para colocar os eletrodos de tungstênio afiadas estimulante no cérebro, use o micromanipulador para posicionar a ponta de um dos eletrodos de modo que só toca um dos olhos de mosca. Faça o mesmo com o outro para que ambos os eletrodos são apenas tocar a parte externa de cada olho. Em seguida, empurre os eletrodos, por sua vez, através de cada olho para as pontas dos eletrodos chegar ao cérebro situada na parte de trás da cápsula cefálica (cerca de 2-3mm). </li><li> Eletrodos colocados corretamente irá ativar o sistema de fibra Giant. Para testar se os eletrodos são colocados estimulando corretamente, aplique uma pequena (0,03 ms) Estímulo de 30-60 V entre os eletrodos estimulantes, e olhar para o movimento das asas e contrações do músculo do vôo / perna &quot; </li><li> O próximo passo é preencher o back-microeletrodos de vidro com 3M KCl usando um Hamilton ou calor puxados seringa de plástico e coloque-os na micromanipuladores fine-controle. Microeletrodos inserido corretamente pode ser usado para várias rodadas de experimentos. </li><li> O eletrodo primeira gravação será inserido em uma fibra DLM. Há dois DLMS bilateralmente simétrica, cada um é composto de seis fibras musculares individuais. As gravações podem ser feitas a partir de qualquer uma das seis fibras, no entanto, os mais comumente utilizados são as fibras DLM 45a e 45b, devido à sua boa acessibilidade através do lado dorsal da cutícula torácica, eo fato de que ambas as fibras são inervadas pelo mesmo motorneuron . </li><li> Usando o micromanipulador no lado mais distante de você, inserir um eletrodo de registro em DLM fibra 45a ou b. A inclinação da plataforma permite que o eletrodo de DLM para entrar na cutícula dorsal em um ângulo de ~ 60-90, o que ajuda a penetração. Usar o software em modo osciloscópio e olhar para o monitor do computador ao inserir eletrodos de registro no tórax. Quando o eletrodo entrou um músculo da linha de base vai cair para perto de zero ou um valor negativo. Teste com um único estímulo para ver se você pode observar a resposta muscular. </li><li> Insira o eletrodo outra gravação para a TTM mais próximo de você. Este eletrodo é inserido lateralmente, na frente de você, devido à localização do local de ligação do músculo. Mais uma vez observar o monitor enquanto faz isso e teste com um único estímulo, uma vez o traço indica o eletrodo é no músculo. </li></ol> 4. Estimulação e gravação <ol><li> Agora você está pronto para começar a estimular o cérebro e as respostas de gravação da perna e músculos de vôo. Aplicar um estímulo (0,03 ms) curto através dos eletrodos estimulando a partir de 30 V e aumentando para 60 V até que você observe uma resposta (ou seja, uma contração muscular, e uma despolarização das células musculares como observado no monitor do computador). Para o restante do experimento, definir a tensão V 10/05 acima do limiar de resposta. </li><li> Para medir a latência de resposta, dar pelo menos 5 estímulos único com um período de repouso de 5 segundos entre cada estímulo. </li><li> Determinar a &quot;freqüência de seguir&quot;, fornecendo trens de estímulos em diferentes taxas. Tipicamente de 10 trens de 10 estímulos são dados a 100Hz (10ms entre cada estímulo), 200Hz (5 ms entre cada estímulo) e 300Hz (3 ms entre cada estímulo). Permitir um período de descanso de 2 segundos entre cada trem de estímulos. </li></ol> 5. Resultados: As latências de resposta e de freqüência de seguir o Caminho de fibra gigante <ol><li> A latência de resposta é o tempo entre a estimulação do cérebro e despolarização do músculo. Este valor compara as latências de resposta para DLM e TTM a um único estímulo. Latências entre 0,7 e 1,2 ms para a via GF-TTM e entre 1,3 e 1,7 ms para a via GF-DLM indicam uma preparação saudável e adequada técnica de gravação. As latências podem variar com o genótipo, antecedentes genéticos, temperatura e idade. Figura 1 (A e B). Representante traços mostrando as respostas registradas da TTMs e DLMS seguir um único estímulo aplicados ao cérebro. </li><li> Como mostrado aqui, as gravações da TTM mostram maior variabilidade em termos de amplitude e forma do potencial pós-sináptico (PSP) em relação aos das fibras DLM grande; esta variabilidade maior é devido ao pequeno tamanho das fibras musculares TTM. Esta variabilidade, entretanto, não afeta os valores de latência de resposta para a via Fiber-to-TTM Giant. Traços figura 1 (C e D). Adicional &#39;latência de resposta &quot;de 4 moscas individuais, tanto para a TTM e DLM. Nota TTM variabilidade exibem traços em forma PSP, mas latência de resposta não é afetada. Para DLM há menor variabilidade na forma PSP. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="A figura 1-D" /> </li><li> Compare a &quot;freqüência de seguir&quot; a 100 Hz, 200 Hz e 300 Hz, calculando a proporção de respostas bem sucedidas (de 10) para ambos os DLM e vias TTM em cada freqüência de estimulação. A 100 Hz, tanto TTM e DLM siga as 01:01 estímulos. Em freqüências de estimulação acima de 100 Hz, as respostas DLM começar a mostrar falhas porque a sinapse química intermediária entre dois interneurônios não tem tempo suficiente para recuperar entre estímulos. As respostas TTM, no entanto, permanecem 1:1 com estímulos até mesmo além 300Hz. Figura 2. Vestígios Representante mostrando a &quot;freqüência de seguir&quot; as gravações. A 100 Hz, tanto TTMs DLMS e responder a todos os 10 estímulos (esquerda). A 200Hz, as respostas DLM começam a falhar (asterisco). <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="Figura 2"> </li></ol> 6. Resultados representante Tipo selvagem de latência curta-respostas (eletrodos estimulados são colocados nos olhos, ignorando receptores sensoriais e desencadeando o circuito GF diretamente) dependem do genótipo, antecedentes genéticos, temperatura e idade, e variam entre 0,7 e 1,2 ms para a via GF-TTM e 1,3 and1.7 ms para a via GF-DLM (Tanouye e Wyman, 1980; Thomas e Wyman, 1984; Engel e Wu, 1992; Allen e Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, não publicado.) . Esta latência TTM é muito curto devido ao robusto GF-TTMn eletroquímica sinapse da via monossináptico ea latência mais DLM ocorre devido à natureza disynaptic da via, bem como a presença de uma sinapse química (PSI-DLMn). Intermediária e longa latência de respostas resultado (&gt; 3 ms) a partir da ativação dos aferentes GF e são alcançados pelo uso de um estímulo menor intensidade ou o fornecimento de um sinal (&quot;light-off&quot;) visual. A 100Hz tanto TTM e DLM deve seguir as 1:01 estímulos. Acima de 100 Hz respostas DLM vai começar a mostrar falhas como a sinapse química entre PSI eo DLMns não tem tempo suficiente para recuperar entre estímulos menos de 10ms separados. TTM respostas, no entanto, permanecerá 1:1 com estímulos até mesmo além 300Hz (Tanouye e Wyman, 1980; Engel e Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Mutações no gene shakB, que codifica uma diferença Drosophila junção canal (&quot;innexin&quot;), aumentar significativamente a latência de resposta da via GF-TTM (~ 1,5 ms), enquanto o ramo GF-DLM não responde (Allen e Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). A resposta mutante pode ser restaurado, estimulando diretamente gânglios torácicos, demonstrando que o efeito retardado não é devido a interrupção da transmissão neuromuscular. A capacidade de acompanhar a estimulação de alta freqüência também é prejudicada nestes mutantes em relação ao tipo selvagem voa onde os caminhos GF-DLM e GF-TTM são geralmente capaz de seguir 10 estímulos com relação 1:1 até 100 Hz e 300 Hz, respectivamente. É importante notar que essas freqüências estão consideravelmente acima freqüências de estimulação normais recebidos pelos músculos durante o vôo contratação sustentada (10/03 Hz) (Hummon e Costello, 1989). Outro parâmetro utilizado para descrever a estabilidade das saídas GFS é o &quot;período refratário&quot;, ou o tempo mínimo entre os pulsos de estímulo gêmeas que ainda produz duas respostas do músculo. O tempo refratário varia entre 1-4 ms para TTMs e 7-15 ms para DLMS. O período relativamente longo refratários para DLMS é devido ao relativamente lábil sinapses químicas na junção PSI-DLMn (Tanouye e Wyman, 1980; Gorczyca e Hall, 1984; Engel e Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen e Godenschwege, 2010).

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	<li>Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Drosophila+Giant+Fiber+System.">Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System.</a> Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual. , (2010).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter.">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li><li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila.">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li><li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila.">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li><li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis.">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li><li>Hummon, M. R., Costello, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+fiber+activation+of+flight+muscles+in+Drosophila:+asynchrony+in+latency+of+wing+depressor+fibers.">Giant fiber activation of flight muscles in Drosophila: asynchrony in latency of wing depressor fibers.</a> J Neurobiol. 20, 593-602 (1989).</li><li>Jacobs, K., Todman, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptogenesis+in+the+giant-fibre+system+of+Drosophila:+interaction+of+the+giant+fibre+and+its+major+motorneuronal+target.">Synaptogenesis in the giant-fibre system of Drosophila: interaction of the giant fibre and its major motorneuronal target.</a> Development. 127, 5203-5212 (2000).</li><li>King, D. G., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+giant+fibre+pathway+in+Drosophila.+I.+Three+thoracic+components+of+the+pathway.">Anatomy of the giant fibre pathway in Drosophila. I. Three thoracic components of the pathway.</a> J Neurocytol. 9, 753-770 (1980).</li><li>Martinez, V. G., Javadi, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+climbing+behavior+and+neural+circuit+physiology+in+Drosophila.">Age-related changes in climbing behavior and neural circuit physiology in Drosophila.</a> Dev Neurobiol. 67, 778-791 (2007).</li><li>Miller, A., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 502-503 (1965).</li><li>Phelan, P., Goulding, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system.">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li><li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect,+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila.">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li><li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila.">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma das coisas mais importantes que é preciso prestar atenção quando tentando obter gravações de alta qualidade é a orientação correta e de saúde da preparação. Idealmente, a mosca ainda deve estar vivo no final da sessão de gravação e responsivo aos estímulos elétricos. Para os eletrodos de gravação para penetrar de forma mais eficiente o exoesqueleto torácica, a mosca deve ser colado à superfície de modo a formar um ângulo reto com os eletrodos, se necessário, a inserção dos eletrodos pode ser facilitado através da remoção de uma parte da cutícula torácica dorsal com um bisturi de tungstênio expondo assim o músculo de vôo DLM (este passo oferece uma vantagem adicional de tornar mais difícil para as pontas dos eletrodos de vidro para quebrar). Além disso, o cuidado deve ser tomado para evitar empurrar os eletrodos através do DLMS subcuticularly localizado e TTMs. A cabeça da mosca devem ser bem protegidos para permitir a eletrodos estimulantes para ser devidamente inserido no cérebro e para impedi-los de que está sendo retirado durante a sessão de gravação. Devido ao seu tamanho e bem descrita a morfologia, o GFS representa uma das vias mais acessíveis neuronal em Drosophila. A permeabilidade das sinapses elétricas a pequenas corantes marcador molecular de peso permite a visualização de neurônios eletricamente acopladas, e várias linhas disponíveis GAL4 torná-lo possível manipular os níveis de expressão de genes em um subconjunto de células ou grupos de células (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) Além das vantagens acima mencionadas, ambos os componentes aferentes e torácica das propriedades do circuito de exibição, como recuperação de habituação, espontânea e dishabituation, tornando o GFS Drosophila um sistema modelo conveniente para o estudo da plasticidade neuronal (Engel e Wu, , 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> NOME </td><td> EMPRESA </td><td> CAT. # </td><td> COMENTÁRIOS </td></tr><tr><td> S48 Praça Pulso Stimulator </td><td> Instrumentos grama </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> Unidade de estimulação </td><td> Instrumentos grama </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RF Unidade Transformador de isolamento </td><td> Instrumentos grama </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A dois canais Amplificador microeletrodos intracelulares </td><td> Ficando Instruments </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A sistema de aquisição de dados </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Analógico-digital Digidata 1320 e 9,0 Axoscope software </td><td> Os dispositivos moleculares </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> Plataforma de gravação com micromanipuladores manuais </td><td> Narishige, Sutter Ins., World Ins Precision. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Fonte de luz </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> Selvagens estereomicroscópio M5 </td><td> Selvagens Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> Mesa de isolamento de vibração </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> Tubos de borosilicato para microeletrodos </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P-95 Micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil calibre 34, 67 mm (enchimento do eletrodo) </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> MF34G-5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Ferramentas de microdissecção (fórceps, ...) </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> Dissecando microscópio (estéreo) </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> Gaiola de Faraday </td><td> Fabricante desconhecido </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Outros: seringas de plástico, fio de terra de tungstênio e NaOH-sharpened eléctrodos de tungsténio, KCl, plataforma de cera, um PC com monitor ...

electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. melanogaster

Quando assustou adulto D. melanogaster reagir pulando no ar e voar para longe. Em muitas espécies de invertebrados, incluindo D. melanogaster, a resposta do &quot;escape&quot; (ou &quot;assustar&quot;) durante o estágio adulto é mediada pelo circuito multi-componente neuronal chamado Sistema Fibra Giant (GFS). O tamanho grande comparativa dos neurônios, sua morfologia distintiva e conectividade simples fazer o GFS um sistema modelo atraente para o estudo de circuitos neuronais. A via GFS é composta de dois gigantes bilateralmente simétricos de fibra (GF) interneurônios cujos axônios descem do cérebro ao longo da linha média para o gânglio torácico por meio do conectivo cervical. No neuromere mesothoracic (T2) dos gânglios ventral a forma FG electro-química sinapses com 1) os grandes dendrite medial do motorneuron ipsilateral (TTMn) que aciona o músculo tergotrochanteral (TTM), o principal extensor para o fêmur mesothoracic / perna e 2) a sinapse perifericamente interneurônio contralateral (PSI), que por sua vez em formas químicas (colinérgicos) sinapses com o motorneurons (DLMns) dos músculos dorsal longitudinal (DLMS), os depressores asa. A via neuronal (s) para os músculos dorsovental (DVMs), os elevadores asa, ainda não foi elaborada (o DLMS e DVMs são conhecidas conjuntamente como os músculos de vôo indiretos - não estão ligados diretamente para as asas, mas sim mover o asas indiretamente por cutícula distorcer a próxima torácica) (King e Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). A ativação di-sináptica da DLMS (via PSI) causa um atraso pequeno, mas importante no momento da contração desses músculos em relação à ativação monossináptico de TTM (~ 0,5 ms) permitindo que o TTMs primeiro estender o fêmur e impulsionar o voar fora da terra. O TTMs simultaneamente esticar-ativar o DLMS que por sua vez mutuamente estiramento ativar o DVMs para a duração do voo. O caminho GF pode ser ativado ou indiretamente pela aplicação de um estímulo sensorial (&quot;sopro de ar&quot; ou &quot;luzes&quot;, por exemplo), ou diretamente por um estímulo supra-limiar elétrico para o cérebro (descrito aqui). Em ambos os casos, um potencial de ação alcança o TTMs e DLMS unicamente através da FG, PSIs e TTM / DLM motoneurônios, embora o TTMns DLMns e têm outras, ainda não identificado, entradas sensoriais. Medição &quot;resposta de latência&quot; (o tempo entre o estímulo e despolarização do músculo) e &quot;a seguir para a estimulação de alta freqüência&quot; (o número de respostas de sucesso para um certo número de estímulos de alta freqüência) fornece uma maneira de reproduzível e quantitativamente avaliar o estado funcional dos componentes GFS, incluindo tanto as sinapses central (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) e química (glutamatérgico) junções neuromusculares (TTMn-TTM e DLMn-DLM). Ela tem sido usada para identificar genes envolvidos na formação de sinapses centrais e para avaliar a função do SNC.

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Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

O Sistema de Fibra gigante é um circuito neuronal simples de adulto<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Contendo os maiores neurônios na mosca. Nós descrevemos o protocolo para monitoramento da transmissão sináptica por essa via, registrando os potenciais pós-sinápticos na longitudinal dorsal (DLM) e (TTM) tergotrochanteral músculos após a estimulação direta dos interneurônios Fiber Giant.

As gravações eletrofisiológicas da via fibra Gigante da D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

electrophysiological-recordings-from-giant-fiber-pathway-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

14.4K visualizações.  University College London - UCL. O Sistema de Fibra gigante é um circuito neuronal simples de adulto Drosophila melanogaster Contendo os maiores neurônios na mosca. Nós descrevemos o protocolo para monitoramento da transmissão sináptica por essa via, registrando os potenciais pós-sinápticos na longitudinal dorsal (DLM) e (TTM) tergotrochanteral músculos após a estimulação direta dos interneurônios Fiber Giant.

Vídeo: Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

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The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

Nanoinjection emparelhado e Eletrofisiologia Ensaio para a tela de bioatividade dos compostos utilizando os Drosophila melanogaster Sistema Fibra Gigante

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic targeting for microcircuit dissection and disease modeling. The introduction of optogenetics, for example, has allowed for bidirectional manipulation of genetically-identified neurons, at an unprecedented temporal resolution. To capitalize on these tools and gain insight into dynamic interactions among brain microcircuits, it is essential that one has the ability to record from ensembles of neurons deep within the brain of this small rodent, in both head-fixed and freely behaving preparations. To record from deep structures and distinct cell layers requires a preparation that allows precise advancement of electrodes towards desired brain regions. To record neural ensembles, it is necessary that each electrode be independently movable, allowing the experimenter to resolve individual cells while leaving neighboring electrodes undisturbed. To do both in a freely behaving mouse requires an electrode drive that is lightweight, resilient, and highly customizable for targeting specific brain structures.
A technique for designing and fabricating miniature, ultralight weight, microdrive electrode arrays that are individually customizable and easily assembled from commercially available parts is presented. These devices are easily scalable and can be customized to the structure being targeted; it has been used successfully to record from thalamic and cortical regions in a freely behaving animal during natural behavior.

Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.

Projeto e fabricação de Ultraleve Peso, ajustável Sondas Multi-eletrodo para gravações eletrofisiológicas em Ratos

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using 'SpikeSorter'

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be user friendly with a graphical user interface, able to read data files in a variety of formats, and provide users with a flexible set of tools giving them the ability to detect and sort extracellular voltage waveforms from different units with some degree of reliability. Previously published spike sorting methods are now available in a software program, SpikeSorter, intended to provide electrophysiologists with a complete set of tools for sorting, starting from raw recorded data file and ending with the export of sorted spikes times. Procedures are automated to the extent this is currently possible. The article explains and illustrates the use of the program. A representative data file is opened, extracellular traces are filtered, events are detected and then clustered. A number of problems that commonly occur during sorting are illustrated, including the artefactual over-splitting of units due to the tendency of some units to fire spikes in pairs where the second spike is significantly smaller than the first, and over-splitting caused by slow variation in spike height over time encountered in some units. The accuracy of SpikeSorter's performance has been tested with surrogate ground truth data and found to be comparable to that of other algorithms in current development.

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using &#039;SpikeSorter&#039;

The article shows how to use the program SpikeSorter to detect and sort spikes in extracellular recordings made with multi-electrode arrays.

A Visual Guide to Classificando gravações eletrofisiológicas Usando &#39;SpikeSorter&#39;

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...