El presente estudio fueron apoyadas por los Estados Unidos Institutos Nacionales de Salud de subvención R01-HL092188, R01-DK083385 y R01HL098294, y la Fundación para la Educación e Investigación de la anestesia (FAER) Subvenciones a HKE, una subvención a la FAER JYD y una investigación de la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Fellowship (GR2121/1-1) a AG.

Observaciones generales. Todas las operaciones deberán realizarse bajo un microscopio vertical de disección (Leica) y utilizando un coagulador quirúrgico. Los ratones en los grupos experimentales deben coincidir en edad y peso para asegurar la comparabilidad de los resultados. Administración de la temperatura, la presión arterial, la anestesia y el líquido debe ser estable y controlado durante el experimento. 1. Anestesia y la cirugía <ol><li> Experimentos de isquemia renal puede realizarse de manera simultánea la aplicación de la isquemia y reperfusión en ambos riñones, o después de la nefrectomía simple en combinación con el tratamiento de la isquemia del riñón restante. Como tratamiento de la isquemia bilateral de ambos riñones se asocia con un aumento de las dificultades técnicas, un entorno más complejo y experimental ya la cirugía, vamos a realizar una nefrectomía derecha seguido de un tratamiento de isquemia del riñón izquierdo restante mediante la utilización de un sistema de peso que cuelga. Hemos utilizado este sistema de peso que cuelga también a la oclusión de las arterias coronarias en el corazón. Sin embargo, el procedimiento es diferente, ya que la arteria renal puede ser aislado de los tejidos circundantes, mientras que la arteria coronaria se encuentra en el músculo del corazón. </li><li> Ratones (8-14 semanas de edad, ambos sexos) se anestesiaron con pentobarbital a una dosis de 70mg/kg. Vamos a mantener la anestesia con aprox. 10 mg / kg / h de sodio pentobarbital. La sobredosis puede reducir significativamente la presión arterial y por lo tanto puede alterar los resultados. En nuestros estudios iniciales que también se utiliza la ketamina y xilazina. Sin embargo, estos compuestos induce una bradicardia fuertes (150 / min). Junto a la bradicardia observada también hay evidencia de que ambos compuestos están involucrados en los mecanismos de protección en condiciones de isquemia. Los anestésicos volátiles no puede ser utilizado debido a su capacidad para inducir también la protección renal y presión arterial baja. Por lo tanto, nuestra elección final de la anestesia fue pentobarbital. Además, la ketamina y xilazina se excreta principalmente por vía renal. Nefrectomía y la isquemia puede prolongar la anestesia ketamina. </li><li> Una vez que el dolor reflejos están ausentes (probado por apretar los dedos del pie con pinzas) los ratones se colocan sobre una mesa de calentamiento con control de temperatura (RT, Effenberg, Munich, Alemania, para mantener la temperatura corporal de 37,0 ° C) en posición de decúbito lateral izquierdo. </li><li> Coloque las extremidades inferiores y superiores a la mesa con cinta. </li><li> Para los que no la supervivencia de las cirugías, como se muestra en el vídeo de demostración, cubra el área de la incisión con aceite mineral para evitar la inhalación de pelo del ratón mediante la reducción de la piel y evitar así el riesgo de alergias del pelo del ratón. En el caso de los experimentos de supervivencia de técnicas adecuadas de asepsia incluyendo recorte del vello, la desinfección de la piel con los yodóforos (Betadine, por ejemplo), el manejo de los instrumentos esterilizados en autoclave y el uso de máscaras una guantes estériles para el cirujano se requieren. El aceite mineral no se utiliza en las cirugías de la supervivencia. Para las cirugías de supervivencia estéril de NaCl se utiliza </li><li> Incisión en el flanco derecho se llevará a cabo con una tijera y un electrodo de coagulación (Erbe, ICC50, Alemania) para prevenir el sangrado de los músculos y vasos de la piel. En contraste con el acceso a los riñones a través de laparotomía media, esta técnica no requiere el acceso a la cavidad peritoneal. </li><li> El pedículo renal, incluyendo la arteria renal y vena renal se ligan con sutura 4 / 0 de seda y el riñón derecho se pueden cortar con una tijera, sin interferir con los vasos suprarrenales. </li><li> La herida quirúrgica se cierra con sutura continua (dos puntos) de la pared muscular y la piel con una sutura de 4 / 0. </li><li> Los animales se colocan en una posición de decúbito lateral derecho y una incisión en el flanco izquierdo se realizará. </li><li> El riñón izquierdo se retira cuidadosamente de los tejidos conectivos, evitando la glándula suprarrenal y los vasos. </li><li> A continuación, el riñón se activa con su lado ventral hacia abajo en una taza de lucita. La copa de lucita debe ser esterilizado para las cirugías de supervivencia. El polo del riñón es cuidadosamente introduce dentro del vaso de lucita sosteniendo el tejido circundante con una pinza. A partir de entonces el polo es cuidadosamente introduce dentro del vaso lucite con una pinza. El riñón se mantendrá húmedo y cálido, con un hisopo húmedo empapado con agua a 37,0 ° C. </li><li> Tras la exposición del riñón izquierdo y la colocación en una taza de lucita el titular del riñón es restringido vientre para tener la tensión en los vasos renales. Una restricción suficiente es importante para una exitosa colocación de la sutura en la arteria renal. Posteriormente, el titular de los riñones es fija y la arteria renal se puede identificar fácilmente ya que se ejecuta en la parte superior de la vena renal. </li><li> La arteria renal se diseca los tejidos adyacentes, cerca de su despegue de la aorta abdominal con unas pinzas finas. La arteria se diseca la vena subyacente con una pinza curva en la parte superior. </li><li> Una sutura 8 / 0 de seda (Ethicon, Norderstedt, Alemania) se coloca debajo de la arteria renal mediante el uso deuna pinza como guía principal. Esta técnica permite la interrupción de sólo el flujo de sangre arterial al riñón sin compresión de la vena renal, en comparación con el cierre del pedículo renal. </li><li> La sutura se coloca sobre un palo pequeño (puede ser un pin de seguridad, elaborado) y un peso de aprox. 1 g se adjunta a cada extremo (tubo eppendorf). El peso se puede adaptar al tamaño del riñón mediante la suscripción o la adición de agua en los tubos eppendorf. Sin embargo, la arteria debe ser un poco tirado hacia arriba, de modo que no hay sangre corriendo a través de la arteria, pero sin estirar importante en la arteria. Estrés tramo importante de la arteria puede causar daño de la pared vascular con engrosamiento de la pared arterial y reduce la reperfusión. </li><li> Mientras que los pesos no son compatibles, la arteria renal es inmediatamente obstruida. Por el contrario, cuando los pesos son compatibles, el flujo sanguíneo se restaura inmediatamente a los órganos. La oclusión exitosa se confirma mediante un cambio de color de rojo a blanco. </li><li> Diferentes tiempos de isquemia se pueden realizar como es requerido por el experimento. A la reperfusión completa se llevará a cabo en función de la duración del tiempo de isquemia. Los tiempos de isquemia de 45 minutos permite recuperar la lesión renal. En nuestra configuración experimental se utilizaron 20 a 30 minutos de isquemia debido a una lesión renal medio que nos permite ver la mejora, así como la afectación de los riñones en función de la cepa de ratón y el tratamiento. </li><li> Después de la reperfusión completa del riñón puede ser sustituido de la Copa de lucita. Por lo tanto, el titular de riñón no es fija y la tensión en el riñón se libera. El polo craneal se quita suavemente fuera de la taza con una pinza suave y el polo caudal sigue inmediatamente. </li><li> La fijación (cintas) del ratón puede ser puesto en libertad y el ratón se puede colocar en posición supina, por ejemplo, para FITC-inulina autorización etiquetados. </li><li> En los subgrupos de los experimentos, la presión arterial y el ritmo cardíaco puede ser grabado a lo largo de la intervención quirúrgica. Mediciones de presión arterial son obtenidos de forma continua a través de un catéter en la arteria carótida. En resumen, la arteria carótida se expone a través de una disección roma de los músculos paratraqueales. Después de la exposición y evitar más cuidado de trauma de los tejidos (especialmente del nervio vago), se inserta un catéter en el vaso con dos puntos de sutura y una pequeña abrazadera. La presión arterial se mide con un elemento Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Suiza). </li><li> Por FITC aclaramiento de inulina de un catéter tiene que ser colocado en la vena yugular izquierda para perfusión de cloruro de sodio y la inulina marcada con FITC. Además, un catéter en la vejiga tiene que ser insertado para la recolección de orina de una manera dependiente del tiempo, como se explica en detalle a continuación. </li></ol> 2. Medición de la lesión renal <ol><li> En general: Los parámetros de resultados se recomienda lo siguiente para determinar el daño del riñón después de la isquemia renal: Realizar marcado con FITC aclaramiento de inulina para evaluar la tasa de filtración glomerular (TFG). Como alternativa determinar el aclaramiento de creatinina y la creatinina sérica a través de la investigación jaula metabólica 24 horas después de la lesión renal. Realizar renal tinción H &amp; E y la mieloperoxidasa (MPO) de ELISA para determinar el daño renal y la inflamación 24 horas después de la isquemia renal. </li><li> Investigaciones metabólicas jaula: <ol><li> Después de una isquemia del riñón izquierdo se convirtió de nuevo en la posición retroperitoneal y la herida se cierra como se describió anteriormente. </li><li> Al final de la cirugía de los ratones recibir 0,3 ml de solución salina normal IP y recuperar durante 2 horas bajo una lámpara de calentamiento. </li><li> A partir de entonces los ratones se colocan en jaulas metabólicas (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Alemania) para la determinación de los parámetros funcionales renales de 2 tiempos de 24 horas. </li><li> La toma de agua de cada ratón tiene que ser determinada por el peso del envase vacío y lleno de agua antes de su entrega al ratón y más de 24 horas más tarde por el peso del frasco lleno de nuevo. El peso del ratón ha de determinarse también. </li><li> Después de 24 horas aproximadamente 75μl de sangre se toman del plexo venoso detrás del ojo a través de un tubo capilar bajo anestesia isoflorane corto. </li><li> La función renal se determina mediante la medición de la creatinina en orina y plasma 24 horas después de la isquemia renal mediante un método colorimtric disponibles en el mercado de acuerdo con el fabricante `s del protocolo (LT-SYS, Trabajo + Technik, Berlín, Alemania). Las concentraciones plasmáticas y la orina de Na +, K + se determinan con un fotómetro de emisión de llama (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). Excreción renal y valores hemodinámicos se calculan utilizando fórmulas estándar 15-17. </li></ol></li><li> La depuración de inulina: FITC-inulina experimentos autorización se llevará a cabo tras la isquemia renal. <ol><li> La vena yugular izquierda se canula para continua infusion. Después de la disección de la vena del tejido adyacente con una tijera de preparación (Dumont, WPI) colocar dos puntos de sutura (4 / 0) alrededor de la vena. Coloque una pinza en la vena antes de la sutura proximale para detener el flujo de sangre. A partir de entonces cerrar el nudo distal y colocar un peso en uno de los extremos distales de sutura a la tensión la tensión en la vena. Esto es muy importante para obtener el catéter en la vena. Use un micro-tijeras para cortar una pequeña abertura en la vena. Mantener la apertura con una pinza fina (Dumont, IPM) y colocar el catéter en la vena. Para avanzar el catéter Remueva la pinza. Asegúrese de que no hay tensión en la sonda de modo que se puede colocar hacia abajo sin que lo sostiene. A partir de entonces cerca de la segunda sutura proximal sobre la vena y el catéter. </li><li> Se coloca un catéter en la vejiga urinaria para la recogida programada de orina. Por lo tanto, se corta una pequeña incisión en la piel sobre la vejiga. Retire con cuidado la vejiga a través del agujero de la piel. Fijar la vejiga con un pañuelo húmedo. Colocar una sutura preparado a lo largo de la vejiga (4 / 0). </li><li> Corte un pedazo pequeño de un catéter (1,5 cm) y el calor en el extremo de conseguir un anillo alrededor del catéter que hace más fácil para arreglarlo en la vejiga. </li><li> Corte un agujero en la vejiga en su parte superior. Hacer el corte entre los vasos para prevenir el sangrado. Introduzca el extremo grande del catéter en la vejiga y el cierre de la sutura sobre el catéter y la vejiga. </li><li> Todos los ratones reciben un bolo de solución de cloruro de sodio al 0,85% en una cantidad igual al 20% del peso corporal. La infusión continua se mantiene a un ritmo de 800ul/h/25g peso corporal y FITC-inulina se agrega a la infusión para la evaluación de la tasa de filtración del riñón entero glomerular (TFG). Después de la estabilización de los animales durante 20 min, 20 min muestras de orina de tiempo se llevan a cabo (cuatro veces) para la determinación de la tasa de flujo urinario y FITC-inulina. La sangre se obtiene en la mitad de cada período de medición de la FITC-inulina. </li><li> Al iniciar el período de recogida de 20 minutos de uso de un temporizador. Recoger la orina colocando el extremo de la sonda vesical en un pequeño tubo eppendorf. Medir el peso del tubo antes y después de la recolección de orina para que pueda determinar la cantidad de orina. Las muestras de sangre se toman a través del formulario de recogida de sangre retroorbital el plexo venoso a través de tubos capilares en el centro de cada período de recolección. </li></ol></li><li> La sangre y el riñón se pueden recoger después de cada procedimiento para más análisis ELISA MPO, por ejemplo, citoquinas EISA, la histología. </li></ol> 3. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2549/2549fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 Modelo de un sistema de suspensión de peso para la isquemia renal. Un sistema de peso que cuelga se ha establecido para inducir isquemia renal del riñón izquierdo. Por lo tanto, una sutura de nylon 8,0 se coloca debajo de la arteria renal y al final de cada sutura un peso pequeño (1 g) se adjunta. Este diseño experimental permite la oclusión reversible de la arteria renal mediante la aplicación y la liberación de la carga de peso.

<ol>
	<li>Abuelo, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normotensive+ischemic+acute+renal+failure.">Normotensive ischemic acute renal failure.</a> N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).</li><li>Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure.">Acute renal failure.</a> N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).</li><li>Lameire, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+acute+renal+failure.">The pathophysiology of acute renal failure.</a> Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).</li><li>Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathophysiology+of+aortic+cross-clamping+and+unclamping.">The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping.</a> Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).</li><li>Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+and+chronic+kidney+disease+following+liver+transplantation.">Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation.</a> Hemodial Int. 11, S7-S12 (2007).</li><li>Schrier, R. W., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+and+sepsis.">Acute renal failure and sepsis.</a> N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).</li><li>Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reno-Vascular+A2B+Adenosine+Receptor+Protects+the+Kidney+from+Ischemia.">The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia.</a> PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).</li><li>Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+E-NTPDase1+(CD39)+to+renal+protection+from+ischemia-reperfusion+injury.">Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury.</a> FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).</li><li>Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+ecto-5'-nucleotidase+(CD73)+in+renal+ischemia.">Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia.</a> J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).</li><li>Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediators+of+inflammation+in+acute+kidney+injury.">Mediators of inflammation in acute kidney injury.</a> Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).</li><li>Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD4+T-cell+depletion+is+not+sufficient+to+prevent+ischemic+acute+renal+failure.">Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure.</a> Transplantation. 80, 643-649 (2005).</li><li>Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+Dicer+from+proximal+tubules+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury.">Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).</li><li>Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+delayed+renal+protection+against+renal+ischemia+and+reperfusion+injury+with+A1+adenosine+receptors.">Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).</li><li>Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+hanging-weight+system+for+isolated+renal+artery+occlusion+during+ischemic+preconditioning+in+mice.">Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular,+renal,+and+pulmonary+function+in+mice.">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).</li></ol>

En resumen, el estudio describe una nueva técnica para la realización de la isquemia renal en un modelo murino utilizando un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal. De hecho, este estudio demuestra una lesión altamente reproducible, lo que reduce la variabilidad asociada con la fijación del pedículo renal.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Pentobarbital sódico </td><td> Ls Vortech Farmacéutica, SA </td><td> VPL 9372 </td><td> 4mg/mL en solución salina </td></tr><tr><td> Sutura de seda 4.0 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 517698 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura de Prolene 8.0 </td><td> Ethicon, EE.UU. </td><td> M8739 </td><td> reutilizables </td></tr><tr><td> microscopio de disección </td><td> Leica </td><td> n / a </td><td> considerar la distancia amplia zona de trabajo </td></tr><tr><td> Calefacción Mesa </td><td> Rt, Effenberger, Alemania </td><td> n / a </td><td> único proveedor y una sola </td></tr><tr><td> Los instrumentos quirúrgicos </td><td> WPI, Dumont </td><td></td><td> una tijera bien microvasos </td></tr></tbody></table>

use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion

En pacientes hospitalizados, más del 50% de los casos de insuficiencia renal aguda (IRA) son causados ​​por la isquemia renal 1-3. Un estudio reciente de los pacientes hospitalizados reveló que sólo un leve aumento en los niveles de creatinina sérica (0,3 a 0,4 mg / dl) se asocia con un riesgo 70% mayor de muerte que en personas sin ningún tipo de incremento de 1. En este sentido, los procedimientos quirúrgicos que requieren el pinzamiento de la aorta y los vasos renales se asocian con una tasa de fallos renales de hasta un 30% 4. Del mismo modo, la IRA después de la cirugía cardíaca se produce en más del 10% de los pacientes en circunstancias normales y se asocia con un aumento espectacular de la mortalidad. AKI también son complicaciones frecuentes tras el trasplante hepático. Por lo menos 17.8% de los pacientes terminan requiriendo terapia de reemplazo renal 5. Además, la función retardada del injerto debido a una lesión tubular de células durante el trasplante renal es con frecuencia relacionada con la isquemia asociada con lesión renal aguda 6. Por otra parte, la IRA se produce en aproximadamente el 20% de los pacientes con sepsis 6. La aparición de la lesión renal aguda se asocia con un aumento espectacular de la morbilidad y la mortalidad 1. Enfoques terapéuticos son muy limitados y la mayoría de los ensayos de intervención en AKI han fracasado en los seres humanos. Por lo tanto, las modalidades terapéuticas adicionales para prevenir el daño renal por isquemia se necesitan con urgencia 3, 7-9. Para dilucidar los mecanismos de lesión renal por isquemia y posibles estrategias de los modelos murinos terapéuticos son intensamente requeridas 13.07. Modelos de ratón proporcionan la posibilidad de utilizar diferentes modelos genéticos, incluidos los genes específicos ratones y tejidos específicos de genes diana de ratones (CRE-flox del sistema). Sin embargo, la isquemia renal murina es técnicamente difícil y detalles experimentales influyen significativamente en los resultados. Se realizó una evaluación sistemática de un nuevo modelo para la oclusión de la arteria renal aislada en ratones, que específicamente se evita el uso de sujeción o sutura de los 14 pedículo renal. Este modelo requiere de una nefrectomía del riñón derecho ya que la isquemia puede ser realizado en un riñón debido a la configuración experimental. De hecho, mediante el uso de un sistema de suspensión de peso, la arteria renal es sólo una vez instrumentado a través del procedimiento quirúrgico. Además, no hay obstrucción venosa o la uretra se produce con esta técnica. Nosotros pudimos demostrar el tiempo-dependiente de la dosis y altamente reproducible lesiones renales con isquemia mediante la medición de la creatinina sérica. Por otra parte, al comparar este nuevo modelo con sujeción convencional de toda la protección de pedículo renal por precondicionamiento isquémico es más profundo y más confiable. Por lo tanto, su nueva técnica podría ser útil para otros investigadores que trabajan en el campo de la insuficiencia renal aguda.

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion at JoVE.com

Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

Un modelo murino precisa para la lesión renal aguda (IRA), debido a la isquemia es una herramienta importante para investigar la lesión renal aguda y, posiblemente, encontrar herramientas terapéuticas para tratar la lesión renal. El sistema de peso que cuelga ofrece una herramienta para la oclusión de la arteria renal inmediata y confiable y la reperfusión, sin causar congestión renal.

El uso de un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria renal aislada

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia 1-3. A recent study of hospitalized patients ...

use-of-a-hanging-weight-system-for-isolated-renal-artery-occlusion

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K vistas.  University of Colorado. Un modelo murino precisa para la lesión renal aguda (IRA), debido a la isquemia es una herramienta importante para investigar la lesión renal aguda y, posiblemente, encontrar herramientas terapéuticas para tratar la lesión renal. El sistema de peso que cuelga ofrece una herramienta para la oclusión de la arteria renal inmediata y confiable y la reperfusión, sin causar congestión renal.

Video: Use of a Hanging-weight System for Isolated Renal Artery Occlusion

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Modelado de accidente cerebrovascular en ratones - Oclusión arteria cerebral media con el modelo de filamento

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Investigación

Medicina

Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. Cardioprotection by ischemic preconditioning (IP) remains an area of intense investigation. To further elucidate its molecular basis, the use of knockout mouse studies is particularly important 7, 14, 30, 39. Despite the fact that previous studies have already successfully performed cardiac ischemia and reperfusion in mice, this model is technically very challenging. Particularly, visual identification of the coronary artery, placement of the suture around the vessel and coronary occlusion by tying off the vessel with a supported knot is technically difficult. In addition, re-opening the knot for intermittent reperfusion of the coronary artery during IP without causing surgical trauma adds additional challenge. Moreover, if the knot is not tied down strong enough, inadvertent reperfusion due to imperfect occlusion of the coronary may affect the results. In fact, this can easily occur due to the movement of the beating heart.
Based on potential problems associated with using a knotted coronary occlusion system, we adopted a previously published model of chronic cardiomyopathy based on a hanging weight system for intermittent coronary artery occlusion during IP 39. In fact, coronary artery occlusion can thus be achieved without having to occlude the coronary by a knot. Moreover, reperfusion of the vessel can be easily achieved by supporting the hanging weights which are in a remote localization from cardiac tissues.
We tested this system systematically, including variation of ischemia and reperfusion times, preconditioning regiments, body temperature and genetic backgrounds39. In addition to infarct staining, we tested cardiac troponin I (cTnI)
as a marker of myocardial infarction in this model. In fact, plasma levels of cTnI correlated with infarct sizes (R2=0.8). Finally, we could show in several studies that this technique yields highly reproducible infarct sizes during murine IP and myocardial infarction6, 8, 30, 40, 41. Therefore, this technique may be helpful for researchers who pursue molecular mechanisms involved in cardioprotection by IP using a genetic approach in mice with targeted gene deletion. Further studies on cardiac IP using transgenic mice may consider this technique.

A murine model for myocardial ischemia and ischemic preconditioning is an important tool study cardioprotective mechanisms in vivo. Here, we report an easy applicable in situ model for cardiac IP using a hanging-weight system for coronary artery occlusion.

El uso de un sistema de peso que cuelga de la oclusión coronaria en ratones

Murine studies of acute injury are an area of intense investigation, as knockout mice for different genes are becoming increasingly available 1-38. ...

Use of a Hanging-weight System for Liver Ischemia in Mice

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and can result in liver failure which has a high mortality rate1-2. Therefore murine studies of hepatic ischemia have become an important field of research by providing the opportunity to utilize pharmacological and genetic studies3-9. Specifically, conditional mice with tissue specific deletion of a gene (cre, flox system) provide insights into the role of proteins in particular tissues10-13 . Because of the technical difficulty associated with manually clamping the portal triad in mice, we performed a systematic evaluation using a hanging-weight system for portal triad occlusion which has been previously described3. By using a hanging-weight system we place a suture around the left branch of the portal triad without causing any damage to the hepatic lobes, since also the finest clamps available can cause hepatic tissue damage because of the close location of liver tissue to the vessels. Furthermore, the right branch of the hepatic triad is still perfused thus no intestinal congestion occurs with this technique as blood flow to the right hepatic lobes is preserved. Furthermore, the portal triad is only manipulated once throughout the entire surgical procedure. As a result, procedures like pre-conditioning, with short times of ischemia and reperfusion, can be easily performed. Systematic evaluation of this model by performing different ischemia and reperfusion times revealed a close correlation of hepatic ischemia time with liver damage as measured by alanine (ALT) and aspartate (AST) aminotransferase serum levels3,9. Taken together, these studies confirm highly reproducible liver injury when using the hanging-weight system for hepatic ischemia and intermittent reperfusion. Thus, this technique might be useful for other investigators interested in liver ischemia studies in mice. Therefore the video clip provides a detailed step-by-step description of this technique.

We established a novel murine model of a hanging weight system for portal triad occlusion. This technique may be useful for future investigations of ischemia in murine hepatic models.

El uso de un sistema de suspensión de peso para la isquemia del hígado en ratones

Acute liver injury due to ischemia can occur during several clinical procedures e.g. liver transplantation, hepatic tumor resection or trauma repair and ...

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando una ventana craneal para visualizar la arteria cerebral media Durante la endotelina-1 inducida por oclusión de la arteria cerebral media

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal models of acute ischemic stroke allows to confirm successful arterial occlusion and exclude subarachnoid hemorrhage. Cerebral perfusion monitoring can also be used to study intracranial collateral circulation, which is emerging as a powerful determinant of stroke outcome and a possible therapeutic target. Despite a recognized role of Laser Doppler perfusion monitoring as part of the current guidelines for experimental cerebral ischemia, a number of technical difficulties exist that limit its widespread use. One of the major issues is obtaining a secure and prolonged attachment of a deep-penetration Laser Doppler probe to the animal skull. In this video, we show our optimized system for cerebral perfusion monitoring during transient middle cerebral artery occlusion by intraluminal filament in the rat. We developed in-house a simple method to obtain a custom made holder for twin-fibre (deep-penetration) Laser Doppler probes, which allow multi-site monitoring if needed. A continuous and prolonged monitoring of cerebral perfusion could easily be obtained over the intact skull.

Cerebral perfusion monitoring has been demonstrated to improve accuracy in ischemic stroke models. Technical difficulties often limit the use of this essential tool for cerebrovascular research. In this video, an optimized system is shown to obtain a single or multi-site hemodynamic monitoring during intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats.

Sistema optimizado para la monitorización de la perfusión cerebral en el modelo de rata de Carrera intraluminal oclusión arteria cerebral media

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart model, have been invaluable tools for studying cardiovascular function and disease1-15. Although the Langendorff heart preparation can be used for any mammalian heart, most studies involving this apparatus use small animal models (e.g., mouse, rat, and rabbit) due to the increased complexity of systems for larger mammals1,3,11. One major difficulty is ensuring a constant coronary perfusion pressure over a range of different heart sizes &#8211; a key component of any experiment utilizing this device1,11. By replacing the classic hydrostatic afterload column with a centrifugal pump, the Langendorff working heart apparatus described below allows for easy adjustment and tight regulation of perfusion pressures, meaning the same set-up can be used for various species or heart sizes. Furthermore, this configuration can also seamlessly switch between constant pressure or constant flow during reperfusion, depending on the user&#8217;s preferences. The open nature of this setup, despite making temperature regulation more difficult than other designs, allows for easy collection of effluent and ventricular pressure-volume data.

Most studies involving the Langendorff apparatus use small animal models due to the increased complexity of systems for larger mammals. We describe a Langendorff system for large animal models that allows for use across a range of species, including humans, and relatively easy data acquisition.

Un sistema de trabajo del corazón aislada por grandes modelos animales

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Surgical Approach for Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion Induced Stroke in Mice

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ischemic in origin and occur in the territory of the middle cerebral artery (MCA). Currently the only Food and Drug Administration (FDA) approved drug for the treatment of this devastating disease is tissue plasminogen activator (tPA). However, tPA has a small therapeutic window for administration (3 - 6 hr), and is only effective in 4% of the patients who actually receive it. Current research focuses on understanding the pathophysiology of stroke in order to find potential therapeutic targets. Thus, reliable models are crucial, and the MCA occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) is deemed to be the most clinically relevant surgical model of ischemic stroke, and is fairly non-invasive and easily reproducible. Typically the MCAo model is used with rodents, especially with mice due to all the genetic variations available for this species. Here we describe (and present in the video) how to successfully perform the MCAo model (with reperfusion) in mice to generate reliable and reproducible data.

In order to understand the pathophysiology of stroke, it is important to use reliable models. This paper will describe one of the most frequently used stroke models in mice, termed the middle cerebral artery occlusion (MCAo) model (also termed the intraluminal filament or suture model) with reperfusion.

Técnica quirúrgica para la oclusión de la arteria cerebral media y la reperfusión del movimiento inducidos en ratones

Stroke is a leading cause of death worldwide and continues to be one of the major causes of long-term adult disabilities. About 87% of strokes are ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Oclusión de la arteria Cerebral Media permitiendo la reperfusión mediante la reparación de la arteria carótida común en ratones

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...

A Modified Two Kidney One Clip Mouse Model of Renin Regulation in Renal Artery Stenosis

Renal artery stenosis is a common condition in patients with coronary or peripheral vascular disease where the renin angiotensin aldosterone system (RAAS) is overactivated. In this context, there is a narrowing of the renal arteries that stimulate an increase in the expression and release of renin, the rate-limiting protease in RAAS. The resulting rise in renin expression is a known driver of renovascular hypertension, frequently associated with kidney injury and end organ damage. Thus, there is a great interest in developing novel treatments for this condition. The molecular and cellular mechanism of renin control in renal artery stenosis is not fully understood and warrants further investigation. To induce renal artery stenosis in mice, a modified 2 kidney 1 clip (2K1C) Goldblatt mouse model was developed. The right kidney was stenosed in wild type mice and sham operated mice were used as control. After renal artery stenosis, we determined renin expression and kidney injury. Kidneys were harvested, and fresh cortices were used to determine protein and mRNA expression of renin. This animal model is reproducible and can be used to study pathophysiological responses, molecular and cellular pathways involved in renovascular hypertension and kidney injury.

A modified 2 kidney 1 clip (2K1C) Goldblatt mouse model was developed using polyurethane tubing to initiate renal artery stenosis, inducing an increase in renin expression and kidney injury. Here, we describe a detailed procedure of preparing and placing the cuff onto the renal artery to generate a reproducible and consistent 2K1C mouse model.

Un modelo modificado de dos riñones y un ratón clip de regulación de renina en la estenosis de la arteria renal

Renal artery stenosis is a common condition in patients with coronary or peripheral vascular disease where the renin angiotensin aldosterone system (RAAS) ...