Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Doenças Neurológicas e Derrames (R01 NS048353 a SLC), o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA122804 a SLC, R01 CA134773 para Kevin A. Roth e SLC e CA13148-35 para KRZ) e do Departamento de defesa (X81XWH-09-1-0086 a SLC). Fundos de apoio à operação da UAB Comprehensive Cancer Center instalação de Pequenos Animais de imagem Shared foram fornecidos por um Core Suporte NCI subvenção (P30 CA13148-35; E. Partridge, PI). Agradecemos ao Alabama Neuroscience Blueprint Core Center (P30 NS57098) eo Núcleo UAB Neuroscience Center (P30 NS47466) pela sua assistência. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde ou o Departamento de Defesa.

<ol>
	<li>Rosenberg, M. P., Bortner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+transgenic+and+knockout+animal+models+should+be+used+(for+drug+efficacy+studies+in+cancer).">Why transgenic and knockout animal models should be used (for drug efficacy studies in cancer).</a> Cancer Met. Rev. 17, 295-299 (1999).</li><li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice.">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Met. Rev. 17, 279-284 (1999).</li><li>Carroll, S. L., Ratner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+Schwann+cell+lineage+form+tumors+in+NF1?.">How does the Schwann cell lineage form tumors in NF1?.</a> Glia. 56, 1590-1605 (2008).</li><li>Woodruff, J. M., Kourea, H. P., Louis, D. N., Scheithauer, B. W., Kleihues, P., Cavenee, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology and Genetics of Tumours of the Nervous System. , 172-174 (2000).</li><li>DeClue, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+expression+in+neurofibromatosis+type+1-related+tumors+and+NF1+animal+models.">Epidermal growth factor receptor expression in neurofibromatosis type 1-related tumors and NF1 animal models.</a> J. Clin. Invest. 105, 1233-1241 (2000).</li><li>Byer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+via+an+estrogen+receptor-independent+mechanism.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth via an estrogen receptor-independent mechanism.</a> Neuro-Oncology. , (2010).</li><li>Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li><li>Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+of+firefly+luciferase+reporter+gene+expression+in+skeletal+muscles+of+living+mice.">Noninvasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice.</a> Mol. Therapy. 4, 297-306 (2001).</li><li>Luker, G. D., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+real-time+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+viral+pathogenesis.">Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 292, 285-296 (2005).</li><li>Dahlberg, W. K., Little, J. B., Fletcher, J. A., Suit, H. D., Okunieff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+vitro+of+human+soft+tissue+sarcoma+cell+lines+and+skin+fibroblasts+derived+from+the+same+patients.">Radiosensitivity in vitro of human soft tissue sarcoma cell lines and skin fibroblasts derived from the same patients.</a> Int. J. Radiat. Biol. 63, 191-198 (1993).</li><li>Badache, A., DeVries, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibrosarcoma-derived+Schwann+cells+overexpress+platelet-derived+growth+factor+(PDGF)+receptors+and+are+induced+to+proliferate+by+PDGF.">Neurofibrosarcoma-derived Schwann cells overexpress platelet-derived growth factor (PDGF) receptors and are induced to proliferate by PDGF.</a> BB. J. Cell. Physiol. 177, 334-342 (1998).</li><li>Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenic+properties+of+neurofibromin-deficient+neurofibroma+Schwann+cells.">Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells.</a> Am. J. Pathol. 158, 501-513 (2001).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método ortotópico detalhada xeno aqui apresentado é aquele que desenvolvemos usando células ST88-14 MPNST, uma linha que é amplamente utilizado em estudos desses NF1 associada tumores de bainha de nervo periférico. No entanto, essa metodologia é facilmente adaptável para os estudos pré-clínicos com outras linhagens de células MPNST. Por exemplo, temos também realizada ortotópico xeno com STS-26T 10 células, uma linha derivada de uma MPNST esporadicamente ocorrendo e T265-2c 11 células, que são derivados de uma MPNST NF1-associados, com sucesso semelhante ao que observamos com ST88 -14 células. Dito isto, gostaríamos de observar que as condições exatas que descrevemos aqui para ortotópico xeno-enxerto de células ST88-14 não podem ser diretamente adotado para a enxertia de linhas MPNST outros. Em vez disso, os parâmetros-chave da metodologia deve ser determinado empiricamente para cada linhagem celular. Estes parâmetros incluem o número de células inicialmente MPNST enxertadas, o prazo concedido para o desenvolvimento do enxerto e, em menor grau, o volume em que as células do tumor são injetados. Para estabelecer esses parâmetros para uma nova linha, que grupos de enxerto de camundongos (5 ratos por grupo) com outubro 03-05 x 10 6 células tumorais, verificando duas concentrações de células para cada ordem de grandeza (ie, 10 3 células, 5 x 10 3 células, 10 4 células, 5 x 10 4 células, etc.) Maior número de células tumorais (&gt; 10 6) deve ser injetado em um maior volume; descobrimos que até 5 mL podem ser injetadas sem perda de células do nervo enxertado. Temos também descobriu que não mais que 5 x 10 6 células tumorais por 5 mL de volume pode ser injetado como suspensões mais denso tornar-se cada vez mais propenso a tesoura que mata as células do tumor. Nós seguimos estes ratos até pelo menos três animais dentro de cada grupo têm tumores palpáveis, em que ponto nós pôr termo a esse grupo e examinar o nervo histologicamente para confirmar o crescimento do enxerto. Obviamente, o tempo necessário para chegar a este ponto será diferente, dependendo do número de células injetadas, em geral, estamos buscando uma concentração de células que irá atingir o crescimento tumoral máxima permitida dentro de 30-60 dias. Crescimento mais rápido pode tornar difícil para alcançar concentrações terapêuticas eficazes antes do término do experimento e / ou evitar o acúmulo de pontos de dados de imagem de bioluminescência suficiente ao longo dos experimentos. Um curso de tempo superior a 60 dias faz ajustando os parâmetros experimentais pesadas e prolonga desnecessariamente a duração dos experimentos planejados. Finalmente, gostaríamos de observar também que temos utilizado esta metodologia ortotópico xeno com ST88-14 células enxertadas em camundongos NIH III para demonstrar a eficácia terapêutica do tamoxifeno 6. Uma descrição detalhada dos métodos que usam rotineiramente para avaliar os efeitos de agentes terapêuticos candidato em xenoenxertos ortotópico pode ser encontrado nesse manuscrito. Também tem sido demonstrado que as células neurofibroma pode ser enxertadas com sucesso em nervo periférico 12, sugerindo que, com modificações, os procedimentos descritos neste protocolo pode ser usado para realizar ensaios pré-clínicos com agentes terapêuticos dirigidos contra candidato neurofibromas.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foxchase outbred SCID mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River </td>
<td>#236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH III mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taconic </td>
<td>#NIHBNX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NOD-SCID&gamma; mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories </td>
<td>#005557</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Stripper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>25-056-cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vetbond surgical glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>1469SB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>#80030</td>
<td>10 &mu;L volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton syringe needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>#7803-05</td>
<td>33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)</td>
</tr>
<tr>
<td>Ear tags</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Band and Ear Tag Co.</td>
<td>1005-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dechra</td>
<td>NDC 17033-211-38</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents

Embora em telas vitro são essenciais para a identificação inicial de agentes terapêuticos candidato, uma avaliação rigorosa da capacidade da droga para inibir o crescimento do tumor deve ser realizado em um modelo animal adequado. O tipo de modelo animal que é melhor para esta finalidade é um tema de intensa discussão. Algumas evidências indicam que estudos pré-clínicos de examinar os efeitos da droga em tumores que surjam em camundongos transgênicos são mais preditivo do resultado clínico 1 e assim por agentes candidato terapêuticas são frequentemente testados nesses modelos. Infelizmente, os modelos transgênicos não estão disponíveis para vários tipos de tumor. Além disso, os modelos transgênicos têm, frequentemente, outras limitações, tais como preocupações sobre a forma como os modelos bem tumor do mouse seu homólogo humano, penetrância incompleta do fenótipo do tumor e uma incapacidade de prever quando irá desenvolver tumores. Conseqüentemente, muitos pesquisadores utilizam modelos xenoenxerto (células tumorais humanas enxertados em camundongos imunodeficientes) para os ensaios pré-clínicos, se necessário modelos de tumor transgênicos não estão disponíveis. Mesmo os modelos transgênicos estão disponíveis, são muitas vezes em parceria com modelos como o último xenoenxerto facilitar a determinação rápida de faixas terapêuticas. Além disso, esta parceria permite uma comparação da eficácia do agente em tumores transgênicos e genuíno células tumorais humanas. Historicamente, xeno tem sido muitas vezes realizada através da injeção de células tumorais por via subcutânea (xenoenxertos ectópica). Esta técnica é rápida e reprodutível, relativamente barata e permite a quantificação contínua de crescimento do tumor durante o período terapêutico 2. No entanto, o espaço subcutâneo não é o microambiente normal para a maioria neoplasias e por isso os resultados obtidos com xeno ectópica pode ser enganadora, devido a fatores como a ausência de órgãos específicos expressão do tecido do hospedeiro e dos genes do tumor. Foi assim fortemente recomendado que ectópica estudos de enxertia ser substituídos ou complementados por estudos em que as células tumorais humanas são enxertados em seu tecido de origem (xeno ortotópico) 2. Infelizmente, a implementação desta recomendação é muitas vezes frustrada pelo fato de que ortotópico metodologias xeno ainda não foram desenvolvidos para vários tipos de tumor. Tumores malignos da bainha dos nervos periféricos (MPNSTs) são sarcomas altamente agressivos que ocorrem esporadicamente ou em associação com neurofibromatose tipo 1 3 e mais comumente surgem no nervo ciático 4. Aqui nós descrevemos um método tecnicamente simples em que firefly luciferase marcadas MPNST células humanas são orthopically xenografted no nervo ciático de ratos imunodeficientes. Nossa abordagem para avaliar o sucesso do procedimento de enxerto em animais individuais e randomização não-tendenciosa subseqüentes em grupos de estudo também é discutida.

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Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Um método para enxertia confiável luciferase marcadas humana maligna dos nervos periféricos células tumorais em bainha do nervo ciático de ratos imunodeficientes é descrito. A utilização de imagem de bioluminescência para demonstrar estabelecimento adequado de enxertos tumor e critérios para a segregação aleatória dos animais em grupos de estudo são também discutidos.

Ortotópico do xeno-Human-luciferase Tagged maligna dos nervos periféricos Células Tumorais Bainha para In vivo Teste de Agentes Terapêuticos candidatos

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

orthotopic-xenografting-human-luciferase-tagged-malignant-peripheral

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

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