Pseudomonas aeruginosa es un patógeno de nivel BSL-2. Recuerde seguir todas las prácticas de seguridad de nivel BSL-2 al manipular este organismo. Aquí demostraremos aislamiento de células primarias, fagocitosis in vitro, y análisis de vías fagocíticas, y fagocitosis in vivo y evaluación del aclaramiento bacteriano en ratones.
La entrega intratraqueal exitosa requiere práctica para dominar. Asegúrese de que el microsprayer esté correctamente cargado, que la aguja esté entre los dos pliegues vocales y que la velocidad del émbolo esté controlada correctamente. Comience asegurando el ratón en la posición supina con las extremidades extendidas en una mesa de disección cubierta con toallas de papel y enganchando una cuerda debajo de los dientes delanteros para retraer la cabeza de modo que la tráquea se posicione recta y nivelada.
Desinfecta el ratón con 70% de etanol y usa fórceps regulares para tirar de la piel en la línea central del cuerpo. Usa tijeras quirúrgicas para cortar la piel desde el abdomen hasta la parte superior de la garganta. Utilice el extremo romo de las tijeras quirúrgicas estándar para diseccionar cuidadosamente el músculo de la garganta y los tejidos conectivos.
Abra la pared abdominal debajo de la caja torácica. Corte el diafragma y corte la parte inferior de la caja torácica para exponer parcialmente los pulmones. Usa tijeras de resorte para exponer la tráquea y usa los fórceps para agarrar un anillo de cartílago.
Utilice micro tijeras para hacer cuidadosamente una incisión de aproximadamente 1,5 milímetros en la cara ventral de la tráquea. Enrosque cuidadosamente una longitud corta de hilo de sutura debajo de la tráquea e inserte una cánula de calibre 18 en la tráquea. Cuando la cánula esté en su lugar, lave suavemente el pulmón tres veces con un mililitro de PBS fresco por lavado, retirando suavemente el líquido en la jeringa antes de reinfundarlo de nuevo en el pulmón tres veces consecutivas.
Después de cada lavado, transfiera el líquido de lavado broncoalveolar recogido o BALF a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación del líquido cosechado total. Resuspender el pellet en un mililitro de PBS fresco para una segunda centrifugación y resuspender los macrófagos alveolares lavados en dos mililitros de Dulbecco Modified Eagles Medium o DMEM complementado con 10%suero bovino fetal no térmico. Luego transfiera los macrofagos alveolares primarios a un plato de Petri de fondo de vidrio para su cultivo de dos días a 37 grados centígrados en una incubadora celular.
Después de 48 horas, lave el cultivo con un mililitro de PBS antes de alimentar el cultivo con dos mililitros de medio fresco. A continuación, agregue 50 perlas conjugadas de látex carboxilada de dos micrómetros por célula al cultivo para una incubación de una hora a 37 grados centígrados en una incubadora celular. Al final de la incubación, lave la placa extensamente cinco veces con un mililitro de PBS fresco por lavado para eliminar las cuentas extracelulares e imágenes aleatorias de 100 células para contar las células que contienen cuentas intracelulares.
Para un ensayo de opsonización, incubar dos veces 10 a los octavos glóbulos rojos o SRBCs con 50 microlitros de inmunoglobulina M o IgM anti-SRBC de conejo durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, incubar los SRBC opsonizados con 50 microlitros de suero humano con deficiencia de C5 durante 30 minutos a 37 grados Celsius para fijar los fragmentos de complemento de inhibidores C3b y C3b en los SRBC recubiertos con IgM. A continuación, aspirar los medios y añadir 100 microlitros de una vez 10 a los siete SRBC opsonizados por mililitro de medio a cada pozo de una placa de 96 pozos que contiene una por 10 a la cuarta sencrógelos murinos cultivadas durante la noche por pozo.
Incubar la cocultura de macrófagos de ratón SRBC durante una hora a 37 grados Celsius y luego retirar los SRBC no unidos lavando con 100 microlitros de tólizar de lyisis de potasio de cloruro de amonio durante un minuto. Después de retirar los SRBC no enlazados, enjuague con 100 microlitros de medios. Lyse las células restantes con 0,1%dodecil sulfato sódico y tratar los licatos con 50 microlitros de 2, 7-diaminofluoro complementado con 3%peróxido de hidrógeno y seis urea molar.
A continuación, mida la absorbancia de la formación azul de fluoreno catalizada por hemoglobina en un espectrofotómetro a 620 nanómetros. Utilice una curva estándar a valores de absorbancia de 620 nanómetros con el número conocido de SRBCs para determinar el número de JURC opsonizados que se fagoctividadn. Para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor de reconocimiento de patrones, lave los macrófagos alveolares primarios de ratón cultivados de dos días con un mililitro de PBS y trate las células con 500 microlitros de medio fresco que contienen 100 Alexa fluor-488 conjugadas Zymosan-A-biopartículas.
Después de una hora a 37 grados celsius, detén la fagocitosis con 500 microlitros de PBS helado y lave las células extensamente cinco veces con un mililitro de PBS por lavado. Después del último lavado, fijar las células con 4%paraformaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente y lavar las células cinco veces más como se ha demostrado. Después del último lavado, cubra las células con 500 microlitros de PBS fresco para la toma de imágenes bajo contraste de interferencia diferencial y canal fluorescente a 488 nanómetros para cuantificar el número de macrófagos alveolares que contienen Zymosan-A-biopartícula.
Para la evaluación de la fagocitosis macrófago alveolar in vivo, confirme el nivel adecuado de sedación por falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo en un ratón anestesiado y coloque el ratón sobre una placa plana con un alambre de plástico debajo de los incisivos superiores. Coloque el ratón en una tribuna semi-recumbenta en una posición de 45 grados con la superficie ventral hacia arriba y utilice fórceps curvos para extraer y suprimir la lengua. A continuación, inserte un microspropación entre los pliegues vocales para administrar por vía intratrache 50 microlitros de cinco veces 10 a las seis unidades formadoras de colonias de P.aeruginosa GFP en los pulmones del animal anestesiado.
Para confirmar que la aguja del microsprayer está en la tráquea, mueva suavemente la jeringa y observe los pliegues vocales a ambos lados de la aguja. Una hora después de la infección, recoger el líquido de lavado como se acaba de demostrar y peletizar los macrófagos alveolares por centrifugación. Resuspender una vez 10 a las terceras células en 100 microlitros de PBS fresco para citocentrífuga en un portaobjetos de vidrio.
A continuación, mancha diferencialmente los portaobjetos para macrófagos alveolares, neutrófilos y linfocitos, de acuerdo con los protocolos histoquímicos estándar. Seleccione aleatoriamente 100 macrófagos alveolares para cuantificar el porcentaje de células que fagocitosis bacterias. En el primer ensayo de aclaramiento de bacterias in vivo, inyectar por vía intratrache una dosis subletal de aproximadamente 2,5 a cinco veces 10 las quintas unidades formadoras de colonias por mililitro de P.aeruginosa en ratones de tipo salvaje y mutantes anestesiados y medir el peso corporal de cada animal todos los días durante seis días.
En el segundo ensayo, inyectar un nuevo conjunto de ratones mutantes y de tipo salvaje con un letal tres veces 10 a las siete unidades formadoras de colonias por mililitro dosis de P.aeruginosa y registrar la mortalidad dentro de los dos días de una inyección, recogiendo todo el tejido pulmonar en el momento de la muerte o dos días después de la inyección para la cuantificación de la carga bacteriana pulmonar en el pico de la infección. Después de cosechar los pulmones, cortar las muestras pulmonares en pequeños trozos de hielo y homogeneizar los fragmentos pulmonares utilizando un ajuste de homogeneizador eléctrico ajustado. A continuación, placa 100 microlitros de homogeneizar sobre placas de agar de aislamiento Pseudomonas en diluciones seriales de 10 veces.
La microscopía de fluorescencia revela que la fagocitosis de macrófago primario de ratón de las cuentas de látex FITC ocurre después de una hora de incubación, con macrófagos knockout TRIM72 que demuestran una capacidad fagocítica significativamente mayor. Por el contrario, la sobreexpresión de TRIM72, una proteína con función desconocida en células de macrófagos murino, da como resultado una disminución de más de cinco veces en la fagocitosis del complemento. Las partículas conjugadas con fluor-488 de Alexa, sin embargo, son ingeridas en igual cantidad por los macrófagos alveolares primarios aislados de ratones de tipo salvaje o knockout.
La tinción diferencial de BALF cosechada a partir de animales salvajes y knockout revela un número similar de macrófagos, pero una mayor capacidad fagocítica para los macrófagos cosechados de ratones knockout. Además, los ratones knockout TRIM72 demuestran una recuperación más rápida de sus pesos corporales, mantienen su supervivencia y presentan una carga bacteriana menor que los animales de tipo salvaje después de la administración intratraqueal de P.aeruginosa. Usando esta técnica, se pueden analizar otros procesos fagocíticos que son importantes para la neumonía como la fagocitosis de neutrófilos y la contribución relativa de otros fagocitos en el aclaramiento de bacterias.
En combinación con inhibidores farmacológicos, transferencia adaptativa y animales transgénicos, esta técnica puede ayudar a los investigadores a explorar el componente molecular de un tipo específico de fagocitosis para los fagocitos de interés.
