Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas e Ictus (R01 NS048353 a SLC), el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA122804 a SLC, R01 CA134773 a Kevin A. Roth y SLC y CA13148-35 a KRZ) y el Departamento de Defensa (X81XWH-09-1-0086 a SLC). Fondos de apoyo a la operación de los pequeños del Centro Integral del Cáncer de la UAB instalación de imágenes de animales compartidos fueron proporcionados por un núcleo de apoyo NCI subvención (P30 CA13148-35, E. Partridge, PI). Agradecemos a la Neurociencia Alabama Plan Core Center (P30 NS57098) y Neurociencia de la UAB Core Center (P30 NS47466) por su ayuda. El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o el Departamento de Defensa.

<ol>
	<li>Rosenberg, M. P., Bortner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+transgenic+and+knockout+animal+models+should+be+used+(for+drug+efficacy+studies+in+cancer).">Why transgenic and knockout animal models should be used (for drug efficacy studies in cancer).</a> Cancer Met. Rev. 17, 295-299 (1999).</li><li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice.">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Met. Rev. 17, 279-284 (1999).</li><li>Carroll, S. L., Ratner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+Schwann+cell+lineage+form+tumors+in+NF1?.">How does the Schwann cell lineage form tumors in NF1?.</a> Glia. 56, 1590-1605 (2008).</li><li>Woodruff, J. M., Kourea, H. P., Louis, D. N., Scheithauer, B. W., Kleihues, P., Cavenee, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology and Genetics of Tumours of the Nervous System. , 172-174 (2000).</li><li>DeClue, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+expression+in+neurofibromatosis+type+1-related+tumors+and+NF1+animal+models.">Epidermal growth factor receptor expression in neurofibromatosis type 1-related tumors and NF1 animal models.</a> J. Clin. Invest. 105, 1233-1241 (2000).</li><li>Byer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+via+an+estrogen+receptor-independent+mechanism.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth via an estrogen receptor-independent mechanism.</a> Neuro-Oncology. , (2010).</li><li>Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li><li>Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+of+firefly+luciferase+reporter+gene+expression+in+skeletal+muscles+of+living+mice.">Noninvasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice.</a> Mol. Therapy. 4, 297-306 (2001).</li><li>Luker, G. D., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+real-time+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+viral+pathogenesis.">Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 292, 285-296 (2005).</li><li>Dahlberg, W. K., Little, J. B., Fletcher, J. A., Suit, H. D., Okunieff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+vitro+of+human+soft+tissue+sarcoma+cell+lines+and+skin+fibroblasts+derived+from+the+same+patients.">Radiosensitivity in vitro of human soft tissue sarcoma cell lines and skin fibroblasts derived from the same patients.</a> Int. J. Radiat. Biol. 63, 191-198 (1993).</li><li>Badache, A., DeVries, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibrosarcoma-derived+Schwann+cells+overexpress+platelet-derived+growth+factor+(PDGF)+receptors+and+are+induced+to+proliferate+by+PDGF.">Neurofibrosarcoma-derived Schwann cells overexpress platelet-derived growth factor (PDGF) receptors and are induced to proliferate by PDGF.</a> BB. J. Cell. Physiol. 177, 334-342 (1998).</li><li>Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenic+properties+of+neurofibromin-deficient+neurofibroma+Schwann+cells.">Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells.</a> Am. J. Pathol. 158, 501-513 (2001).</li></ol>

El método detallado ortotópico xenoinjertos se presenta aquí es que hemos desarrollado con ST88-14 células MPNST, una línea que es ampliamente utilizado en los estudios de estos NF1 tumores asociados de vaina nerviosa periférica. Sin embargo, esta metodología es fácilmente adaptable a los estudios preclínicos con otras líneas de células MPNST. Por ejemplo, también hemos realizado ortotópico xenoinjertos con la misión STS-26T 10 células, una línea derivada de una aparición esporádica MPNST y T265-2c células 11, que se derivan de un MPNST NF1 asociados, con un éxito similar al que observamos con ST88 -14 células. Dicho esto, cabe señalar que las condiciones exactas que describimos aquí para ortotópico xenoinjertos de ST88-14 células no pueden ser adoptadas directamente por el injerto de las líneas de MPNST otros. En cambio, los parámetros clave de la metodología debe ser determinada empíricamente para cada línea celular. Estos parámetros incluyen el número de células MPNST inicialmente el injerto en el tiempo permitido para el desarrollo del injerto y, en menor medida, el volumen en el que las células tumorales se inyectan. Para establecer estos parámetros para una nueva línea, que los grupos de injerto de ratones (5 ratones por grupo) con 10 3 a 5 x 10 6 células tumorales, el control de las concentraciones de dos células de cada orden de magnitud (es decir, 10 3 células, 5 x 10 3 células, 10 4 células, 5 x 10 4 células, etc.) Un mayor número de células tumorales (&gt; 10 6) se debe inyectar en un volumen mayor, hemos encontrado que hasta un 5 ml se puede inyectar sin pérdida de las células del nervio injertado. También hemos encontrado que no más de 5 x 10 6 células tumorales por volumen de 5 ml se puede inyectar en forma de suspensiones más denso cada vez más propensos a la corte que mata las células tumorales. Seguimos estos ratones hasta por lo menos tres animales en cada grupo tienen tumores palpables, momento en el que damos por terminado ese grupo y examinar el nervio histológico para confirmar el crecimiento del injerto. Obviamente, el tiempo necesario para llegar a este punto serán diferentes, dependiendo del número de células inyectadas, en general, estamos buscando a una concentración de células que se alcance el máximo crecimiento del tumor permitida dentro de 30-60 días. Un crecimiento más rápido puede hacer que sea difícil alcanzar las concentraciones terapéuticas antes de la terminación de la experimentación y / o evitar la acumulación de suficientes puntos de datos de imágenes de bioluminiscencia en el curso de los experimentos. Un curso de tiempo de más de 60 días realiza el ajuste de parámetros experimentales difíciles de manejar y prolonga innecesariamente la duración de los experimentos previstos. Por último, también quisiera señalar que hemos utilizado esta metodología ortotópico xenoinjertos con ST88-14 células injertadas en ratones NIH III para demostrar la eficacia terapéutica de tamoxifeno 6. Una descripción detallada de los métodos que utilizan habitualmente para evaluar los efectos de posibles agentes terapéuticos en xenoinjertos ortotópico se pueden encontrar en el manuscrito. También se ha demostrado que las células neurofibroma puede ser injertadas con éxito en los nervios periféricos 12, lo que sugiere que, con modificaciones, los procedimientos descritos en este protocolo se puede utilizar para realizar los ensayos preclínicos con posibles agentes terapéuticos dirigidos contra la neurofibromas.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foxchase outbred SCID mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River </td>
<td>#236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH III mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taconic </td>
<td>#NIHBNX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NOD-SCID&gamma; mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories </td>
<td>#005557</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Stripper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>25-056-cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vetbond surgical glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>1469SB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>#80030</td>
<td>10 &mu;L volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton syringe needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>#7803-05</td>
<td>33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)</td>
</tr>
<tr>
<td>Ear tags</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Band and Ear Tag Co.</td>
<td>1005-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dechra</td>
<td>NDC 17033-211-38</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents

Aunque en las pantallas in vitro son esenciales para la identificación inicial de posibles agentes terapéuticos, una evaluación rigurosa de la capacidad del medicamento para inhibir el crecimiento del tumor debe realizarse en un modelo animal adecuado. El tipo de modelo animal que es el mejor para este propósito es un tema de intensa discusión. Cierta evidencia indica que los ensayos preclínicos que evaluaron los efectos de drogas en los tumores que surgen en ratones transgénicos son más predictivos de los resultados clínicos y lo que los agentes un candidato terapéutico a menudo se prueba en estos modelos. Desafortunadamente, los modelos transgénicos no están disponibles para muchos tipos de tumores. Además, los modelos transgénicos a menudo tienen otras limitaciones como la preocupación en cuanto a qué tan bien los modelos tumorales de ratón de su contraparte humana, penetrancia incompleta del fenotipo tumoral y una incapacidad para predecir cuando los tumores se desarrollan. En consecuencia, muchos investigadores utilizan modelos de xenoinjerto (células tumorales humanas injertadas en ratones inmunodeficientes) para ensayos preclínicos en su caso los modelos tumorales transgénicos no están disponibles. Incluso si se dispone de modelos transgénicos, a menudo asociado con los modelos de xenoinjerto como el último de facilitar la rápida determinación de los rangos terapéuticos. Además, esta asociación permite una comparación de la eficacia del agente en los tumores de transgénicos y genuina células tumorales humanas. Históricamente, los xenoinjertos ha sido a menudo realiza mediante la inyección de células tumorales por vía subcutánea (xenoinjertos ectópico). Esta técnica es rápida y reproducible, relativamente barata y permite la cuantificación continua de crecimiento tumoral durante el período terapéutico 2. Sin embargo, el espacio subcutáneo no es el microambiente normal para la mayoría neoplasias y los resultados así obtenidos con xenoinjerto ectópico puede ser engañoso debido a factores tales como la ausencia de órganos específicos de la expresión de los tejidos del huésped y los genes del tumor. Así, ha sido fuertemente recomendado que los estudios de injerto ectópico ser sustituido o complementado con estudios en los que las células de tumores humanos son injertados en su tejido de origen (xenoinjertos ortotópico) 2. Desafortunadamente, la implementación de esta recomendación es a menudo frustrado por el hecho de que las metodologías ortotópico xenoinjertos todavía no se han desarrollado para muchos tipos de tumores. Los tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNSTs) son sarcomas muy agresivos que se producen de forma esporádica o en asociación con neurofibromatosis tipo 1 y 3 con más frecuencia se plantean en el nervio ciático 4. Aquí se describe un método técnicamente sencillo en el que luciferasa de luciérnaga-etiquetados células MPNST humanos orthopically transplantados en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes. Nuestro enfoque para evaluar el éxito del procedimiento de injerto en los animales y la asignación al azar posteriores no sesgada en los grupos de estudio también se examina.

Watch this Scientific Journal Video about Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents at JoVE.c

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Un método de injerto de forma fiable la luciferasa-etiquetados humanos malignos de los nervios periféricos células del tumor de la vaina en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes se describe. El uso de imágenes de bioluminiscencia para demostrar establecimiento adecuado de los injertos de tumor y los criterios de segregación aleatoria de los animales en grupos de estudio también se discuten.

Xenotrasplante ortotópico de los Derechos Humanos-luciferasa Tagged células malignas del tumor vaina de nervio periférico para In vivo Pruebas de candidatos a agentes terapéuticos

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

orthotopic-xenografting-human-luciferase-tagged-malignant-peripheral

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

18.5K vistas.  University of Alabama at Birmingham - UAB. Un método de injerto de forma fiable la luciferasa-etiquetados humanos malignos de los nervios periféricos células del tumor de la vaina en el nervio ciático de ratones inmunodeficientes se describe. El uso de imágenes de bioluminiscencia para demostrar establecimiento adecuado de los injertos de tumor y los criterios de segregación aleatoria de los animales en grupos de estudio también se discuten.

Video: Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents