Nos gustaría agradecer al Dr. David Olivieri para la revisión crítica de este manuscrito, el Dr. Nuno Moreno por la ayuda logística para construir nuestro titular de los animales y las almohadillas térmicas y el Dr. Vijay K. Kuchroo para la donación tipo de Foxp3-KI GFP / GFP ratones. Este trabajo es apoyado por la &quot;Fundação párrafo Ciência e Tecnologia&quot; (FCT, Portugal), subvención # PTDC/EBB-BIO/115514/2009.

1. Animal preparación Notas importantes: BM suspensiones celulares y trasplantes de timo se han realizado en condiciones asépticas. Las suspensiones se prepararon BM dentro de las campanas de la sala de cultivo celular, mientras que el trasplante de timo se llevó a cabo en la sala de operaciones ubicado dentro de nuestras instalaciones para animales. A fin de mantener y garantizar estas condiciones asépticas, no se nos permitió grabar nuestro video en esos lugares. Sin embargo, todo el material quirúrgico se autoclave y el banco quirúrgica fue limpiada previamente con Virkon (Pharmacal Research Laboratories, Inc.) y el 70% de etanol. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) y que estaban de acuerdo con la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA) directivas. El número de identificación de aprobación es AO10/2010. Todos los experimentos de imagen fueron los procedimientos terminales y los animales fueron sacrificados inmediatamente después del final de la imagenadquisición. El procedimiento detallado es el siguiente: <ol><li> Irradiar (con γ-irradiador) 8 semanas de edad ratones atímicos con 900 rads para destruir los precursores hematopoyéticos endógena dentro del hueso calabacines (BM). Después de la irradiación, el retorno de los animales a sus jaulas hasta que preparar las células del donante BM para inyección intravenosa y la reconstitución BM más. Esta transferencia se realizó BM 1 h después de la irradiación. </li><li> Separar los animales donantes BM. Tibias y fémures de las patas traseras de un animal son generalmente suficientes para reconstituir hasta 3 animales receptores. Después de la eutanasia con CO 2, quite las patas traseras y luego retire la piel y los músculos de los huesos. </li><li> Corte el extremo cerrado de cada hueso y enjuague con PBS (o RPMI) o aplastar a todos en un mortero, usando una mano de mortero, con 2 ml de PBS (o RPMI) para eliminar el BM. </li><li> Alterar la estructura BM en una suspensión de una sola célula por la repetición de la aspiración vigorosa using una pipeta P1000. Si lo prefiere, también puede pasar el BM a través de una aguja de la jeringa 21G en varias ocasiones. Se centrifuga (400 g, 5 min, RT), volver a suspender las células en PBS, y se inyecta por vía intravenosa en el nude-irradiados destinatarios. En nuestros experimentos hemos utilizado BM de Foxp3-KI GFP / GFP ratones en todas las células T reguladoras (Tregs) se expresan GFP 1. </li><li> La aceptación de la BM de los donantes se produce en los primeros días después de la transferencia, ya que no-BM-reconstituido animales no pueden sobrevivir más de 14 días. Sin embargo, se debe esperar de 4 a 6 semanas para permitir la recuperación plena de todos los compartimentos BM. Bactrim (Roche) fue introducido en el agua (2 mg / ml) durante la primera semana después de la irradiación para disminuir el riesgo de infecciones bacterianas. </li><li> Timo embrionario trasplante ya ha sido descrito 2. En pocas palabras, empezar a criar pares de ratones isogénicas y comprobar para conectar (pruebas del coito) todos los días. Mujeres por separado y conectado a CO 2-eutanasia en el día 15 de pregnAncy (observación de enchufe es el día 1 de embarazo). La toma de embriones y timos de la. Coloque los timos de embriones en PBS frío hasta que la transferencia. </li><li> Para llevar a cabo el trasplante de timo, anestesiar BM-receptor ratones desnudos con ketamina (120 mg / g de peso del ratón) / xilazina (16 mg / g de peso del ratón) y mantenerlos en la cima de una almohadilla térmica a 37 ° C hasta que se inconsciente. </li><li> Exponer quirúrgicamente el riñón para realizar el trasplante de los timos. Primero frote la piel con ChloraPrep (CareFusion Inc.) y el 70% de etanol. Entonces, hacer un corte de 1 cm en la piel de la parte del cuerpo posterior-lateral del animal, de 2 mm por debajo de la costilla torácica anterior. </li><li> Cortar la cavidad peritoneal y sacar el riñón de esta cavidad. Hacer un pequeño corte superficial en la cápsula renal con una hoja de bisturí. El uso de pinzas con una punta muy fina que una bolsa debajo de la cápsula del riñón del ratón receptor y añadir hasta 4 lóbulos del timo en esta bolsa. </li><li> Coloque la b riñón<html> acuse de recibo a su lugar, la sutura de la cavidad peritoneal con uno o dos puntos de sutura y cierre de la piel del ratón usando el método de sutura mismo. Por otra parte, las suturas se puede hacer usando pegamento quirúrgico. </li><li> Inyectar analgésico (butorfanol a 5 mg / kg) por vía subcutánea justo después de terminar la cirugía para evitar el dolor de los animales y mantener a los animales en un cojín de la calefacción hasta que empiezan a recuperarse de la anestesia. Los ratones son alojados en jaulas individuales para los 3 primeros días después del trasplante para evitar que sus compañeros de jaula de la eliminación de los puntos de sutura. Quitar puntos de sutura después de 1 semana. </li><li> Ratones desnudos no tienen células T. Por lo tanto, se puede evaluar la aceptación del trasplante de timo mediante el control del porcentaje de células CD4 + o linfocitos T CD8 + en la sangre. Una vez por semana, 2 semanas después de trasplante de timo, sangrar a los animales y la mancha de sangre con anticuerpos anti-CD4 y CD8 anti-anticuerpos monoclonales (MAb). Cuando los CD4: CD8 es de aproximadamente 2:1, el timo trasplantado es totalmente funcional (Figura 1). </li></ol>&quot;&gt; 2. Adquisición de la imagen intravital Prepare todos los materiales que se necesitan por adelantado y puso a un lado. <ol><li> Anestesiar a los animales con ketamina / xilazina (mismas dosis descritos en el punto 1.5) y colocarlos en la parte superior de un cojín de la calefacción a 37 º C. Inyectar 100 l de rodamina B isotiocianato de dextrano (20 mg / ml en PBS) por vía intravenosa para permitir la visualización de futuro, el flujo de sangre. </li><li> Exponer el riñón que contiene el timo trasplantados de acuerdo con el protocolo previamente descrito en el punto 1.6. </li><li> Para evitar que los riñones vuelvan a su posición original, cerca de las caras laterales de la incisión de la piel con puntos de sutura. </li><li> Coloque un trozo de algodón empapado de PBS en la parte superior del órgano para mantenerlo húmedo. </li><li> Ponga la almohadilla en la parte superior de la etapa de titular de animales (Figura 2). </li><li> El sacrificio del animal en la parte superior de la almohadilla en el soporte de los animales, por órgano (Figura 2B). </li><li> Pellizcar el órgano en ambos lados con una abrazadera de mADE de papel de aluminio delgado (Fig. 2C). </li><li> Cierre el soporte de los animales y el lugar de la sonda de calor superior lo más cerca posible a los tejidos (Figura 2). Esta sonda de calor mide constantemente la temperatura de órganos y envía esta información al calentador para ajustar la corriente eléctrica, manteniéndolo a 37 ° C. </li><li> Retire el algodón empapado en PBS y añadir bajo punto de fusión de agarosa (2% en PBS) a 30 ° C en la parte superior de su preparación. </li><li> Cubrir toda la preparación con el calentador superior (Figura 2E). En la apertura de este calentador hay un cubreobjetos aislar la agarosa del objetivo (Figura 2F). Monitor de la anestesia del ratón e inyectar un impulso a mitad de dosis cada 40 minutos. Después de la adquisición de la imagen, la eutanasia de los animales con CO 2. </li></ol> Nota: las imágenes del clip de papel de aluminio y el calentador superior se presentan en la Figura 3. 3. De dos fotones de imagen de adquisición Se utilizó un pie &quot;Prairie Ultima XY&quot; microscopio de dos fotones. Nuestro sistema está equipado con un Ti: Sapphire láser, cuatro PMT parte superior de traducción simultánea de hasta 4 canales de adquisiciones y un objetivo de inmersión en agua 20x. <ol><li> Encienda el Ti: Zafiro con láser y el sistema de microscopio conjunto. </li><li> Añadir espejos dicroicos y juegos de filtros de acuerdo a las longitudes de onda deseada. En nuestro caso hemos utilizado un titular de Chroma-Olympus BX2 que contiene un espejo de 565 nm dicroicos, un 525/50 nm filtro (para la señal de Foxp3-GFP), y un 595/50 nm filtro (por Dextran-Rodamina-B de la señal dentro de los vasos sanguíneos ). El rango de longitud de onda de láser utilizado fue entre 880 a 900 nm. </li><li> Añadir el titular de los animales al microscopio, conectar y encender todas las estufas, se añade agua en el calentador de la apertura superior, baje cuidadosamente el objetivo en el agua, y se centran en un buque o algún Tregs GFP. </li><li> Con el microscopio de x, y, z de control externo, de forma rápida encuesta el tejido para localizar una región<html> de interés. </li><li> Ajustar la ganancia de la PMT para optimizar la separación de colores y minimizar la cantidad de láser necesarios para lograr suficiente señal más de fondo. Trate de usar la mínima cantidad de láser para evitar la foto-daño de los tejidos. </li><li> Una vez que la región de interés se encuentra, hora de inicio de imágenes a intervalos. En nuestro caso, un típico 5D (x, y, z, t, y el color) protocolo de adquisición consiste en la adquisición de imágenes secuenciales de un volumen de 50 micras de tejido profundo, divididos en 4,0 m z-pasos, x y la longitud y de 140 micras cada uno. Cada volumen es de unos 30 segundos para ser adquiridos. Por lo tanto, 60 adquisiciones se realizan alrededor de 30 minutos de la adquisición de imágenes. </li><li> Transferir los datos al servidor institucional y el uso de ImageJ, Imaris o software Volocity para llevar a cabo la representación multi-dimensional y el seguimiento de la célula. </li></ol> 4. Resultados representante <html> g1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. . Embrionarias aceptación del timo y la función BM Después de recuperarse, timos embrionarias fueron trasplantadas a animales BM reconstituido, dos semanas después del trasplante de timo, estos ratones fueron sangrados una vez por semana para supervisar los porcentajes de los subtipos de células T mediante la tinción con anti-CD4 o anti-CD8 los anticuerpos monoclonales. Se consideró que el timo fue aceptado con éxito en animales con CD4: CD8 alrededor 1.5-2.0:1 (A). Para confirmar su funcionalidad, que sacrificó algunos animales timo-trasplante y en comparación el porcentaje de las diferentes subpoblaciones de timocitos de ratones WT (B). Los porcentajes de doble negación (DN; CD4 - CD8 - timocitos) subpoblaciones (por tinción con anti-CD25 y anticuerpos monoclonales anti-CD44), haga doble positivo (DP; CD4 + CD8 + timocitos) y de un solo positivo (SP) CD4 + o CD8 + timocitos fueron similares entre estos animales. ig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Conjunto de animales titular. Después profundamente anestesiados, el animal se pone encima de una almohadilla eléctrica, previamente montada en la parte superior de la etapa de titular de animales (A). El riñón trasplantado que contiene el timo es hacia arriba (B). Una pinza de papel de aluminio con delicadeza aprieta todo el riñón (C) para mantener en su lugar. Fig. 1C insertar muestra en detalle la abrazadera. La parte superior del soporte de los animales se pone en el lugar (D). El algodón empapado en PBS se retira de la parte superior del órgano, sustituido por el cálido bajo punto de fusión de agarosa, y el calentador superior se añade (E). Finalmente, toda la asamblea se transfiere al microscopio, en este caso representado por el objetivo (F). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" /> Figura 3. Detalles de las piezas soporte. Estas imágenes muestran la abrazadera de papel de aluminio (A) la celebración de los riñones (B). Tenga en cuenta también la región donde se encuentra el timo trasplantado. Esto indica aproximadamente la regiónpara cortar la cápsula del timo y hacer que el bolsillo para poner el timo embrionario. El cubre calentador superior (C) se fija con pegamento de silicona en su parte inferior (D). Movie 1. Intravital imagen de GFP-Foxp3 + timocitos en el interior del timo, donde los niveles fisiológicos de la oxigenación y la temperatura (37 ° C) se mantuvieron durante todo el proceso. Tenga en cuenta el flujo de sangre y el movimiento de células T reguladoras. Estas velocidades pueden ser medidos y comparados con los datos publicados. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Haga clic aquí para ver la película.</a> Movie 2. Intravital de imágenes de células T reguladoras dentro de un timo, donde las imágenes fueron adquiridas a 30 ° C. Nótese la ausencia de movimiento y de la forma redonda de las células a pesar del mantenimiento del flujo sanguíneo. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Haga clic aquí para ver la película.</a>

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	<li>Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+developmental+pathways+for+the+generation+of+pathogenic+effector+TH17+and+regulatory+T+cells.">Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.</a> Nature. 441, 235-238 (2006).</li><li>Ramsdell, F., Z&#250;&#241;iga-Pfl&#252;cker, J. C., Takahama, Y., Coligan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+T+cell+development:+fetal+thymus+organ+culture+and+OP9-DL1+cell+coculture.">In vitro systems for the study of T cell development: fetal thymus organ culture and OP9-DL1 cell coculture.</a> Current protocols in immunology. , (2006).</li><li>Tadokoro, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+inhibit+stable+contacts+between+CD4++T+cells+and+dendritic+cells+in+vivo.">Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 203, 505-511 (2006).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Shakhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+T+cell-dendritic+cell+interactions+precede+the+development+of+both+tolerance+and+immunity+in+vivo.">Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo.</a> Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).</li><li>Hugues, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+T+cell+dynamics+in+lymph+nodes+during+the+induction+of+tolerance+and+immunity.">Distinct T cell dynamics in lymph nodes during the induction of tolerance and immunity.</a> 5, 1235-1242 (2004).</li><li>Tang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+regulatory+T+cell+control+of+autoimmune+responses+in+nonobese+diabetic+mice.">Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice.</a> Nat. Immunol. 7, 83-92 (2006).</li><li>Le Borgne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+negative+selection+on+thymocyte+migration+in+the+medulla.">The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla.</a> Nature immunology. 10, 823-830 (2009).</li><li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy.">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J. Vis. Exp. (46), e2062-e2062 (2010).</li><li>Barretto, R. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17, 223-228 (2011).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

En este trabajo hemos demostrado los procedimientos de dos fotones de imágenes de los timocitos en el interior de un animal vivo. También se describen algunos de los parámetros que uno debe cuidadosamente controlar, como la continuación del flujo sanguíneo y el mantenimiento de la temperatura de órganos durante los procedimientos de imagen. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de cuidado de mantener el órgano estable, los artefactos de movimiento, como &quot;órgano a la deriva&quot; pueden ocurrir. Corrección de la imagen posterior se puede realizar por el desarrollo de algoritmos especialmente diseñados para este propósito. Análisis de las imágenes más también podrían ser el origen del desarrollo de nuevos protocolos que trata de minimizar los errores. El timo es el órgano donde todas las células T son producidas y, por tanto, es el órgano donde inmunólogos interesados ​​en comprender la generación de γδ, CD4, CD8 o células T se centrará su atención. La mayoría de los estudios sobre las células T se basan en las diferencias en los números y / o la estabilidad de los canas después de diferentes in vitro / in vivo manipulaciones. Sin embargo, sólo después de la visualización en vivo se pudo observar la interacción entre las células del sistema inmune involucradas en el mantenimiento de la homeostasis de 3-7. Por lo tanto, la observación en vivo de los timocitos es probablemente uno de la información más importante que falta para entender mejor la biología de las células T. Intravital TPM proporciona una imagen detallada de los movimientos de las células T y las interacciones y demostramos aquí cómo puede ser utilizado para estudios detallados de los timocitos. Sin embargo, cada técnica tiene sus limitaciones. Mientras intravital adquisición de imágenes es el sistema más preciso para reflejar el comportamiento de las células dentro del cuerpo, también es cierto que la adquisición explantados imagen de los órganos es menos laborioso y ha sido utilizado para recopilar información importante sobre el sistema inmunológico 8,9. Por otra parte, no se puede negar métodos intravital de imágenes requieren cirugía para exponer los tejidos y los vasos sanguíneos en los animales anestesiados,que de por sí puede causar una alteración en la totalidad del órgano fisiología 10. Sin embargo, existen métodos no invasiva que la abolición de los artefactos causados ​​por la intervención quirúrgica 11 y los nuevos métodos están siendo desarrollados para mejor prepararse con anticipación a los animales que se utilizarán 12. Por lo tanto, los nuevos procedimientos quirúrgicos y los peajes reducirá al mínimo o evitar las limitaciones reales de adquisición de imágenes intravital y cada vez más accesibles a la comunidad científica. Hemos demostrado que el método que hemos descrito es factible y que los informes de todas las manipulaciones in vivo sistémico, la administración de estos fármacos, que hemos utilizado. Por lo tanto, se sugiere el uso de este método, junto con técnicas ex vivo ya están disponibles con el fin de complementar y fortalecer aún más los estudios sobre el desarrollo de los timocitos.

<table border="1"><thead><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr></thead><tbody><tr><td> Rodamina B ishothiocyanate-dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R9379 </td><td> preparar acciones a 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Microscopio de dos fotones </td><td> Pradera Technologies Inc. </td><td> Pradera Ultima XY </td><td></td></tr><tr><td> Ti: Sapphire láser </td><td> Coherente, Inc. </td><td> Camaleón de la familia Ultra </td><td></td></tr><tr><td> 20x/1.00 NA objetivo de inmersión </td><td> Olympus Inc. </td><td> XLUMPLFLN 20XW </td><td></td></tr><tr><td> Titular (Filtros / dicroico) </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 91018 BX2 (U-MF2) </td><td></td></tr><tr><td> 525 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> ET525/50m </td><td></td></tr><tr><td> 595 nm/50 filtro </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> ET595/50m </td><td&gt; </td></tr><tr><td> 565 nm dicroico </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 565dcxr </td><td></td></tr><tr><td> Imaris software </td><td> Bitplane AG Inc. </td><td> Imaris </td><td></td></tr><tr><td> Volocity </td><td> PerkinElmer Inc. </td><td> Volocity </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> NIH, EE.UU. </td><td> ImageJ </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon microscopy

De dos fotones de Microscopía (TPM) proporciona la adquisición de imágenes en las zonas más profundo de los tejidos y órganos. En combinación con el desarrollo de herramientas nuevas estereotáctica y procedimientos quirúrgicos, el TPM se convierte en una poderosa técnica para identificar &quot;nichos&quot; dentro de los órganos y documentar celular &quot;comportamientos&quot; de animales vivos. Mientras imagen intravital proporciona información que mejor describa el comportamiento real de celulares dentro del órgano, que es tanto más laborioso y técnicamente exigente en términos de equipo necesario / procedimientos alternativos de adquisición ex vivo de imágenes. Por lo tanto, se describe un procedimiento quirúrgico y la novela &quot;estereotácticos&quot; titular del órgano que nos permite seguir los movimientos de Foxp3 + células en el timo. Foxp3 es el regulador maestro para la generación de células T reguladoras (Tregs). Además, estas células se pueden clasificar según su origen: es decir. timo diferenciados Tregs se les llama &quot;de origen natural Tregs&quot; (nTregs), o comopposed a la periferia convertida Tregs (pTregs). A pesar de gran cantidad de investigación ha sido reportado en la literatura sobre el fenotipo y la fisiología de las células T, se conoce muy poco acerca de sus interacciones in vivo con otras células. Esta deficiencia puede ser debido a la ausencia de técnicas que permitan tales observaciones. El protocolo se describe en este documento se ofrece un remedio para esta situación. Nuestro protocolo consiste en el uso de ratones nude que carecen de un timo endógeno, ya que tienen una mutación puntual en la secuencia de ADN que compromete la diferenciación de algunas células epiteliales, como células epiteliales del timo. Ratones desnudos fueron irradiados con rayos gamma y se reconstituyó con médulas ósea (MO) de KI Foxp3-GFP / GFP ratones. Después de la recuperación BM (6 semanas), cada animal recibió el trasplante de timo embrionario dentro de la cápsula renal. Después de la aceptación del timo (6 semanas), los animales fueron anestesiados, el riñón que contiene eltimo trasplantado fue expuesto, fijo en nuestro titular del órgano, y se mantiene bajo condiciones fisiológicas de imágenes in vivo de TPM. Hemos estado utilizando este método para estudiar la influencia de drogas en la generación de células T reguladoras.

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Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de &quot;nichos&quot; en el timo en el desarrollo de células T se produce.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

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Immunology and Infection

16.8K vistas.  Instituto Gulbenkian de Ciência. Hemos desarrollado nuevas herramientas de laboratorio y protocolos para la adquisición de imágenes intravital del timo. Nuestra técnica debería ayudar en la identificación de "nichos" en el timo en el desarrollo de células T se produce.

Video: Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Investigación

Inmunología e Infección

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagen intravital del nodo linfático poplíteo ratón

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...