Los autores desean agradecer al Dr. Lars Philipsen para ayudar con la optimización de las películas intravital, el Dr. Jonathan Lindquist para leer detenidamente el manuscrito, y todos los miembros del laboratorio Gunzer útil para los debates y comentarios durante el desarrollo del método. Este trabajo fue financiado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) a MG

1. Infección <ol><li> Conidios hinchada del hongo Aspergillus fumigatus (ATCC 46645) son generados por la pre-incubación en medio RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlín, Alemania) suplementado con 5% FCS (v / v). 2x10 7 de descanso conidios se resuspenden en 5 ml de medio y se incubaron en una placa de tejido de 6 pocillos (TPP AG; Trasadingen, Suiza, catálogo # 92006) de 7 horas a 37 ° C. </li><li> Después del período de la inflamación, las esporas están marcados con fluorescencia mediante la adición de 10 l de solución calcofluor archivo (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Alemania, catálogo # F3543, [25 mg / ml] en DMSO) a cada uno de Aspergillus que contiene también en el de 6 pocillos placa, alcanzando una concentración final de calcofluor de 50 ug / ml RPMI. Después de mezclar suavemente, las esporas se incubaron durante 15 min a 37 ° C. </li><li> En el siguiente paso, las esporas se recogen por filtración a través de un filtro de 70 micras de células (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania). Después de lavar una vez con 10 ml de PBS (centrifugar a 900xg durante 5 minutos a temperatura ambiente), el sedimento se resuspende en 2 ml de PBS y el número total de conidios hinchada determinado por contar con una cámara de Neubauer. Por último, la suspensión de esporas se centrifuga a 900xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante se retira cuidadosamente, y se resuspendió el sedimento a la concentración final de 1x107 esporas por 100 l de PBS. </li><li> Para la infección, 100 l de solución de esporas se aplica por vía intratraqueal en ratones hembra (C57/BL6, 8-10 semanas de edad, Harlan, Alemania). Si los neutrófilos se observa, así, el uso de Lys-EGFP ratones, llevando EGFP bajo el promotor lisozima 1 se recomienda. Comience por anestesiar al animal con una única inyección ip de 150 l ketamina / Rompun solución (INRESA Arzneimittel GmbH, Freiburg, Alemania (ketamina) y Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania (Rompun), 1 ml de ketamina [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml estéril de NaCl [0,9%]). 5 minutos más tarde el ratón anestesiado se puede solucionar con una banda elástica de sus dientes a la rampa (es decir, una superficie inclinada) para facilitar la intubación (figura suplementaria 1). Con unas pinzas, la lengua es empujada hacia un lado y un catéter venoso 22G (B. Braun AG, Melsungen, Alemania, Vasofix Braunüle) puede ser insertado al interior de la tráquea con una iluminación permanente con una lámpara de cuello de ganso. El éxito de la inserción del catéter se verifica al observar el movimiento regular del tórax del animal con la frecuencia de la ventilación mecánica. Cuando la intubación exitosa ha sido confirmada, 100 l suspensión de esporas se aplica mediante una micropipeta 100 microlitros. Este volumen debe ser inhalado por el animal sin ningún tipo de ayuda adicional en 2.1 s. Una mejora de la distribución de partículas de hongos en el interior del pulmón se logra mecánicamente la ventilación del animal infectado durante 2 minutos con un respirador de pequeños animales (MiniVent, Hugo Sachs, de marzo de Hugstetten, Alemania) a una velocidad de 250 respiraciones por minuto y un volumen de inhalación de 300 l por aire (figura complementaria 2). Después de la infección los animales son devueltos a su jaula y observar cada 5 minutos hasta que de nuevo ambulatorio. Los ratones no muestran ninguna evidencia de dolor o malestar durante el período de incubación siguientes. </li></ol> 2. Preparación de pulmón <ol><li> 7 h después de la infección con las esporas, el animal es sacrificado por una sobredosis de isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Alemania) hasta que los movimientos y la respiración han cesado desde hace más de 30 segundos. Esto es seguido por la toracotomía como un método secundario para asegurar la muerte clínica y permitir la visualización y el acceso de la tráquea y los pulmones. A continuación, el pecho se abrió cuidadosamente para exponer el pulmón y el tracto respiratorio superior. Luego, otro catéter venoso 22G se inserta en la tráquea a partir de la epiglotis expuestos. A través de este túbulo los pulmones se llenan de 1 ml previamente calentada bajo punto de fusión de agarosa (2% w / v, Promega, Mannheim, Alemania), utilizando una jeringa de 1 ml Omnifix (B. Braun). Tan pronto como los pulmones se llenan de la tráquea se ata con un trozo de hilo de coser y todo el animal se coloca en un refrigerador a 4 ° C. </li><li> 15 minutos más tarde, cuando la agarosa se ha solidificado, todo el pulmón se extirpa a partir de la tráquea. Con un par de tijeras con punta afilada, el lóbulo del pulmón derecho se retira posteriormente, la superficie inferior secar brevemente en una hoja de papel de seda y luego el lóbulo entero está pegado a la preparación de bloques de un vibratome Vibroslice (Campden Instruments, Reino Unido, 752M ) con una gota de adhesivo tisular para la fijación (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania, Roti-Coll 1). Después de 1 min del bloque se ha instalado en la cámara de corte de la vibratome, que está lleno de pre-frío (4 ° C) PBS. El vibratome está en una vibración de gama media (5 de 10 max.) Y también una velocidad moderada (5 de 10 max.) De tal manera que una sección horizontal de lapulmonar se produce. La mitad superior del órgano se transfiere en una pequeña placa de Petri de plástico (5 cm de diámetro) donde se invierte y se fija con una arandela plana hecho a sí mismo (1 cm de diámetro interior), que está cubierto por un conjunto de hilos de nylon en paralelo, cada una de 1 mm de distancia (figura complementaria 3). Por último, la placa de Petri se llena con 10 ml de PBS suplementado con 10 l de ADN tinte Sytox naranja [5 mm] (Invitrogen, Alemania), resultando en una concentración final tinte de 5 micras. </li></ol> 3. 2-fotón láser microscopía <ol><li> La placa de Petri que contiene la muestra de pulmón se instala en el objetivo del microscopio para que el tampón puede ser calentado a 37 ° C por un sensor de temperatura controlada calentador (figura complementaria 4). 2-fotón microscopía A continuación se lleva a cabo sobre la superficie de corte general con un microscopio Zeiss LSM 710 NLO en un escenario vertical Axio forense equipado con un lente de agua 20xNA1.0 inmersión (Zeiss, Jena, Alemania). Para las imágenes, las diferentes áreas a lo largo de la sección se analizan hasta una profundidad de 400 m con una longitud de onda de luz de 800 nm para detectar verde (530 nm) y rojo (580 nm) de fluorescencia, así como la generación de segundo armónico (SHG)-de la señal y la azul calcofluor fluorescencia (en nm de emisión 400-470) con detectores externos no descanned (NDD). Además de imágenes 2-D y las películas de lapso de tiempo (1 imagen cada 5-10 segundos), única o repetitiva de 3 dimensiones pilas de imagen puede ser entregado después de las representaciones voxel o solo las imágenes se enfocan extendida o 4-D de datos (en 3D a través del tiempo), utilizando diferentes paquetes de software. Esta configuración permite la observación microscópica del comportamiento celular en un ambiente casi intacto que, puesto que constituye la puerta de entrada para una variedad de patógenos de transmisión aérea, es de importancia inmunológica enorme. La motilidad celular, la fagocitosis y la producción neta de los neutrófilos después de la infección endógena con el hongo Aspergillus fumigatus puede ser fácilmente investigado bajo estas condiciones in situ. </li></ol> 4. Resultados representante Si se realiza correctamente la imagen va a generar 2 - o 3-color diapositivas o películas. A pesar de colorante se realiza en un procedimiento de post-proceso y por tanto libremente adaptable, por lo general, seleccionar un esquema de colores que refleja el color natural de la tinta / de la señal, la cual es detectada en el canal de relación. Por lo tanto, los tintes Sytox se muestran en rojo, los hongos, así como la señal de los grupos de autoayuda se muestra en azul y, si está presente, EGFP-etiquetados células se tiñen de verde. En el primer ejemplo (Fig. 1) la señal de los grupos de autoayuda azul representa las fibras del tejido de un pulmón no infectados y el rojo de la señal Sytox es producida por los núcleos de las células residentes de pulmón a cielo abierto por el vibratome. En el segundo ejemplo (Fig. 2) un pulmón infectado se muestra, en ambas estructuras, alveolar, así como las masas de hongos, aparecen en azul, mientras que los núcleos y los Nets se tiñen de rojo. El tercer ejemplo (Fig. 3) es de un animal de Lys-EGFP transgénicos, donde además de las estructuras de azul y rojo los neutrófilos verde también puede ser visto. La migración de neutrófilos y su fagocitosis de cada uno de los elementos fúngicos en las secuencias de lapso de tiempo se muestra en la película suplementario. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La aparición de un trozo de pulmón no infectadas en dos colores de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón fue preparado a partir de una no infectada C57/BL6 del ratón y la imagen como se describe en el protocolo. Aquí se presentan son la señal de los grupos de autoayuda de la estructura del tejido alveolar (A), la señal Sytox de los núcleos celulares a cielo abierto durante la preparación de la porción de pulmón (B), y una superposición de los dos canales (C). El área del recuadro en (C) se ve ampliada en (D). Tenga en cuenta el tejido fibroso en la parte inferior del pulmón rebanada en comparación con la organización claramente alveolar en las áreas activas de respiración de los pulmones de arriba. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La aparición de un trozo de pulmón de un animal infectado Aspergillus tipo salvaje en dos colores de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón de un ratón infectado C57/BL6 7 h antes con A. fumigatus fue preparado y la imagen como se describe en el protocolo. Se muestra la estructura combinada de hongos y los grupos de autoayuda del tejido alveolar (A), la señal de NET Sytox ADN, así como núcleos de las células a cielo abierto durante la preparación de la porción de pulmón (B), y una superposición de los dos canales (C) . El área del recuadro en (C) se ve ampliada en (D). Tenga en cuenta que las áreas claramente diferenciadas de las masas de hongos, los alvéolos, y las estructuras de NET-están marcados con las letras F, A y N, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La aparición de un trozo de pulmón de una infección por Aspergillus Lys-EGFP animales en 3-color de 2 fotones microscopía. Un trozo de pulmón de ratón Lys-EGFP infectados 7 h antes conA. fumigatus fue preparado y la imagen como se describe en el protocolo. Se muestra la estructura combinada de hongos y los grupos de autoayuda del tejido alveolar (azul), la señal Sytox de los núcleos celulares y redes (rojo), así como numerosos neutrófilos (verde). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Figura 4" /> Adicional Figura 1. La fijación del ratón para la intubación. Bajo ketamina / Rompun anestesia del animal se fija con una banda elástica en los dientes con el fin de facilitar la intubación con un catéter venoso 22G. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Figura 5" /> Complementaria la figura 2. Ventilación mecánica del ratón. El ratón intubados está infectado por una aplicación informática de 1x10 7 esporas se resuspendieron en 100 l de PBS. Una mejora de la distribución de partículas de hongos en el interior del pulmón se logra mecánicamente la ventilación del ratón infectado con un respirador de pequeños animales. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Figura 6" /> Complementaria la figura 3. La fijación del pulmón lóbulo. Después de la preparación del lóbulo del pulmón derecho el órgano se fija en una placa de Petri por el uso de una lavadora de laboratorio hechas plana que está cubierto por un conjunto de hilos de nylon en paralelo. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Figura 6" /> Adicional Figura 4. Dos fotones de imágenes de instalación. La placa de Petri que contiene el lóbulo del pulmón derecho se instala sobre una estera de calefacción bajo el microscopio de 2 fotones después de la adición del ADN tinte Sytox Orange. Suplementario película:. Neutrófilos Los neutrófilos migran y phagocytosing elementos fúngicos en los pulmones infectados por Aspergillus como se ve por lapso de tiempo de 2 fotones microscopía de un trozo de vida de pulmón 7 h después de la infección con el hongo son elementos verdes, hongos y los grupos de autoayuda son de color azul, y los núcleos celulares como NET así como las estructuras se representan en rojo. El tiempo real del experimento se muestra en la parte inferior derecha. La barra de escala representa 50 micras. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">Haga clic aquí para ver el video</a>

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En tiempo real de 2 fotones microscopía in vivo o en los órganos intactos ha adquirido gran importancia en estudios sobre la fisiología de las células inmunes en los últimos 10 años. Fue con esta técnica que los eventos importantes como la dinámica de la activación de células T en los ganglios linfáticos apareció por primera vez 2-4. Más recientemente, los investigadores también han comenzado a analizar las funciones celulares específicas, como los primeros pasos en la generación de células efectoras en los tejidos linfáticos utilizando este método 5. Sin embargo, a pesar de una serie de nuevos conceptos biológicos han puesto de manifiesto con este método, todavía hay un reto importante y las preguntas para las que no hay estudios de visualización intravital se han publicado hasta el momento. Cabe destacar que esto se aplica a los pulmones de mamíferos. El aspecto interesante de este órgano, como el puerto de entrada para una gran variedad de agentes patógenos en el aire, hace que sea una de las superficies más importantes en los procesos inmunológicos que tienen lugar en el cuerpo de los mamíferos. Con cada respiración durante todo el ciclo vital, las partículas no deseadas se inhalan algunos de los cuales tienen el potencial de inducir infecciones que amenazan la vida 6. Se explica por sí mismo que en un sitio tan sensible y en peligro de extinción a la densa red de mecanismos de defensa tiene que estar presente exhibiendo todo el repertorio de las respuestas inmunes. Por otro lado, es muy importante que la lucha inducida inmunológica contra patógenos potenciales en una &quot;sucia&quot;, el lugar está estrechamente controlada. Reacciones exageradas del sistema inmunológico tienen un alto riesgo de dañar el propio cuerpo de forma masiva por dañar el tejido del órgano a la estimulación no específica de las acciones de las células inmunitarias 7,8. A la luz de estas ideas que sería muy interesante y útil tener la posibilidad de investigar el comportamiento de células en los pulmones de los mamíferos en realidad en condiciones in vivo. Sin embargo, el hecho de que un sistema hasta ahora no ha sido implementado con éxito apunta claramente a las enormes dificultades que tienen que ser resueltos en el establecimiento de un protocolo de trabajo. El reto más exigente, probablemente es la estabilidad de enfoque. El pulmón como órgano responsable de la respiración está en movimiento constante en las tres direcciones del espacio para realizar la inhalación. Esta circunstancia por sí sola causa graves problemas de imagen y se puede considerar un intravital de imágenes &quot;pesadilla&quot;. Ya un ligero movimiento a cualquier dimensión en el espacio tiene un efecto masivo deterioro en la visión microscópica, que debe ser estable con precisión micrométrica a fin de generar imágenes significativas 9. Dado su enfoque local por sí apretado 10, de 2 fotones microscopía es aún más sensible a la inestabilidad de actividad, como la dislocación de una cierta estructura en el rango de sólo unos pocos micrómetros en la dirección Z es equivalente a una pérdida completa de la atención y por lo tanto un experimento fallido. El protocolo presentado en este estudio para la observación de las células inmunes en el pulmón murino todavía no es una aplicación in vivo, sino más bien una aproximación a la situación en un pulmón funcionalmente intacto 11. Enfoques ex vivo de linfocitos de imagen, por ejemplo, en la linfa explantados nodos, se ha demostrado que se obtienen resultados equivalentes a los verdaderos en 12 observaciones in vivo y por lo tanto son muy relevantes 5. El observaciones in situ en cortes de pulmón, que sólo son posibles con nuestro enfoque, tendrá lugar en un pulmón infectado poco después de la escisión. La integridad en 3D en el proceso de corte está garantizada por la matriz de agarosa, un paso esencial para permitir un proceso controlado con precisión de corte de los pulmones. A pesar de que es necesario enfriar el pulmón explantado por un período corto para permitir una solidificación de la matriz de agarosa, es posible volver a cerca de las condiciones fisiológicas de las células después del corte y el recalentamiento de los tejidos. Esto se demuestra claramente por los datos que demuestran que en estas condiciones, los neutrófilos son muy activos y exhibir todo su potencial como fagocitos ágil, que son necesarios para el despacho eficaz de una infección por Aspergillus fumigatus. Ellos patrullan el tejido pulmonar que pasa a través de las barreras epiteliales a fin de alcanzar la parte interior de los alvéolos y, además, que asuma activamente esporas de hongos 11. Un hallazgo clave de este trabajo fue la aparición de estructuras similares a las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) en el órgano Aspergillus infectados. NET son un hallazgo muy reciente de un nuevo mecanismo de defensa de los neutrófilos 13. Sin embargo, desde su descripción inicial en 2004, el número de condiciones fisiológicas o patológicas en modelos animales o humanos, donde se ha observado este fenómeno o se carece ha sido explosivo aumento de 14 a 16. Curiosamente, a pesar de tanto trabajo se ha gastado en estas estructuras por parte de grupos muy diferentes, la mayoría de los informes siguen siendo en un nivel muy descriptivo y no es muchosabe sobre el mecanismo de liberación NET y su regulación. Con nuestro protocolo hemos sido capaces por primera vez para mostrar las fibras NET en un pulmón infectado. Además, hemos podido demostrar la importancia de los neutrófilos recién reclutados, así como las estructuras moleculares de hongos para su ocurrencia o la inhibición 11. Esto demuestra claramente el potencial de nuestro método para investigar los pasos individuales de la formación de NET con más detalle. Uno podría pensar, por ejemplo, utilizar los neutrófilos de ratones knock-out adecuado para observar su capacidad de formación de NET en los experimentos de transferencia adoptiva. Así, aunque la observación directa de la inmigración de neutrófilos de la sangre periférica no es posible con este sistema debido a la falta de suministro de sangre después de la explantación de órganos, todavía creemos que el protocolo es un enfoque valioso y relativamente fácil de manejar que permite la proyección de imagen de pasos temprano o tarde en la defensa inmune contra las infecciones pulmonares. Esto es, por tanto, un paso importante para la investigación de este fenómeno en el pulmón de respiración de los animales vivos.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

Después de que el tracto gastrointestinal, el pulmón es el segundo mayor superficie para la interacción entre el cuerpo de los vertebrados y el medio ambiente. En este caso, un intercambio de gases eficaz debe mantenerse, mientras que al mismo tiempo evitar la infección por patógenos múltiples que se inhalan durante la respiración normal. Para lograr esto, un magnífico conjunto de estrategias de defensa que combina los mecanismos de inmunidad humoral y celular existe. Una de las medidas más eficaces para la defensa agudo de pulmón es el reclutamiento de neutrófilos, que fagocitan a los patógenos ya sea inhalado o matarlos por la liberación de productos químicos citotóxicos. Recientemente se ha incorporado al arsenal de los neutrófilos es su liberación explosiva de ADN extracelular-NET mediante el cual las bacterias o los hongos pueden ser capturados o inactivadas, incluso después de la liberación de las células NET han muerto. En este trabajo presentamos un método que permite observar directamente los neutrófilos, que migran dentro de un pulmón infectado recientemente, phagocytosing hongos patógenos, así como visualizar la TNE extensas que se han producido en todo el tejido infectado. El método describe la preparación de rodajas de pulmón viable siete horas después de la infección intratraqueal de ratones con conidios del hongo Aspergillus fumigatus y su examen por multicolor lapso de tiempo de 2 fotones microscopía. Este enfoque permite investigar directamente la defensa antifúngico en el tejido pulmonar nativa y por lo tanto se abre una nueva vía para la investigación detallada de la inmunidad pulmonar.

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K vistas.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

Video: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Asistida por microondas diagnóstico rápido de enfermedades de virus de plantas por microscopía electrónica de transmisión

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Investigación

Inmunología e Infección

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

El estudio de las interacciones de<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.