Bu çalışma ve Dairesi (Kevin A. Roth ve SLC ve CA13148-35 KRZ için SLC R01 CA122804, R01 CA134773) Sinir Hastalıkları ve İnme Ulusal Enstitüsü (SLC R01 NS048353), Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Savunma (SLC X81XWH-09-1-0086). Fon UAB Kapsamlı Kanser Merkezi Küçük Hayvan Görüntüleme Paylaşılan tesisin çalışmasını destekleyen bir NCI Çekirdek Destek Hibe (E. Keklik, PI P30 CA13148-35) tarafından sağlanmıştır. Alabama Nörobilim Blueprint Çekirdek Merkezi (P30 NS57098) ve onların yardım için UAB Nörobilim Core Merkezi (P30 NS47466) teşekkür ederim. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Sağlık ve Savunma Bakanlığı Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

1. Sigara çıplak bağışık yetmezliği olan farelere (Nude Suşlarının için gerekli değildir) ilk Hazırlanışı: <ol><li> Tüm işlemler önceden gözden geçirilmiş ve onaylanmış UAB Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından yürütülmektedir. Biz bu deneyler için bağışık yetmezliği olan farelere üç tür başarıyla kullanılır: a) Foxchase SCID fareleri outbred (CB17/lcr- Prkdc SCID / lcrCrl fareler), b) NIH III fareler (NIHS LYST bg Foxn1 nu Brk xid fareler) ve c ) NOD-SCIDγ fareler (NOD.Cg Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ fareler). Bizim ellerde, ortotopik xenografts büyüme, her ikisi de T hücreleri, B hücreleri ve NK hücre fonksiyonunu etkileyen mutasyonlar taşıyan NIH III ve NOD-SCIDγ fareler, hemen hemen aynıdır; bu protokol için, greft için gerekli gün sayısı büyüme, tedaviye başlanması ve görüntüleme yapıldığında kez sonrası aşılama olduğu zaman NOD-SCIDγ fareler kullanılarak ampirik olarak tespit ettik. Foxchase içinde Greft büyüme, T-ve B-hücre fonksiyonu hatalarına SCID fareleri outbred, genellikle daha uzun sürer. </li><li> Olmayan çıplak bağışık yetmezliği olan farelere çok sayıda grefti kolaylaştırmak için, önce aşılama öğleden sonra cerrahi sitesinden saç kaldırmak. Fare anestezi kullanılarak, atık gaz geçinmek buharlaştırıcı bağlı bir izofluran indüksiyon odası. Vücut ısısını korumak için, hayvanların bu süreçte bir ısıtma yastığı işlenir. Clippers, orta geri aşılı olmaktır tarafında arka bacak diz saç kaldırmak için kullanılır. Kalan saç ~ 5 dakika, bir kimyasal tüy dökücü ajan (örneğin Nair, aloe vera, hassas ciltler için özellikle bir ürün) kullanarak site dikkatlice çıkarılır. , Deri, göz ve diğer vücut yüzeyleri yayılabilir tahrişine yol açabilir olarak tüy dökücü ürün kaldırılması tavsiye edilir. Çalışma grupları farelerin kaybı sonucu, bu kadar bu deneyler hem de siyatik sinirleri bilateral hindleg fonksiyonunu bozabilir greft yok. </li><li> Fare yataklar olmayan bir izolasyon kafes içinde bir ısıtma yastığı tamamen kurtarmak için izin verilir, bu fareler, daha uyanık, diğer hayvanlar tarafından yaralanan olmadığını sağlar ve yanlışlıkla yataklar teneffüs engeller hem de. Fareler tamamen mobil ve sarhoşluk hiçbir kanıt göstermek, diğer farelerin bir kafes içine tekrar edilebilir. </li></ol> 2. Aşılama Günü Enjeksiyon için MPNST Hücreler hazırlanması <ol><li> Biz ampirik ST88-14 hücreleri, yaygın olarak kullanılan bir NF1 ile ilişkili tümör 5 türetilen bir MPNST hattı için belirlenmiş olan bu protokol sonrası aşılama, hücrelerin belirli bir sayıya aşılı ve tümör büyümesi için gereklidir. Aşılama için kullandığımız hücreleri stably biyoparlaklık görüntüleme 6 tarafından belirlenen ateşböceği lusiferaz ifade CMV lusiferaz IRES puromycin kaset ve klonlar içeren bir lentiviral vektör transduced olmuştur. Biz stably CMV hemen erken organizatörü kontrolü altında ateşböceği lusiferaz ifade plazmid ile transfekte MPNST hücreleri ile aşılama deneyler gerçekleştirdik. Bu plazmid vektörler ifade aşağıdaki aşılama yok tabi eğilimli olduğunu bulduk Biz bu tavsiye etmiyoruz. </li><li> ST88-14 hücreleri% 10 fetal buzağı serumu, 10 mcg / ml streptomisin ve 10 IU / ml penisilin (DMEM10) ile desteklenen Dulbecco&#39;nun asgari temel orta yetiştirilen vardır; 5 mg / ml puromycin da lentiviral vektör için seçim korumak için dahil edilir. Biz 50 pasajlar, bu hücrelerin laboratuvarda korumuştur ve hücre büyümesini Bu bölümlerin herhangi birinde herhangi bir değişiklik gözlenmez. 9 x 10 5 ST88-14 hücreleri, T175 balon balon yaklaşık% 80 konfluent hangi noktada kaplama ve 3 gün için yetiştirilir. Greft 35 fareler için% 80, tek bir konfluent T175 şişesi gereklidir; bu yoğunluk, ST88-14 hücreleri için ortalama verim T175 şişesi ortalama 7.3 x 10 6 hücre. Bu hücreler, aşılama için hasat öncesinde izdiham büyümeye izin verilmez ki büyük önem taşımaktadır. Biz aşılama hücre greft yetmezliği daha yüksek bir derecede konfluent şişeler sonuçları hasat ve sıklıkla greft büyüme in vivo kursu uzatır bulduk. </li><li> ST88-14 hücreleri oda sıcaklığında Hanks &#39;dengeli tuz solüsyonu ile bir kez durulanır. Hücreler Hücre Stripper hücre disosiasyon çözüm oda sıcaklığında 30 saniye ile 1 dakika kullanarak şişeyi kaldırılır. DMEM10, beş mililitre (Not: puromycin bu ortamda dahil değildir) kullanılan Cell Stripper her mililitrede hücrelere sonra eklenir. </li><li> Hücreler hemasitometre kullanarak sayılır. 3 mcL asılı 5 x 10 3 ST88-14 hücreleri, fare başına düşen enjekte edilecektir . Pipetleme için ödenek ile tüm kohort greft yeterli hücreleri, bir miktarhata (örneğin, 35 fareler için, biz genellikle yeterli hücre greft 40 fareler için bir dizi transfer), 1,5 mL steril bir tüpe aktarılır. Hücreler 3000 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj edilir. Süpernatant dikkatlice çıkarılır ve hücre pelletini DMEM10 yeniden süspanse (Not: Bu ortamda puromycin dahil değildir) 3 mcL başına 5 x 10 3 hücre nihai konsantrasyonu. Buz hücrelerinin tutun. </li></ol> 3. Protokol Aşılama <ol><li> Artık bir ayak tutam uyaran hindlimb çekilmeye kadar Fareler izofluran vaporizatör indüksiyon odasında anestezi. Fare onların tarafında yer ve 0.05 mg / kg buprenorfin hydrocholoride ile subkutan enjekte edilir. Anestezi sonra burun konisi ile teslim izofluran sürekli yönetim ile korunur. Ötenazi fareler video için bu yordamı göstermek için kullanılabilir olduğunu unutmayın; dolayısıyla, izofluran teslim etmek için kullanılan izofluran boru video görünmez. </li><li> Vücut ısısını korumak için, hayvanların aşılama süreci boyunca bir ısıtma yastığı işlenir. (Puralube veteriner merhem) kornea kuruma, oftalmik merhem küçük bir damla önlemek için her bir göz için uygulanır. , Yargılama boyunca, benzersiz tespit edilmesi her bir fare için gerekli olacak gibi, benzersiz bir tanımlayıcı numarası ile bir kulak etiketi her bir farenin sağ kulak kırpılır. </li><li> Mide üzerine yerleştirin, hayvan, arka ayakları yaymak. Meydana gelecektir grefti cerrahi penceresi (böğür) açığa, steril bir drape fare ile kaplayın. Steril örtüyü başının görselleştirme izin vermeli, hem de burun konisi içinde olduğundan emin olmak için ve solunum ve hayvan renk izlenmesine olanak. Kanadını merkezinde başlayan ve yavaş yavaş cerrahi pencere kenarları dışa doğru helezonik bir pamuk uçlu bir aplikatör, cerrahi bölge betadin uygulayın. % 70 etanol, sonra aynı şekilde cerrahi site uygulanır. Ardışık uygulamalar etanol ile takip betadin iki defa daha tekrarlanır. </li><li> Çıkarın ve buz ya da hafifçe vorteks hücreleri veya tüp yerleşmiş hücreleri tekrar süspansiyon hareketiyle. Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonu 3.2 mcL kaldırmak ve Parafilm bir parça üzerine çıkarmak. Gerekenden daha kaldırarak ve Parafilm süspansiyon yerleştirerek, süspansiyon kabarcıklar olduğunu sağlamak ve enjeksiyon için tam 3 mcL var. 33 gauge iğne ile donatılmış bir 10 mcL Hamilton şırınga içine kadar hücre süspansiyonu mümkün çekin. Flick şırıngaya kabarcıkları ve tam olarak 3 mcL aşırı hücre süspansiyonu sınırdışı. Buz üzerinde hücre ve hücre içeren şırınga, iğne steril kalmasını sağlamak için, buz veya kova ile temasa izin verilmez; kullanmak için hazır olana kadar tutun. Saran wrap bir parça buz doğrudan temas şırıngaya buz üstüne yerleştirilebilir. </li><li> No 22 neşter bıçağı ile donatılmıştır No 4 neşter kolu kullanarak, sadece aşağıdaki paralel femur kanadını cilt üzerinden bir kesi yapmak; kesi ameliyatla temizlendi alan sınırları ötesine olmadığından emin olun. Altta yatan kas maruz elle cerrahi kelepçe veya cilt insizyonu ile açın. Fasyal düzlemde bacak uzunluğu boyunca çalışan görülebilir, siyatik sinir altında ve fasya ile bağlı iki kaslar arasındaki yatıyor. Bir çift sivri uçlu bir makas kullanarak, künt, siyatik sinir, kalın bir iplik kalınlığı beyaz bir doğrusal bir yapı olarak görünür olmalıdır maruz fasya yoluyla teşrih. </li><li> Bir çift sivri uçlu kavisli bir forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde altta yatan kas gevşeme, sinir altında teşrih; yükseltir ve sinir izole hem de. Bu konumu korumak için sinir altında forseps bırakın. Hamilton şırınga, iğne, sinir içine iğne sinirin alt yoluyla ponksiyon değildir, mümkün olduğu kadar sinir paralel olarak enjeksiyon açısını korumak için çalışıyoruz dikkatlice yerleştirin. İğne distal sinir sonuna doğru takılmalıdır omurga-omurilik doğru sinir içine tümör hücrelerinin enjeksiyonu aşılı tümör hücrelerinin omuriliğe yakın bir yakınlık kurar bulduk. Bu durumda, tümör hücrelerinin genellikle spinal kord fonksiyonu ele geçirmesine bağlı çalışma grubu hayvan erken kaybı sonucu, omurilik işgal. </li><li> Iğne sinir doğru konumlandırılmış sonra, dinlenmek ve forseps ile sinir üretilen gerilim yavaş yavaş 45-60 saniye içinde sinir hücreleri şırınga ile enjekte. Bu hızla şırınga içeriğini sürülmesi, enjeksiyon yeri ve onların kaybı çevresinde tümör hücreleri bir &quot;geri yıkama&quot; neden olacağı için, bu yavaş yavaş yapılabilir esastır. Tüm hücreleri başarıyla enjekte edildikten sonra, yavaş yavaş enjekte malzeme kaybı en aza indirmek için iğneyi çıkartın. </li><li> Için KaldırCEPS ve dikkatle kas altında orijinal konuma geri sinir yerleştirin. Cerrahi kesi Vetbond cerrahi yapıştırıcı ile kapatın. Tutkal kuruması için yaklaşık 20 saniye boyunca forseps ile birlikte kesi tutun. </li><li> Fare, burun konisi izofluran kaldırılır ve, kurtarmak için bir çarşaf kafeste tek başına yerleştirilir. Bu kafes, hayvan tamamen iyileşene kadar bir ısıtma yastığı üstünde tutulmalıdır. Bir ısıtma yastığı kurtarma kafesin parçası olmamalı, bu çok sıcak olsun, hayvan ısı uzaklaşmaya sağlar. Aşılama sonrasında, hayvanlar, site, topallık veya anoreksi çiğneme için düzenli olarak değerlendirilebilir; bu işaretler hayvan hala ağrı ve o uygun analjezikler verilmelidir göstergesi olabilir. Bu yordamı ile deneyim kazandıktan sonra, biz 30-40 farelerin kolayca tek bir gün içinde aşılı olabilir bulduk. </li></ol> 4. Çalışma Grupları Greft Başarı ve Randomizasyon Into Değerlendirilmesi <ol><li> Biyoparlaklık görüntüleme aşılama işlemi başarı değerlendirmek için kullanılır. Biz substrat, D-luciferase lusiferaz kimyasal reaksiyonun bir sonucu olarak üretilen tümör ifade ateşböceği lusiferaz ışık emisyon algılamak için bir IVIS-100 sistemi (aslen Xenogen, şimdi Kumpaslar A.Ş. olarak bilinir) . Bu görüntülerin analizi, özel aşılı farelerin terapötik deneme kohortlarında girmesi için uygun olup olmadığını belirler. Ön deneylerde, tümörler ve üreticinin Living Görüntü Yazılımı kullanarak faiz analizler bölgeden biyoparlaklık sinyalleri ile ilişkili tümör ağırlıklar hasat biyoparlaklık saptanabilir sinyalleri, kurban aşılı farelerin, sayısal var. Bu çalışmalar biyoparlaklık görüntüleme preklinik çalışmaların seyri boyunca xenograftlarının büyüme değerlendirmek uygun bir vekil anlamına gelir gösteren tümör greft ağırlıkları ve bioluminesans ışık yayma arasında doğrusal bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Genellikle, aynı zamanda görüntü 5 fareler. Biyoparlaklık görüntüleme hakkında ek ayrıntılar daha önce 7 yayımlandı . </li><li> Greft başarısını değerlendirmek için, biyoparlaklık görüntüleme 1 yapılır ve 3 gün sonrası aşılama. Görüntüler 2,5 mg D-luciferase intraperitoneal sonra aynı pozisyonda 10 dakika odaklı farelerde toplanır. Görüntüleme sırasında, fare, Xenogen görüntüleyici bir ısıtma yastığı ile 37 ° C&#39;de muhafaza izofluran anestezi ve vücut ısısı altında tutulur. Görüntü elde etme süreleri 2 saniye ile 10 dakika aralığında; veri toplama yazılımı hiçbir piksel görüntü toplama sırasında doymuş olduğunu sigortalanır. Tümör bölgelerinde (göreceli foton sayısı / sn) Işık emisyon Xenogen tescilli yazılım kullanarak ölçülür. Işık emisyon yoğunluğu, aynı zamanda toplanan farelerin siyah ve beyaz fotoğraflar üzerine yerleştirilmiştir biyoparlaklık Pseudocolor ölçekleme tarafından temsil edilmektedir. </li><li> Preklinik bir deneme kohort dahil alabilmek için, fare, hem de 1 ve 3 sonrası aşılama gün ve biyoparlaklık sinyal yoğunluğu gün 1 ile 3 arasında artış saptanabilir biyoparlaklık sinyal sahip olması gerekir. Bir azalma ya da statik sinyal Hayvanlar dışındadır. Buna ek olarak, aynı gün aşılanmış farelerde tespit sinyalleri birbirlerine büyüklüğü 1 düzen içinde olmalıdır, düşük veya aynı gün aşılı hayvanların tespit edilen daha yüksek büyüklükte bir sipariş biyoparlaklık sinyalleri ile farelerde de dışlanır. </li><li> Bir kez fareler, bu kriterleri yerine tedavi gruba randomize gerektiği tespit edilmiştir. Bunu başarmak için, aşılı farelerin tespit lusiferaz sinyalleri sonrası aşılama 3 gün önce yüksekten en düşük yoğunluk sıralanıyor;. Fare sonra, tedavi gruplarına yoğunluk sırasına göre atanarak, bu sırada geri ve daha sonra tüm fareler gruplara atanır kadar işlemi tekrarlayarak gruba randomize. Örneğin, 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4 tedavi grupları (örneğin, plasebo ve test ilacın üç konsantrasyonları) farelerde varsa gruplarına atanır , 4, 4, 3, 2, 1 .. vs. Tedaviye başlamadan önce, atanan grubun her bir üyesi tespit biyoparlaklık sinyalleri tüm gruplar içinde ortalama başlangıç ​​sinyalleri mümkün olduğunca yakın olduğundan emin olmak için ortalaması alınır. Aday terapötik ajan İdaresi 3 gün başladı. </li><li> Terapötik ajan tedavi seyri sırasında greft büyüme üzerindeki etkisini değerlendirmek için, biyoparlaklık görüntüleme başında tedavi bir hafta sonra (10, 17, 24, 30 sonrası aşılama) bir kez yapılır. Olmayan çıplak bağışık yetmezliği olan farelere için, bu hayvanları tekrar her görüntüleme oturumu gerçekleştirmeden önce Nair ile kaldırıldı yeni kürk büyüme olduğunu büyük önem taşımaktadır. Bunun nedeni, sinyal ne kadar kayıp belirleyen kat renk saç blokları bioluminescent sinyalleri. Örneğin, Swiss W gibi beyaz kürk bulundusiyah kürk gibi çok 9 10 kat olarak sinyalleri azaltabilir ebster fareler, bioluminescent sinyal yoğunluğu 8% 18 azalma sağlamaktadır. Ayrıca düzgün kürk regrowth tüm tedavi grupları ve tedavi grupları arasında &quot;normalleştirme&quot; sinyali azalmalar meydana gelecektir farz olamaz dikkat cekti. Terapötik ajan kendisi saç gelişimini etkileyebilir, çünkü bu. Örneğin, tamoksifen, tedavi, plasebo ile tedavi edilen farelerde ile kıyaslandığında tümör büyümesi üzerine, bu ajanın algılanan etkiyi en aza indirmek ve böylece saç regrowth inhibe ettiğini kaydetti var. </li><li> ST88-14 MPNST hücreleri, fare, 30 gün sonrası aşılama yapılabilir. Bu zamanda, tümörler genellikle kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından izin verilen maksimum boyutu büyüdü ve kurban gerekir. Son görüntüleme oturumun ardından, fareleri tedavi sonuçlarını (örneğin, terapötik ajan, ağırlık tayini için tümör dokusu, histoloji incelenmesi, Ki67 belirlenmesi ve TUNEL etiketleme endeksleri dolaşımdaki düzeylerinin belirlenmesi için kan ve daha fazla analiz için öldürüldü ve numuneler gerekli biyokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi) toplanır. Kesinlikle ne deneysel tasarım örneği toplandı ihtiyaçlarına bağlı olacaktır. </li><li> Tümörlü fareler (eksikliği de normal bakım ve kaçınma davranışları) hasta olduğunda, günlük olarak takip ve sona erdirilebilir, yemek ya da içmek mümkün değildir, ya da tümör aşırı büyük olur gibi normal vücut hareketini engellemek için. Tümör yükü hayvanın normal vücut ağırlığının% 10&#39;unu izin verilmemelidir. Vücut ağırlığının yüzdesi olarak tümör ağırlığı, yaş / cinsiyet eşleştirilmiş kontrol hayvanların kilo tümör taşıyan hayvanların ağırlığı karşılaştırılarak hesaplanır. Kaşeksi, klinik olarak anlamlı haline gelmesine izin verilmemelidir. Tümör taşıyan hayvanlarda kilo kaybı, normal vücut ağırlığının% 20 geçmemelidir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1 gözlenen biyoparlaklık tipik progresif olarak artış göstermektedir 1 ila 18 gün sonrası aşılama çıplak (NIH III) fare (AC) düzgün kurulmuş ortotopik xenograft. Biyoparlaklık sinyalleri sayısal bu sinyaller giderek artıyor olsa da, tümör büyümesini, belirgin bir şekilde çalışma süresi (Şekil 1D) daha sonraki aşamalarında hızlandırır gösterir aşılama 1-24 gün sonra gözlemledi. Titizlikle aşılanmış farelerde tümör büyümesini oluştu göstermek için, rutin olarak tümör epineurium rüptüre ve çevresindeki yumuşak doku ve iskelet kası, komşu doku işgal belirirse, siyatik sinir toplamak ve. MPNSTs agresif büyüme dikkate alındığında, biz sık sık aşılı tümör hücrelerinin sinir normal bariyerleri delinebilir ve komşu dokulara (Şekil 1E) işgal olduğunu bulmak şaşırtıcı değildir. Biz de sık sık bu aşılı MPNST proksimal ve greft distalinde sinir hücreleri agresif göç bulabilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/2558/2558fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 NIH III fare Biyoparlaklık görüntüleme orthotopically 1 gün sonrası aşılama lusiferaz etiketli MPNST hücreleri ile aşılı (A). Ilgi bölgesi (ROI) içinde farklı farelerde tespit edilen sinyaller birbirinden büyüklükte bir düzen içinde olduğunu unutmayın. Reimaging 10 gün (B) ve (C) 18 gün bireysel farelerde greft yerinde bioluminescent sinyalleri giderek arttığını göstermektedir sonrası aşılama. (D) Grafik-greftleme sonrası 1-24 gün greft sitesi üzerinden tespit edilen göreli sayıları foton / saniye ilerici artış gösteren. (E) Bu fare greft sitenin yüzey elde tümör büyümesi ve komşu iskelet kas içine odak işgali göstermektedir.

<ol>
	<li>Rosenberg, M. P., Bortner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+transgenic+and+knockout+animal+models+should+be+used+(for+drug+efficacy+studies+in+cancer).">Why transgenic and knockout animal models should be used (for drug efficacy studies in cancer).</a> Cancer Met. Rev. 17, 295-299 (1999).</li><li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+models+are+necessary+to+predict+therapy+of+transplantable+tumors+in+mice.">Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice.</a> Cancer Met. Rev. 17, 279-284 (1999).</li><li>Carroll, S. L., Ratner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+the+Schwann+cell+lineage+form+tumors+in+NF1?.">How does the Schwann cell lineage form tumors in NF1?.</a> Glia. 56, 1590-1605 (2008).</li><li>Woodruff, J. M., Kourea, H. P., Louis, D. N., Scheithauer, B. W., Kleihues, P., Cavenee, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathology and Genetics of Tumours of the Nervous System. , 172-174 (2000).</li><li>DeClue, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+expression+in+neurofibromatosis+type+1-related+tumors+and+NF1+animal+models.">Epidermal growth factor receptor expression in neurofibromatosis type 1-related tumors and NF1 animal models.</a> J. Clin. Invest. 105, 1233-1241 (2000).</li><li>Byer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen+inhibits+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+growth+via+an+estrogen+receptor-independent+mechanism.">Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth via an estrogen receptor-independent mechanism.</a> Neuro-Oncology. , (2010).</li><li>Zinn, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals.">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li><li>Wu, J. C., Sundaresan, G., Iyer, M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+optical+imaging+of+firefly+luciferase+reporter+gene+expression+in+skeletal+muscles+of+living+mice.">Noninvasive optical imaging of firefly luciferase reporter gene expression in skeletal muscles of living mice.</a> Mol. Therapy. 4, 297-306 (2001).</li><li>Luker, G. D., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luciferase+real-time+bioluminescence+imaging+for+the+study+of+viral+pathogenesis.">Luciferase real-time bioluminescence imaging for the study of viral pathogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 292, 285-296 (2005).</li><li>Dahlberg, W. K., Little, J. B., Fletcher, J. A., Suit, H. D., Okunieff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitivity+in+vitro+of+human+soft+tissue+sarcoma+cell+lines+and+skin+fibroblasts+derived+from+the+same+patients.">Radiosensitivity in vitro of human soft tissue sarcoma cell lines and skin fibroblasts derived from the same patients.</a> Int. J. Radiat. Biol. 63, 191-198 (1993).</li><li>Badache, A., DeVries, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibrosarcoma-derived+Schwann+cells+overexpress+platelet-derived+growth+factor+(PDGF)+receptors+and+are+induced+to+proliferate+by+PDGF.">Neurofibrosarcoma-derived Schwann cells overexpress platelet-derived growth factor (PDGF) receptors and are induced to proliferate by PDGF.</a> BB. J. Cell. Physiol. 177, 334-342 (1998).</li><li>Muir, D., Neubauer, D., Lim, I. T., Yachnis, A. T., Wallace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenic+properties+of+neurofibromin-deficient+neurofibroma+Schwann+cells.">Tumorigenic properties of neurofibromin-deficient neurofibroma Schwann cells.</a> Am. J. Pathol. 158, 501-513 (2001).</li></ol>

Burada sunulan ayrıntılı ortotopik xenografting yöntemi ST88-14 MPNST hücreleri kullanarak, bu NF1 ile ilişkili periferik sinir kılıfı tümörlerinin çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir çizgi geliştirdi. Ancak, bu yöntemi diğer MPNST hücre hatları ile preklinik çalışmalar için kolayca uyarlanabilir. Örneğin, biz de ST88 gözlenen benzer başarı ile STS-26T 10 hücreleri, NF1 ile ilişkili MPNST türetilmiş bir sporadik olarak ortaya çıkan MPNST ve T265-2c 11 hücreleri, türetilmiş bir çizgi ile xenografting ortotopik gerçekleştirdik -14 hücreleri. , Diğer MPNST hatların aşılama için biz burada açıklamak ST88-14 hücreleri xenografting ortotopik için tam koşulları doğrudan kabul edilmesi dikkat edeceğini söyledi olması. Bunun yerine, metodoloji temel parametreleri deneysel olarak her hücre hattı için tespit edilmelidir. Bu parametreler, başlangıçta aşılı MPNST hücrelerinin sayısı, bir dereceye kadar greft geliştirme ve izin süresi, ses tümör hücreleri enjekte edilir. Yeni bir satır için bu parametreleri kurmak için, biz büyüklük her sipariş (yani, 10, 5 x 3 hücre greft grupları, 10 3 5 x 10 6 tümör hücrelerinin (her grupta 5 fare) ile farelerde hücre konsantrasyonları kontrol 10 3 hücre, 10 4 hücreler, 5 x 10 4 hücreleri, vb.) Tümör hücreleri (&gt; 10 6) Büyük sayılar daha büyük bir hacim enjekte edilmelidir; 5 ml kadar aşılı sinir hücrelerinin kaybı olmadan enjekte edilebilir olduğunu bulduk. Ayrıca yoğun süspansiyonlar tümör hücrelerini öldürür kesme giderek daha eğilimli olarak 5 ml hacim başına en fazla 5 x 10 6 tümör hücreleri enjekte edilebilir olduğunu bulduk. , Her grup içinde en az üç hayvan, biz de o grubun feshedebilir ve bu noktada greft büyüme onaylamak için histolojik sinir incelemek palpabl tümörler, kadar bu farelerin izleyin. Genel olarak, biz, 30-60 gün içinde maksimum izin verilen tümör büyümesini ulaşacaktır hücrelerinin bir konsantrasyon arıyorlar; Açıkçası, enjekte edilen hücrelerin sayısına bağlı olarak, bu noktada farklı olacaktır ulaşmak için gerekli. Zor deney ve / sona ermesinden önce etkin terapötik konsantrasyonlarda ulaşmak ya da deneyler boyunca yeterli biyoparlaklık görüntüleme datapoints birikmesini önlemek için daha hızlı büyüme yapabilirsiniz. 60 günden daha uzun bir zaman ders deneysel parametreleri ayarlayarak hantal yapar ve gereksiz planlanan deneyler süresini uzatır. Son olarak, biz de tamoksifen 6 terapötik etkinliğini göstermek için, NIH III farelere aşılı ST88-14 hücreleri ile bu ortotopik xenografting metodoloji olduğuna dikkat edin. Biz rutin ortotopik xenografts aday terapötik ajanların etkilerini değerlendirmek için kullandıkları yöntemleri ayrıntılı bir açıklama bu yazının bulunabilir. Ayrıca nörofibroma hücreleri başarıyla değişiklikler ile, bu protokolde belirtilen usul nörofibromlar karşı yönettiği aday terapötik ajanlar ile klinik öncesi denemeler yapmak için kullanılan, 12 periferik sinir içine aşılı olduğunu kanıtlanmıştır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foxchase outbred SCID mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Charles River </td>
<td>#236</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NIH III mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taconic </td>
<td>#NIHBNX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NOD-SCID&gamma; mice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories </td>
<td>#005557</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Stripper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>25-056-cl</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vetbond surgical glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>1469SB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hamilton syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>#80030</td>
<td>10 &mu;L volume</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton syringe needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>#7803-05</td>
<td>33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)</td>
</tr>
<tr>
<td>Ear tags</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Band and Ear Tag Co.</td>
<td>1005-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmic ointment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dechra</td>
<td>NDC 17033-211-38</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents

In vitro ekranlarında aday terapötik ajanların ilk tanımlanması, ilaç, tümör büyümesini uygun bir hayvan modeli yapılmalıdır inhibe ettiği yeteneği titiz bir değerlendirme için gerekli olmasına rağmen . Bu amaç için en iyi hayvan modeli türü yoğun bir tartışma konusu. Bazı kanıtlar, transgenik farelerde ortaya çıkan tümörler ilaç etkilerini inceleyen klinik öncesi denemeler, klinik sonuç 1 daha öngörü ve bu yüzden aday terapötik ajanlar genellikle bu modellerin test gösterir. Ne yazık ki, transgenik modelleri birçok tümör türleri için mevcut değildir. Ayrıca, transgenik modeller genellikle insan meslektaşı tümör fenotip ve bir yetersizlik eksik penetrans tümörleri geliştirmek ne zaman ne kadar iyi tahmin etmek için fare tümör modelleri gibi endişeleri gibi diğer sınırlamaları vardır. Sonuç olarak, uygun transgenik tümör modellerinde mevcut değilse, birçok araştırmacı preklinik çalışmalar için xenograft modelleri (bağışık yetmezliği olan farelere insan tümör hücreleri içine aşılı) kullanın. Ikincisi tedavi aralıkları hızlı belirlenmesi kolaylaştırmak, transgenik modeller mevcuttur bile genellikle xenograft modelleri ile ortaklığa vardır. Ayrıca, bu ortaklık, transgenik tümörler ve hakiki insan tümör hücreleri ajanın etkinliğinin bir karşılaştırma sağlar. Tarihsel olarak, sıklıkla subkutan tümör hücreleri enjekte (ektopik xenografts) tarafından gerçekleştirilir olmuştur xenografting. Bu teknik, hızlı ve nispeten ucuz, tekrarlanabilir ve tedavi süresi 2 sırasında, tümör büyümesini sürekli kantitatif sağlar . Ancak, subkutan alan ektopik xenografting ile elde edilen en neoplazmlar ve bu yüzden sonuç için normal mikroçevresinin değildir konak doku ve tümör genlerin organ-spesifik bir ifade olmaması gibi faktörler nedeniyle yanıltıcı olabilir. Bu nedenle ektopik aşılama çalışmaları insan tümör hücreleri geldikleri doku (ortotopik xenografting) 2 aşılı olduğu çalışmalar tarafından değiştirilmesi veya tamamlanabilir tavsiye edilmiştir. Ne yazık ki, bu tavsiyenin uygulanması genellikle ortotopik xenografting metodolojileri henüz birçok tümör tipleri için geliştirilmiştir olduğu gerçeği ile bertaraf. Malign periferik sinir kılıfı tümörleri (MPNSTs) Nörofibromatozis tip 1 3 ve 4 siyatik sinir en sık ortaya çıkan sporadik veya dernek meydana gelen son derece agresif sarkomlar . Burada ateşböceği lusiferaz etiketli insan MPNST hücreler orthopically bağışık yetmezliği olan farelere siyatik sinir xenografted hangi bir teknik olarak basit bir yöntem tarif. Bireysel hayvanlar ve çalışma grupları içine sonraki olmayan önyargılı randomizasyon aşılama işlemi başarı değerlendirilmesi Bizim yaklaşımımız da tartışılır.

Watch this Scientific Journal Video about Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents at JoVE.c

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Lusiferaz etiketli insan malign periferik sinir kılıfı tümör hücreleri, bağışık yetmezliği olan farelere siyatik sinir grefti için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Biyoparlaklık görüntüleme, çalışma grupları içine hayvanların rastgele ayrımı için tümör greft ve kriterlere uygun kurulmasını göstermek için kullanımı da tartışılmıştır.

İnsan Takip edilen-Lusiferaz Malign Periferik Sinir Kılıf Tümör Hücreleri Ortotopik Xenografting In vivo</emAday Terapötik Ajanlar> Test

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

orthotopic-xenografting-human-luciferase-tagged-malignant-peripheral

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

18.5K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham - UAB. Lusiferaz etiketli insan malign periferik sinir kılıfı tümör hücreleri, bağışık yetmezliği olan farelere siyatik sinir grefti için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Biyoparlaklık görüntüleme, çalışma grupları içine hayvanların rastgele ayrımı için tümör greft ve kriterlere uygun kurulmasını göstermek için kullanımı da tartışılmıştır.

Video: Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Tıp

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most often results in failure of potential therapeutics designed for neurodegenerative disorders 1,2. Neurodegenerative diseases such as Spinal Muscular Atrophy (SMA), in which the lower motor neurons are affected, can benefit greatly from introducing the therapeutic agents into the CNS. The purpose of this video is to demonstrate two different injection paradigms to deliver therapeutic materials into neonatal mice soon after birth. One of these methods is injecting directly into cerebral lateral ventricles (Intracerebroventricular) which results in delivery of materials into the CNS through the cerebrospinal fluid 3,4. The second method is a temporal vein injection (intravenous) that can introduce different therapeutics into the circulatory system, leading to systemic delivery including the CNS 5. Widespread transduction of the CNS is achievable if an appropriate viral vector and viral serotype is utilized. Visualization and utilization of the temporal vein for injection is feasible up to postnatal day 6. However, if the delivered material is intended to reach the CNS, these injections should take place while the blood brain barrier is more permeable due to its immature status, preferably prior to postnatal day 2. The fully developed blood brain barrier greatly limits the effectiveness of intravenous delivery. Both delivery systems are simple and effective once the surgical aptitude is achieved. They do not require any extensive surgical devices and can be performed by a single person. However, these techniques are not without challenges. The small size of postnatal day 2 pups and the subsequent small target areas can make the injections difficult to perform and initially challenging to replicate.

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular ICV and Intravenous IV Injection in Mice

This article demonstrates two very different methods of injection: 1) into the brain (intracerebroventricular) and 2) systemic (intravenous) to introduce the therapeutic agents into the central nervous system of neonatal mice.

Fare intraserebroventriküler sayesinde Terapötik Ajanlar teslimi (ICV) ve intravenöz (IV) Enjeksiyon

Despite the protective role that blood brain barrier plays in shielding the brain, it limits the access to the central nervous system (CNS) which most ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes an artificial small guide RNA (sgRNA) to guide tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease, tRNase ZL, to recognize a target RNA. sgRNAs can be taken up by cells without any transfection reagents and can downregulate their target RNA levels and/or induce apoptosis in human cancer cells. We have screened an sgRNA library containing 156 heptamer-type sgRNAs for the effect on viability of human myeloma and leukemia cells, and found that 20 of them can efficiently induce apoptosis in at least one of the cancer cell lines. Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers. The protocol includes how to construct the sgRNA library, how to assess the effect of each sgRNA on cell viability, and how to further evaluate the effective sgRNAs by flow cytometry. Around 2,000 hits would be expected to be obtained by screening the full-scale sgRNA library composed of 16,384 heptamers.

Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers.

DOĞRU gen susturma: Potansiyel Kanser Tedavi Ajanlar için heptamer tipi Küçük Rehberi RNA Kütüphanesi Taranması

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

İnsan Takip edilen-Lusiferaz Malign Periferik Sinir Kılıf Tümör Hücreleri Ortotopik Xenografting In vivo Test