Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 a SLC), il National Cancer Institute (R01 CA122804 a SLC, R01 CA134773 a Kevin A. Roth e SLC e CA13148-35 a KRZ) e il Dipartimento di difesa (X81XWH-09-1-0086 a SLC). Fondi di sostegno per le operazioni di impianto degli animali di piccola Imaging del Comprehensive Cancer Centre UAB condivise sono state fornite da un tecnico concedere NSC Core (P30 CA13148-35; E. Pernice, PI). Ringraziamo il Alabama Neuroscience Blueprint core Center (P30 NS57098) e UAB Neuroscienze Nucleo Center (P30 NS47466) per la loro assistenza. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health e del Dipartimento della Difesa.

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo ortotopico dettagliati xenotrapianto qui presentato è quello che abbiamo sviluppato utilizzando ST88-14 MPNST cellule, una linea che è ampiamente utilizzato negli studi di questi NF1 associate a tumori della guaina dei nervi periferici. Tuttavia, questa metodologia è facilmente adattabile per studi preclinici con altre linee cellulari MPNST. Per esempio, abbiamo anche effettuato ortotopico xenotrapianto con STS-26T 10 celle, una linea derivata da un sporadici MPNST e T265-2c 11 celle, che sono derivati ​​da un NF1 associate MPNST, con un successo simile a quello che abbiamo osservato con ST88 -14 cellule. Detto questo, si segnala che le condizioni esatte che descriviamo qui per ortotopico xenotrapianto di ST88-14 le cellule non possono essere direttamente adottata per l&#39;innesto delle linee MPNST altri. Invece, i parametri chiave della metodologia deve essere empiricamente determinato per ogni linea cellulare. Questi parametri includono il numero di cellule MPNST inizialmente innestato, il tempo concesso per lo sviluppo del trapianto e, in misura minore, il volume in cui le cellule tumorali vengono iniettate. Per stabilire questi parametri per una nuova linea, abbiamo gruppi di topi innesto (5 topi per gruppo) con 03-5 ottobre x 10 6 cellule tumorali, controllando due concentrazioni di cellule per ogni ordine di grandezza (cioè, 10 3 celle, 5 x 10 3 celle, 10 4 celle, 5 x 10 4 cellule, ecc.) Un maggior numero di cellule tumorali (&gt; 10 6) deve essere iniettato in un volume più grande, abbiamo scoperto che fino a 5 ml può essere iniettato senza perdita di cellule del nervo innestato. Abbiamo anche scoperto che non più di 5 x 10 6 cellule tumorali per 5 ml di volume può essere iniettato come sospensioni dense diventano sempre più inclini a taglio che uccide le cellule tumorali. Seguiamo questi topi fino ad almeno tre animali all&#39;interno di ogni gruppo hanno tumori palpabili, a quel punto abbiamo porre termine a tale gruppo ed esaminare istologicamente il coraggio di confermare la crescita del trapianto. Ovviamente, il tempo necessario per arrivare a questo punto sarà diverso, a seconda del numero di cellule iniettate, in generale, stiamo cercando una concentrazione di cellule che raggiungerà la massima ammissibile di crescita del tumore entro 30-60 giorni. Crescita più rapida può rendere difficile da raggiungere concentrazioni terapeutiche efficaci prima della risoluzione della sperimentazione e / o impedire la raccolta di datapoint sufficiente di imaging bioluminescenza nel corso degli esperimenti. Un corso di tempo più lungo di 60 giorni permette di regolare parametri sperimentali ingombranti e prolunga inutilmente la durata degli esperimenti previsti. Infine, vorremmo anche notare che abbiamo utilizzato questa metodologia ortotopico xenotrapianto con ST88-14 cellule trapiantate in topi NIH III per dimostrare l&#39;efficacia terapeutica di tamoxifene 6. Una descrizione dettagliata dei metodi che usano abitualmente per valutare gli effetti degli agenti terapeutici candidato su xenotrapianti ortotopico si trovano in quel manoscritto. E &#39;stato anche dimostrato che le cellule neurofibroma può essere innestato con successo in nervo periferico 12, suggerendo che, con modifiche, le procedure descritte in questo protocollo può essere utilizzato per eseguire studi preclinici con agenti terapeutici diretti contro candidato neurofibromi.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foxchase outbred SCID mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River </td>
<td>#236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH III mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taconic </td>
<td>#NIHBNX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NOD-SCID&gamma; mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories </td>
<td>#005557</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Stripper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>25-056-cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vetbond surgical glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>1469SB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>#80030</td>
<td>10 &mu;L volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton syringe needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>#7803-05</td>
<td>33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)</td>
</tr>
<tr>
<td>Ear tags</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Band and Ear Tag Co.</td>
<td>1005-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dechra</td>
<td>NDC 17033-211-38</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents

Sebbene in vitro schermi sono essenziali per l&#39;identificazione iniziale di agenti terapeutici candidato, una rigorosa valutazione della capacità del farmaco di inibire la crescita tumorale deve essere eseguito in un modello animale adeguato. Il tipo di modello animale che è meglio per questo scopo è un argomento di discussione intensa. Alcune evidenze indicano che gli studi preclinici hanno esaminato gli effetti della droga sui tumori che insorgono in topi transgenici sono più predittivi di outcome clinico 1 e così gli agenti candidato terapeutici sono spesso testati in questi modelli. Purtroppo, i modelli transgenici non sono disponibili per molti tipi di tumore. Inoltre, i modelli transgenici hanno spesso altre limitazioni come ad esempio le preoccupazioni su come anche i modelli del mouse tumore sua controparte umana, penetranza incompleta del fenotipo tumorale e l&#39;incapacità di prevedere quando i tumori si sviluppano. Di conseguenza, molti ricercatori utilizzano modelli di xenotrapianto (innestato cellule tumorali umane in topi immunodeficienti) per gli studi preclinici, se del caso modelli tumorali transgenici non sono disponibili. Anche se i modelli transgenici sono disponibili, sono spesso in partnership con modelli di xenotrapianto di questi ultimi facilitare la determinazione rapida degli intervalli terapeutici. Inoltre, questa partnership permette un confronto tra l&#39;efficacia del farmaco in tumori transgenici e genuini cellule tumorali umane. Storicamente, xenotrapianto è stata spesso eseguita iniettando cellule tumorali per via sottocutanea (xenotrapianti ectopica). Questa tecnica è rapida e riproducibile, poco costoso e permette quantificazione continuo di crescita del tumore durante il periodo terapeutico 2. Tuttavia, lo spazio sottocutaneo non è il microambiente normale per la maggior parte neoplasie e quindi i risultati ottenuti con xenotrapianto ectopica può essere fuorviante a causa di fattori quali l&#39;assenza di organo-specifica espressione del tessuto ospite e geni del tumore. E &#39;stato pertanto fortemente raccomandato che ectopica studi innesto essere sostituiti o integrati da studi in cui si innestano le cellule tumorali umane nel loro tessuto di origine (xenotrapianto ortotopico) 2. Purtroppo, l&#39;attuazione di questa raccomandazione è spesso ostacolato dal fatto che ortotopico metodologie xenotrapianto non sono ancora stati sviluppati per molti tipi di tumore. I tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNSTs) sono sarcomi molto aggressivi che si verificano sporadicamente o in associazione con neurofibromatosi di tipo 1 3 e più comunemente sorgono nel nervo sciatico 4. Qui si descrive un metodo tecnicamente semplice, in cui lucciola luciferasi-tagged MPNST cellule umane sono orthopically trapiantate nel nervo sciatico di topi immunodeficienti. Il nostro approccio per valutare il successo della procedura di trapianto nei singoli animali e la successiva randomizzazione non polarizzato in gruppi di studio è anche discusso.

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Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Un metodo affidabile per l&#39;innesto luciferasi-tagged umani maligni dei nervi periferici cellule tumorali della guaina nel nervo sciatico di topi immunodeficienti è descritto. L&#39;uso di immagini bioluminescenza per dimostrare corretta predisposizione degli innesti del tumore ed i criteri per la segregazione casuale di animali in gruppi di studio vengono anche discussi.

Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

orthotopic-xenografting-human-luciferase-tagged-malignant-peripheral

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

18.5K Views.  University of Alabama at Birmingham - UAB. Un metodo affidabile per l'innesto luciferasi-tagged umani maligni dei nervi periferici cellule tumorali della guaina nel nervo sciatico di topi immunodeficienti è descritto. L'uso di immagini bioluminescenza per dimostrare corretta predisposizione degli innesti del tumore ed i criteri per la segregazione casuale di animali in gruppi di studio vengono anche discussi.

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