Los autores agradecen a Jeremy CM Teo y S. Ryan Oliver por su contribución y Jolanta Kilarska para la ayuda en el procesamiento de imágenes. Damos las gracias a la facilidad de la base BIOP at EPFL por el apoyo con microscopía de dos fotones Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Comisión Europea de Investigación (DC-linfático, 206653-2), el Proyecto Marco Europeo de 7 (AngioScaff), la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (31-135756), y los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (NIH) / NIH Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) (SR1 HL096539). Además, los fondos del Premio Robert Wenner (Cáncer Liga Suiza) permitió la compra del microscopio estereoscópico Leica utilizado en este estudio. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

Todos los procedimientos realizados en animales se encontraban en estricta conformidad con la Ley de Protección Animal de Suiza, la ordenanza sobre protección de los animales y de la ordenanza sobre la experimentación animal. Confirmamos que nuestro Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC), llamada Comisión de Supervisión de l&#39;Etat de Vaud (Número de permiso: 2687), específicamente aprobado este estudio. 1. La inoculación del tumor del oído <ol><li> Cultura B16-F10-GFP células de melanoma en un plato de Petri de 10 cm usando DMEM + 10% FBS medios. </li><li> Cuando las células son del 80-90% de confluencia, lavarlas con PBS y separarlos por tratamiento con tripsina. Centrifugar las células a 1500 xg durante 5 min a 4 º C, resuspender el precipitado en 1 ml de solución de Ringer y la transfiere en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Girar de nuevo y eliminar todo el sobrenadante excepto una fina capa de medio que se mantiene justo por encima del sedimento. Resuspender las células a terminar con una suspensión de células de espesor. </li><li> Anestesiar el ratón con una mezcla de mercadoamina / dorbene [medetomidina] (75mg/kg-1mg/kg) y confirme que el animal está suficientemente anestesiado mediante la realización de una pizca dedo del pie suave. Aumenta la concentración de isoflurano en pasos de 0,1% en los movimientos de casos se observan (por ejemplo, la retirada de la pata). Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica controlada termistor rectal (37 ° C) durante todo el procedimiento y proteger sus ojos con un ungüento oftálmico adecuado. </li><li> Preparar una jeringa Hamilton (33 g de aguja, 10 ml de volumen de la jeringa). Retirar la capucha con la aguja y la carga 20 l de suspensión de células en la parte superior de la cámara de la punta. Tire del émbolo hasta 5 ml suspensión se carga en el interior de la jeringa. Retire el exceso de suspensión de la cámara de la punta y cierre la tapa de la punta. </li><li> Con cinta adhesiva, fije el borde proximal de la oreja en la punta de un dedo índice. En un ángulo de 45 °, introduzca lentamente la aguja de la jeringa Hamilton entre dermis dorsal y los cartílagos. Una vez dentro, penetrar en el oído proximal a distal durante unos 2-3 mm. <br /&gt; Nota: El procedimiento de la inyección de células debe ser realizado por técnicos capacitados y certificados. Además este proceso se debe realizar lentamente y en secuencia: primero la aguja debe colocarse horizontalmente a la piel de la oreja y se inserta lentamente en la dermis del oído. Una vez y sólo entonces el extremo de la aguja se encuentra en la piel, el émbolo debe ser presionado. Al presionar el émbolo de iniciará células de la inoculación en la piel. En el caso poco probable de la aguja, pasando las dos capas de la dermis del oído, la capa del cartílago y entra en la piel de la persona que realiza el experimento, el dolor infligido al dedo experimentador debe ser considerado como un signo alarmante y causa la retracción inmediata de la aguja de la piel experimentador. En ese caso, el émbolo no debe ser presionado y la piel debe ser esterilizado con alcohol. Alternativamente, objeto inanimado en lugar de un dedo se puede utilizar para estabilizar el oído. </li><li> Inyectar suspensión celular 3 l y retraer lentamente la aguja de la oreja.Deje que las células tumorales forman un tumor sólido durante 7-9 días y siguen el crecimiento del tumor mediante el uso de un microscopio estereoscópico de fluorescencia. </li><li> Alternativamente, para seguir los primeros pasos de la interacción de las células tumorales con matriz de tejido, aplicar 50 l de 100.000 células tumorales suspendidas en solución de Ringer en la dermis del oído expuestos y teñidas después de la etapa (3.3). </li></ol> 2. Cirugía de Orejas <ol><li> Tres días antes del experimento, afeitarse la cabeza del ratón, depilar los pelos alrededor de la cabeza y el oído (10-15 seg) y enjuagar con agua. </li><li> Anestesiar el ratón con una mezcla de oxígeno humedecido y isoflurano (3-4% de la inducción, mantenimiento 1-2%) y confirme que el animal está suficientemente anestesiado mediante la realización de una pizca dedo del pie suave. Aumenta la concentración de isoflurano en pasos de 0,1% en los movimientos de casos se observan (por ejemplo, la retirada de la pata). Mantenga el ratón sobre una almohadilla térmica controlada termistor rectal (37 ° C) durante todo el procedimiento y proteger sus ojos con unpomada oftálmica adecuada. </li><li> Construir una plataforma hecha de 8 pegados histología diapositivas de cristal. Ponga el ratón sobre su espalda y coloque suavemente el oído que tiene un tumor en la pila de láminas de vidrio. Use pequeñas tiras de cinta adhesiva para fijar los bordes anterior y posterior de la oreja a la pila. </li><li> Cortar la piel ventral de la oreja a lo largo del antihelix del pabellón de la oreja de ratón utilizando un bisturí. Con la ayuda de unas pinzas curvas, pelar suavemente de la dermis y el cartílago ventral de la dermis dorsales donde se inoculó el tumor. Salga de la piel ventral y el cartílago con pinzas curvas, dejando al descubierto la dermis dorsal. NOTA: Si se cortan los principales vasos del oído o de la circulación de la sangre no vuelve a flujo normal en los 15 minutos, el oído no puede ser utilizado para la imagen. Mantenga siempre la piel de la oreja abierta húmeda utilizando tampón de Ringer y proteger de la humedad mediante el uso de un cubre. </li><li> En caso de que haya sangrado persistente vasos tumorales forma, detener el sangrado mediante la adición de 100 ltrombina (5 U / ml) en solución de Ringer (NaCl 102 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, lactato de sodio 28 mM) en la parte superior de la oreja durante 5 min. </li><li> Lave el oído dos veces con aproximadamente 5 ml de tampón de Ringer y eliminar el exceso de líquido con paños estériles. Inmediatamente proceder al siguiente paso (no dejes que el oído abierto seca en cualquier momento!). </li></ol> 3. Inmunofluorescencia La tinción Tampón de Uso Ringer suplementado con suero humano (01:10), policlonal de ratón anticuerpo secundario de IgG humana (01:50), y 125 UI / ml (2,5 mg / ml) de aprotinina (tampón de bloqueo) para todos los pasos de tinción. La aprotinina inhibe la plasmina promover la coagulación para limitar el sangrado inicial que puede ocurrir después de la cirugía. <ol><li> Doble la parte de la oreja con la dermis se abren en los cornetes eminencia y secar la dermis del oído sin abrir exteriores con toallitas estériles. Inmovilizar el oído en la pila de portaobjetos de vidrio mediante la aplicación de 0,5 l de pegamento quirúrgico a la anterior y posterior Dorsal bordes. Entonces, aplanar suavemente la dermis oído dorsales en el cristal. </li><li> Aplicar anticuerpos primarios dirigidos moléculas de la matriz extracelular a una concentración de 10 g / ml en un volumen total de 100 l de tampón de bloqueo a la oreja expuesta. Cubrir la oreja con una hoja de cubierta con el fin de evitar que la solución de tinción a secar en los bordes del oído. Incubar durante 15 min. Lave el oído dos veces con aproximadamente 5 ml de tampón de Ringer. </li><li> Aplicar anticuerpos secundarios apropiados o conjugados de estreptavidina (fluoróforos con una longitud de onda de excitación de alta tal como 594 nm o 647 nm son favorables para intravital de imágenes) a una concentración de 10 mg / ml en un volumen total de 100 l de tampón de bloqueo a la oreja expuesta. Cubra la oreja con un cubre y se incuba durante 15 min. Lave el oído dos veces con aproximadamente 5 ml de tampón de Ringer. </li></ol> 4. Interacción de esplenocitos activados transmitidas por la sangre con células tumorales in situ <ol><li> 7 días después de inoculation de melanoma GFP-B16-F10 en la piel de la espalda de ratón congenic, practicar la eutanasia del animal y recoger el bazo. Aislar esplenocitos con disrupción mecánica del bazo a través de un filtro de células de 70 micras. </li><li> Esplenocitos en las etiquetas de 8 minutos a 37 ° C con Red CMTPX mancha citoplasma celular (1 M en PBS), se lavan 4 veces en 15 ml a 4 º C y se inyecta inmediatamente con medio libre de suero de 200 l en la vena de la cola de ratón cuyos oídos estaban inoculado con B16-F10-GFP 7 días antes. </li></ol> 5. Imaging intravital utilizando un microscopio estereoscópico <ol><li> Para imágenes de corta duración (hasta 2 horas), añadir tampón de ascorbato-Ringer estéril recién preparada que contenga 140 ascorbato de sodio mM, HEPES 10 mM, 4 mM KCl y CaCl2 5 mM, a un pH de 7,5 (finales de amortiguamiento del ascorbato-Ringer osmolaridad 320 mOsm) en la parte superior de la oreja inmovilizada. Cubrir el oído con un cubreobjetos y empezar de formación de imágenes mediante el uso de un microscopio estereoscópico de fluorescencia con la lente 2X. </li><li> Para imágenes a largo plazo(Más de 2 horas), colocar la salida de una aguja (conectado a un depósito que contiene tampón de ascorbato-Ringer) bajo el cubreobjetos, aproximadamente 0,5 cm de distancia de la oreja. Utilice una bomba peristáltica a una velocidad de 1 l / min para entregar constantemente tampón de ascorbato-Ringer a la cámara bajo el cubreobjetos. </li><li> Cambie la lente 1X (distancia de trabajo 6 cm) para la lente 2X (distancia de trabajo 2 cm). Abra el software de adquisición y configurar los ajustes del microscopio estereoscópico fluorescente. En ajustes de la cámara elija 12 bits como la profundidad de color de la imagen y ajustar el rango de la cámara de los valores de la escala de grises de 0% (mínimo) a 5,1% (máximo) y ajustar la corrección gamma a 2. <ol><li> Ajuste la ganancia de adquisición a 1 (mínimo), la intensidad de fluorescencia a 1000 (máxima), ampliación establecida en 280X-320X y ajustar el tiempo de exposición evitando sobre-o sub-exposición (tiempo de exposición debe ser inferior a 1 segundo). Dependiendo del número de campos de imagen (generalmente 10 a 20), el intervalo de tiempo para el ciclo de adquisición debe fijarse serentre 1 y 2 minutos. Acortar los tiempos pueden causar la decoloración y fototoxicidad. </li></ol></li><li> Elija varios campos que contienen las células tumorales, así como proteínas ECM teñidas (como en la Figura 3). Uso de la platina motorizada, adquirir imágenes de los canales fluorescentes apropiados (tales como GFP y fluoróforo 647 en la Figura 3) en el tiempo (por ejemplo, cada 2 min). </li><li> Después del experimento, la eutanasia el ratón de acuerdo con las directrices institucionales de animales. En este caso, al final del experimento, la eutanasia el ratón anestesiado por dislocación cervical seguido de exanguinación (perfusión intracardiaca). </li></ol> 6. Imaging intravital utilizando un microscopio Multifotónica <ol><li> Usando grasa de silicona, construir una pared circular de aproximadamente 2 cm de diámetro y 2-3 mm de altura alrededor de la oreja, a partir de la base de la oreja. Asegúrese de que no hay puntos de fuga. Rellene el círculo con tampón de ascorbato-Ringer. </li><li> Coloque el ratónen el escenario y conectar la almohadilla caliente (37 ° C). </li><li> Software de adquisición abierto y configurar los ajustes del microscopio multifotónica. </li><li> Elige hasta cuatro campos diferentes que contienen las células tumorales y las proteínas ECM manchados (como en la Figura 3). En este ejemplo, ajustar el láser Ti-zafiro y 850 nm para GFP señal de un fotón único posterior 647 para fluoróforo 647 tinción y visualizar colágenos fibrilares con SHG. Adquirir imágenes de los canales fluorescentes apropiados (tales como las buenas prácticas agrarias y fluoróforo 647 en la figura 3) y segunda generación armónica en el tiempo, por ejemplo cada 2 minutos, con la inmersión en agua HCX APO 20X con 1.00 lente NA y 2 mm de distancia de trabajo. </li><li> Después del experimento, la eutanasia ratón anestesiado con dislocación cervical procederse al desangrado (perfusión intracardiaca). </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Significado Aquí se presenta un enfoque novedoso microscopía intravital que permite una alta resolución y visualización dinámica de los diferentes componentes del microambiente del tejido, incluyendo fibrilar, así como proteínas de la matriz de tipo malla. Este método tiene varias ventajas sobre las técnicas actuales de formación de imágenes intravital: (i) de imágenes de fluorescencia intravital se ha utilizado en estudios de la microcirculación, por ejemplo, para realizar un seguimiento soluto fugas de la sangre o en los vasos linfáticos, pero no se ha combinado con la inmunotinción. (Ii) El empleo de reportero ratones modificados genéticamente permite determinados tipos de células para ser fotografiados, pero requiere de la disponibilidad (o esfuerzo sustancial para crear otras nuevas) y limita el número de interactuar tipos de células que se pueden estudiar. (Iii) La matriz extracelular se pueden obtener imágenes in vivo utilizando segunda generación de armónicos, pero esta técnica sólo puede detectar colágenos fibrosos, dejando un gran número de componentes extracelulares importantestales como las membranas basales, fibronectinas, tenascinas, factores de crecimiento, quimiocinas y glicosaminoglicanos tejido fuera del alcance de la investigación actual. Nuestro método supera estas limitaciones, y permite que las técnicas de imagen estándar para ser incorporados y más combinan con inmunotinción para otros tipos de células, estructuras de tejido, los depósitos de sulfato de heparina de unión de factores de crecimiento (por ejemplo VEGF 26) y quimiocinas (CCL21 y 5,18. Fig. 2D ), o proteínas de la matriz extracelular mientras que el seguimiento de forma simultánea en la sangre y / o en los flujos linfáticos. Limitaciones La formación de imágenes de epifluorescencia intravital de SI se limita a los colgajos de piel delgadas, privados de hipodermis gruesas (tejido adiposo). Si bien hemos encontrado que la dermis del oído dorsal es óptima para la exposición quirúrgica relativamente inofensiva de la piel de la oreja, con epifluorescencia intravital SI técnica no se limita a la dermis del oído y potencialmente se podrían aplicar a por ejemplo,la piel expuesta de los dedos del pie o la piel de la espalda del ratón recién nacido. Tinción de anticuerpos rápida (15 minutos) en inmunofluorescencia SI no depende de la difusión pasiva, sino que requiere el drenaje linfático funcional y el flujo de fluido intersticial, por lo tanto, ninguna tinción se puede observar si los vasos linfáticos se ocluyen 27. En línea con esto, los vasos linfáticos se tiñen más fuerte vasculatura sanguínea luego gotea (vasos lesionados, arteriolas) 5. La separación de la dorsal y ventral del oído colgajos de piel es un procedimiento quirúrgico leve pero causa daño a algunos capilares y la muerte celular a diversas células del tejido. Esto podría ser un problema cuando se necesita investigar tejido completamente intacto, por ejemplo, en términos del efecto leve de medicamentos sobre la supervivencia celular. También la aplicación de antioxidante que sirve para proteger la piel de la fototoxicidad y fotoblanqueo excluye el uso de la técnica de inmunofluorescencia intravital para estudiar por ejemplo, el estrés oxidativo de tejidos o Biolog óxido nítricoY. Por último, el cegamiento de los macrófagos residentes del tejido con complejos inmunes puede activar estas células y la influencia por ejemplo el estudio de la respuesta inmune del tejido y la activación de células dendríticas. Modificaciones y solución de problemas Con el fin de estudiar el estrés oxidativo del tejido o de la biología óxido nítrico, ascorbato tiene que ser reemplazado con otros medios de comunicación compatible con los tejidos que no interfiera con la salida experimental. Del mismo modo, los receptores de Fc de bloqueo en las células inmunes dérmicos deben evitarse si el objetivo del estudio es la función y la activación de la respuesta inmune de tejido y activación de células dendríticas y la migración. Esto se puede hacer con el uso de anticuerpo secundario con fragmento Fc troceados (F (ab) 2 de anticuerpos) o el uso de anticuerpo biotinilado y estreptavidina fluorescente como reactivos de detección. Las aplicaciones futuras Presentamos un intra novedoso y únicovital si la técnica para obtener imágenes de los componentes no fibrilares de la matriz extracelular en tumores de piel trasplantables en combinación con fibrilar detectado-SHG y colágenos madurado utilizando microscopía de dos fotones. Una de las ventajas de la utilización de múltiples fotones (o confocal) de formación de imágenes de microscopía de epifluorescencia sobre posibilidad es-Z apilamiento y en consecuencia espacial co-localización de los eventos que ocurren dentro de la matriz extracelular, por ejemplo, la intravasación tumoral en linfático o vaso sanguíneo, que en el caso de los microscopía de epifluorescencia estándar puede ser sólo inferirse de cambios morfológicos de la célula invasora. Esta técnica tiene un potencial mucho más amplio. Por ejemplo, hemos utilizado la intravital SI para investigar el mecanismo de la oclusión linfático mediante terapia fotodinámica-linfático específico 27. Aplicaciones potenciales adicionales de este método incluyen, pero no se limitan a la investigación de la inmunidad de la piel durante la inflamación, el mecanismo de rechazo o métodos de la sangre y la linfa trasplante<html> crecimiento de los vasos ática durante la tumorigénesis. Los pasos críticos en el procedimiento El paso más importante que tiene implicaciones críticas para el mantenimiento de un entorno de tejido fisiológico es una separación quirúrgica de la piel ventral y el cartílago de la dermis dorsal. Cortar u ocluir el principal arteria o vena dará lugar a un sangrado excesivo e hipoxia tisular local, lo que afectará a la respuesta celular a los tratamientos y el movimiento celular 8. Inmovilizar el oído con pegamento quirúrgico se debe hacer con cuidado ya que se derrame el pegamento en exponer el tejido causará una lesión permanente en el tejido por la oclusión de los vasos sanguíneos. La temperatura del ratón debe ser controlado y se mantiene a 37 ° C. Además, oxígeno humidificado necesita ser utilizado para la anestesia con isoflurano, de manera que los ojos y los pulmones se mantienen adecuadamente humidificado durante el experimento. Además, el ascorbato de sodio debe prepararse justo y su pH comprobado antes de su uso. ntent &quot;&gt; En resumen, este inmunofluorescencia intravital puentes en tiempo real, las mediciones locales de la función fisiológica con imagen molecular de eventos celulares complejos en la piel de ratón. Además, este método tiene un gran potencial, ya que puede ser fácilmente aplicado a, por ejemplo estudio post-desarrollo mecanismos de sangre y la linfa-angiogénesis o para visualizar las primeras fases de la infección de la piel por diversos agentes patógenos. Con su flexibilidad y alto potencial de rendimiento, esta técnica intravital pueden contribuir significativamente a múltiples campos de la biología.

Intravital de imágenes de enfermedades inflamatorias, metastásicos y los procesos de remodelación de la matriz ha sido un área importante de la investigación y ha motivado la creación de numerosos modelos de ratones transgénicos reportero que expresan proteínas fluorescentes 1,2. Debido a las señales de fuera de foco fluorescentes, que reducen la calidad de la imagen y los límites de penetración de la luz a través del tejido, tejido grueso de formación de imágenes es posible sólo con confocal o microscopía de barrido de múltiples fotones 3. Usando más rápido, menos caro y complejo microscopía de epifluorescencia es posible sólo con los tejidos casi de dos dimensiones, tales como la membrana corio-alantoideo de pollo 4 o la dermis del oído de ratón 5. La mayoría de los sistemas de imagen se aprovechan de ratones transgénicos que expresan diferentes proteínas fluorescentes de una manera específica del tipo celular. A pesar de que estas proteínas ofrecen fototoxicidad débil, que inducen la respuesta inmune 6. Además, es difícil cambiar entre subtipos celulares específicos o marcar elbasal ir o estados activados como tal cambio requiere la preparación de un nuevo modelo genético. Además, como expresión de la proteína fluorescente se restringe generalmente al compartimiento intracelular, por lo general no es posible imagen estructuras extracelulares, como las proteínas de la membrana basal o depósitos de quimioquinas tejido 7. En lugar de ello, el marcaje indirecto con anticuerpos contra antígenos extracelulares ofrece flexibilidad para prácticamente cualquier tipo de célula o matriz de componentes específica 8,9. Sin embargo, la principal desventaja de este enfoque de etiquetado se asocia con la inmunotoxicidad mediada por complejos inmunes antígeno-anticuerpo que pueden desencadenar complemento toxicidad celular dependiente del sistema y la fagocitosis de las células y estructuras extracelulares 10. La matriz extracelular del microambiente del tumor, sino también de tejido normal durante la inflamación o la curación de heridas, se somete a la remodelación sustancial. Estroma de refuerzo del microambiente del tumor puede promoel crecimiento del tumor y la invasión TE debido a los mecanismos de señalización inducidas por el estrés y causa la remodelación de la sangre y los vasos linfáticos 11. Sin embargo, de formación de imágenes en vivo de proteínas de la matriz está limitada a los colágenos fibrilares que pueden ser detectados por generación de segundo armónico mediante microscopía de múltiples fotones. Recientemente hemos publicado un nuevo método intravital de imágenes que reduce al mínimo el riesgo de daños foto-y-inmune tóxico para las células fotografiados y las estructuras de tejido 5. En comparación con las técnicas de imagen establecidos donde la única ronda de visualización intravital continua está en un intervalo de 30 minutos a 2 horas 12-17, nuestra técnica (SI) de inmunofluorescencia intravital permitió 12 horas (a largo plazo 8) de formación de imágenes. Es importante tener en cuenta que el tiempo de formación de imágenes se limita a 12 horas debido a los límites definidos en el protocolo de los animales, pero no hay contra-indicaciones técnicas que no se puede prolongar si los parámetros críticos de la salud del animal, como la presión arterial y el corazóntasa se ​​controlan 8. Además, mediante el uso de un microscopio estereoscópico de fluorescencia automatizado pudimos recoger imágenes de varios campos en un solo experimento y observamos raros procesos inmunológicos y remodelación que se produjeron en el contexto fisiológico de la piel con el apoyo de la sangre funcionales y vasos linfáticos. Debido a que la lente estereomicroscópica tiene una relativamente grande, 2 cm, distancia de trabajo y en contraste con dos fotones ópticas microscópicas no requiere vaporización inmersión en agua, tratamiento de imágenes a largo plazo se realiza sólo bajo microscopio estereoscópico de fluorescencia. Intravital Si se permite el etiquetado inmune y la detección de cualquier componente de la matriz extracelular de la piel normal. El diseño de esta técnica se basa en el concepto innovador de la utilización de la inmunotinción de las células vivas y los elementos de la matriz del tejido de la dermis de ratones expuestos quirúrgicamente sin causar efectos dañinos inmunotóxicas 5. El procedimiento quirúrgico en sí es seguro a la dermisvasculatura ya que se basa sólo en la separación de dos capas de la piel en el oído que se inervado de forma independiente, de manera autónoma alimentada por la sangre y drenado por circulaciones separadas linfáticos. Nuestro sistema experimental permite obtener imágenes de una serie de eventos fisiopatológicos importantes sobre al menos 12 horas, incluyendo el tráfico de leucocitos entre los vasos sanguíneos y linfáticos y los procesos de cicatrización de heridas. En la publicación original, comparamos nuestra técnica con los estándares del estado de la técnica en diversos campos de la imagen intravital. En consecuencia, se observó la extravasación de los vasos sanguíneos y linfáticos eventos intravasation por varios tipos de leucocitos, incluyendo la visualización única de las células inmunes que entran en la recogida en lugar de esperar vasos linfáticos iniciales 15. Además, como complemento de las observaciones hechas por otros grupos 9,18, encontramos que en CCL21 in vivo es capaz de formar depósitos fuertes, discontinuos en la recogida, pero sólo con poca frecuencia en los linfáticos iniciales. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aquí se describe un intravital modificado SI técnica que se puede combinar con la microscopía de dos fotones para detectar la red de colágenos fibrilares que utilizan generación de segundo armónico (SHG). Se demuestra que este método también se puede utilizar para la invasión de células de cáncer de formación de imágenes en el contexto del microambiente del tumor dinámico, que incluye moléculas de la matriz tales como la tenascina C, que son en gran parte sin explorar por técnicas de imagen actuales 19. Se encontró que la matriz fibrilar del tumor, detectado con la segunda generación de armónicos, ocupa diferentes lugares del microambiente del tumor que la matriz recién depositada compuesta de tenascina C. Además, se describen ejemplos de remodelado vascular causadas por la contracción de la matriz local, de larga- plazo (12 horas) de formación de imágenes de las interacciones de células T con las células tumorales y la migración de células del tumor a lo largo de colágeno IV de la membrana basal. Este tipo de eventos se pueden obtener imágenes durante la grabación simultánea de parámetros fisiológicos locales, como pe los vasos sanguíneosrmeability y el drenaje linfático.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="966">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mice Strain</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BALB/C mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Charles River&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orleans,France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">C57/Bl6 Mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Harlan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Carshalton UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Line&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Anesthesia Maintenance&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Minrad Inc.&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2222</td>
			<td>Minrad Inc., Buffalo, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified delivery system&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Rothhacher GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Berne, Switzerland&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DC Temperature Control System&#160;</td>
			<td style="width:159px;">FHC Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bowdoin, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage .</td>
			<td style="width:159px;">M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">&#160;1&#215; lens (linear system magnification from 7.5&#215; to 160&#215;)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">2&#215; lens (linear system magnification from 15.6&#215; to 320&#215;)</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Multiphoton Microscopy&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX APO 20x/1.2 oil immersion&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chameleon Ultra Laser&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">Ringer&#39;s buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate)</td>
			<td>B. Braun Medical AG</td>
			<td align="right">445968</td>
			<td>Sempach, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Aprotinin&#160;</td>
			<td>Elastin</td>
			<td>AP92</td>
			<td>Owensville, MO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Thrombin&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7326-1KU&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11140-50G&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mouse Serum raised against human IgG&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Abcam&#160;</td>
			<td>ab34834&#160;</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Collagen IV&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6581</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Perlacan&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>ab79465&#160;</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Tenascin C&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>AF3358</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Podoplanin</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AF3244</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">LYVE-1&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Reliatech&#160;</td>
			<td>103-PA50&#160;</td>
			<td>Wolfenb&#252;ttel, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CCL21</td>
			<td style="width:159px;">RnD</td>
			<td style="width:119px;">AF457</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Pacific Blue&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S11222</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 647&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S21374</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 488&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S11223</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Goat 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21113</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Rabbit 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CMTPX CellTracker</td>
			<td style="width:159px;">Lifetechnologies</td>
			<td style="width:119px;">C34552</td>
			<td>Carlsbad, California</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Histocryl (surgical glue)</td>
			<td style="width:159px;">Braun Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">1050060</td>
			<td>Tuttlingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Culture Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>E15-843&#160;</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term intravital immunofluorescence imaging of tissue matrix components with epifluorescence and two-photon microscopy

Además de ser un andamio física para mantener la morfología del tejido, la matriz extracelular (ECM) está activamente involucrada en la regulación de la función celular y de tejidos durante el desarrollo y la homeostasis de órganos. Lo hace, actuando a través de las vías de señalización bioquímicos, biomecánicos, y biofísicos, como a través de la liberación de fragmentos de proteínas ECM bioactivos, que regula la tensión del tejido, y proporcionar vías para la migración celular. La matriz extracelular del microambiente del tumor se somete a la remodelación sustancial, caracterizado por la degradación, deposición y la organización de proteínas de la matriz fibrilares y no fibrilares. Estroma de refuerzo del microambiente del tumor puede promover el crecimiento del tumor y la invasión, y causar la remodelación de los vasos sanguíneos y linfáticos. Formación de imágenes en vivo de proteínas de la matriz, sin embargo, a este punto está limitada a los colágenos fibrilares que pueden ser detectados por generación de segundo armónico mediante microscopía multifotónica, dejando la mayoría de los componentes de la matriz Largely invisible. Aquí se describen los procedimientos para la inoculación del tumor en la piel de la oreja dorsal fina, immunolabeling de las proteínas de la matriz extracelular y de imagen intravital del tejido expuesto en ratones vivos mediante epifluorescencia y microscopía de dos fotones. Nuestro método intravital de imágenes permite la detección directa de tanto fibrilar y proteínas de la matriz no fibrilares en el contexto de un tumor dérmico creciente. Mostramos ejemplos de remodelado vascular causada por la contracción de la matriz local. También se encontró que la matriz fibrilar del tumor detectado con la segunda generación de armónicos es espacialmente distinta de componentes de la matriz recién depositados tales como tenascina C. También mostramos a largo plazo (12 horas) de formación de imágenes de la interacción de células T con células tumorales y las células tumorales la migración a lo largo del colágeno IV de la membrana basal. Tomados en conjunto, este método permite de forma única para la detección simultánea de las células tumorales, su microambiente físico y la respuesta inmune tejido endógeno con el tiempo, lo que puede provide importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a la progresión del tumor y el éxito o la resistencia a la terapia definitiva.

Hasta la fecha, la inmunotinción en el tejido vivo no se usa normalmente debido a la formación de complejos inmunes que conducen a fondo de alta tinción e inmunotoxicidad 20. Esto fue superada por la pre-bloqueo de los receptores Fc gamma en macrófagos tisulares, por lo que &quot;cegar&quot; a estas células a la posterior inmunotinción fuerte indirecta. A medida que el etiquetado era extracelular, fototoxicidad y fluoróforo blanqueo podría ser controlado por inmersión del tejido en antioxidante natural tamponada, ácido ascórbico isosmótica (fig. 1A). Desde nuestra descripción inicial de este método 5, mejoramos nuestra técnica anti-blanqueo y contra la fototóxico para que photobleaching ahora pueden no sólo ser inhibida pero completamente impedido (Fig. 1B). Esto se hace mediante la incorporación de la oreja en un gran volumen de antioxidante (100 l) dentro de la cámara donde se inmoviliza el oído. Tenga en cuenta que el tiempo 300 segundos de imagen constante corresponde a 10 horas de proyección de imagen cuando las imágenes sonrecopilada durante 500 ms cada minuto (la configuración de medios de formación de imágenes). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1.jpg" /> Figura 1. Photobleaching y fototoxicidad se detuvo mediante la sustitución de cloruro con el ascorbato en tampón de Ringer y la incrustación de la oreja expuestos en 100 l de volumen de esa solución. (A) El tejido se tiñeron primero con un anticuerpo biotinilado contra el colágeno IV, el componente de la membrana basal. La tinción fue más tarde detectó con estreptavidina-647 (rojo), y luego constantemente fotografiada durante 300 segundos en cualquiera de búfer normales de Ringer (panel superior) o ascorbato-Ringer (panel inferior) de. Tenga en cuenta que 300 segundos de tiempo de formación de imágenes constante corresponde a 10 horas de formación de imágenes cuando las imágenes se recogieron para 500 mseg cada minuto (la configuración de imagen habituales). La más brillante del 25% del pivalores de intensidad xel son de color verde. (B) Cuantificación de la decadencia de inmunofluorescencia (50% en contra de Ringer 0% de ascorbato-Ringer). Los valores se normalizaron a la fluorescencia inicial. Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. La barra de escala en A, 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La investigación de la interacción entre las células de tumores metastásicos y estroma tumoral es crucial para entender el proceso de migración de células tumorales y la inmunidad tumoral. Esto es porque el estroma asociado a tumor compone de hasta 90% de la masa tumoral y regula activamente el crecimiento del tumor y la diseminación metastásica 21. Sin embargo, la visión mecanicista de cómo la migración de células tumorales unidades de la matriz ya sea hacia los vasos linfáticos o los vasos sanguíneos se carece de 22. Esto se debe parcialmente al hecho de que im intravitalenvejecimiento de proteínas de la matriz se limita a la visualización de las fibras de colágenos fibrilares madurado utilizando segunda generación de armónicos en la microscopía de dos fotones 23. Por lo tanto, hemos adaptado nuestro método para la visualización de la microambiente del tejido incluyendo la sangre y los vasos linfáticos, pericitos, nervios, músculo y adipocitos para incluir la visualización directa de los componentes de la matriz extracelular. Muchas estructuras se pueden distinguir sobre la base de su morfología después de la inmunotinción para los componentes de la membrana basal, tales como colágeno IV o perlecan (Figura 2A), sin embargo, la tinción directa para los marcadores específicos de la superficie celular, por ejemplo Lyve1 (Fig. 2B y C) y podoplanin (Fig. . 2C), permite además distinguir, linfáticos capilares iniciales (Lyve1 +) de los colectores linfáticos (Lyve1 -). La tinción para CCL21 unido a la matriz de la piel reveló depósitos de esta quimiocina en la membrana basal de los colectores linfáticos identified con la tinción para perlecan, el proteoglicano heparán sulfato (fig. 2D). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2.jpg" /> Figura 2. Ejemplos de tinción en vivo en los oídos de un ratón normal. (A) La tinción de perlecan, un componente de la membrana basal, representa a todos los vasos sanguíneos y linfáticos, nervios, fibras musculares y adipocitos. (B) tinción Lyve1 marca la primera red capilar linfático. (C) Co-tinción para Lyve1 y podoplanin, un marcador pan-linfática, representa a las redes de los linfáticos iniciales y de recogida. La dermis dorsal del oído se pueden obtener imágenes mediante microscopía de epifluorescencia clásico (sin seccionamiento óptico) como la dermis del oído tiene un bajo número de adipocitos que de otra manera cubrir el campo de la imagen. (D) stai CCL21<html> ning (verde) de la membrana basal linfático teñido de perlecan (rojo). Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. Las barras de escala en A y B, 1 mm; en C, 100 micras y 50 micras de D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Más importante aún, las proteínas estructurales que normalmente no pueden ser detectados por los grupos de autoayuda, el método de detección de la matriz clásico 23, se pueden visualizar. Por ejemplo, se encontró que la tenascina C (Fig. 3A), una proteína de la matriz que se expresa durante la tumorigénesis, la cicatrización de heridas y la inflamación 19 se deposita en diferentes lugares de estroma tumoral que los colágenos fibrilares (Fig. 3B). Esta heterogeneidad matriz podría afectar a la distribución de las células tumorales y la metástasis (fig. 3C). <html> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3.jpg" /> Figura 3. La dermis dorsal del oído se pueden obtener imágenes en vivo utilizando microscopía multi-fotón. Un solo campo de tumor B16-F10. Estroma tumoral se marcó con anticuerpo tenascina C y la tinción se detectó con anti-cabra-594 anticuerpo de burro. Inmunofluorescencia de tenascina C (roja) de red se muestra en A y colágenos fibrilares detecta con generación de segundo armónico (SGH) en B. Estas dos redes se superponen con las células tumorales (cian) en C (fusionada). Nueva matriz tumoral marcado por la tenascina C no se solapa con colágenos fibrilares detectados con SHG (verde). La imagen con 44, cuatro veces en promedio z secciones con z paso 1.0 micras fue adquirido en el modo de profundidad de color de 16 bits. Las imágenes recogidas con el microscopio de dos fotones. La barra de escala, 100 m.ref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tras la inmunomarcación de diferentes componentes de la matriz tumoral (por ejemplo, la tenascina C y colágeno IV) de la matriz tumoral que pudimos identificar restringida y eventos súbitos de tumor remodelación direccional matriz (Video 1). Fuerzas que se desarrollan dentro microambiente del tumor pueden dar lugar a la expansión o contracción de la matriz tumoral y en la remodelación de consecuencia y el alargamiento de la vasculatura del tumor a un grado similar como se mostró anteriormente en el caso de la curación de heridas 11,24. Vídeo 1. De expansión de la matriz tumorales marcadas con colágeno IV (rojo) y la tenascina C (cian) alargado vasos sanguíneos (flechas) y pasivamente trasladar tres células tumorales (verde). Contracción localizada de teascin C-rica tumor matriz translocate vaso sanguíneo (rojo orientado horizontalmente estructuracióne) por aproximadamente 100 micras durante 12 horas de formación de imágenes. Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video1_New.avi" target="_blank">Haz click aquí para ver el video.</a> Usando microscopía multi-fotón con etiquetado fluoróforo es problemático, ya que el flujo de fotones utilizados en estos experimentos se blanquear rápidamente tintes fluorescentes que no están protegidos contra la oxidación 25. Aquí mostramos que podemos realizar de dos fotones de time-lapse microscopía mientras que las imágenes simultáneamente matriz tenascina C immunolabeled con fotoblanqueo mínima de fluoróforos incluso en alta densidad de fotones microscopía de dos fotones (Video 2). Video 2. Fotoblanqueo Bajo nivel de C inmunofluorescencia tenascina (rojo) durante la microscopía de dos fotones. Células tumorales B16-F10-GFP (cian) se obtuvieron imágenes en la oreja dorsal abierta 9 días después de la inoculación. La señal fluorescente fue protegido por la aplicación de ascorbato-Tampón de Ringer sobre el tejido fotografiado. Generación de segundo armónico (verde) no se solapa con nueva matriz representado por C. imagen profundidad de color de 16 bits tenascina con 11, cuatro veces promedio de z secciones con z-etapa 1.9 micras fue adquirida durante 15 min. Las imágenes se recogieron cada 1 minuto 5 segundos en 6 z aviones recogidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video2.avi" target="_blank">Haz clic aquí para ver el video.</a> También Imaged interacciones célula inmune con células tumorales metastásicas. Esplenocitos marcados CMTPX de un ratón portador de tumor extravasado de asociados al tumor de los vasos sanguíneos 8 horas después de la transfusión intravenosa, invadieron la matriz tumoral e interactuaron activamente con las células tumorales mediante la formación de larga duración contactos celulares (Video 2). Estructuras marcadas con fluoróforo-647 de colágeno IV fueron resistentes a photobleaching durante las 12 horas de imágenes. Vídeo 3. Interacción de esplenocitos marcados con CMTPX de tumor (B16-F10)-bearing ratón con células tumorales individuales (GFP-B16-F10). esplenocitos fueron iv transfundida después de la tinción de tejidos para el colágeno IV. El colágeno IV-verde (647), los esplenocitos-roja (CMTPX), cian B16-F10 (GFP). Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. Duración del video 12 horas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video3-corrected.mov" target="_blank">Haz clic aquí para ver el video.</a> Células tumorales recién aisladas fueron superpuestos en la dermis del oído expuestos previamente teñidas para colágeno IV. Podríamos observado que después de adherir al tejido algunos grupos de células comenzaron la migración colectiva a lo largo de la membrana basal de los vasos sanguíneos y los adipocitos. Vídeo 4. Las células tumorales migran a lo largo de las membranas basales. La piel normal del oído manchado para el colágeno IV (647, rojo) se cubrió con un pase reciente células B16-F10-GFP y la imagen durante 5 horas. Algunas células tumorales que se adhirieron al tejido empezaron a lo largo de la migración colectivala membrana basal de los vasos sanguíneos y los adipocitos. Las imágenes recogidas con microscopio estereoscópico inmunofluorescencia. Duración del video:. 5 horas <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video4.avi" target="_blank">Haga clic aquí para ver el video.</a> Además, debido a la dermis del oído es prácticamente bidimensional, podríamos recopilamos fácilmente grandes volúmenes de datos mediante microscopía estereoscópica fluorescencia rápido, en lugar de confocal más lento y más caro o microscopía multifotónica. Sin embargo, también es posible utilizar cualquiera de los métodos de microscopía de barrido mencionados con nuestra intravital si las preparaciones (Fig. 3, Vídeo 1).

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Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

long-term-intravital-immunofluorescence-imaging-tissue-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.9K vistas.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne.  La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones. 

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Investigación

Bioingeniería

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

El chip de varios órganos - Una plataforma de microfluidos para el largo plazo co-cultivo de múltiples tejidos

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. Hence, highly multiplexed imaging technologies have been increasingly appreciated. Here, we describe an emerging platform of highly-multiplexed vibrational imaging of specific proteins with comparable sensitivity to standard immunofluorescence via electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes. This method circumvents the limit of spectrally-resolvable channels in conventional immunofluorescence and provides a one-shot optical approach to interrogate multiple markers in tissues with subcellular resolution. It is generally compatible with standard tissue preparations, including paraformaldehyde-fixed tissues, frozen tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) human tissues. We envisage this platform will provide a more comprehensive picture of protein interactions of biological specimens, particularly for thick intact tissues. This protocol provides the workflow from antibody preparation to tissue sample staining, to SRS microscope assembly, to epr-SRS tissue imaging.

Electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes is a new platform for highly multiplexed epitope-based protein imaging. Here, we present a practical guide including antibody preparation, tissue sample staining, SRS microscope assembly, and epr-SRS tissue imaging.

Imágenes de tejidos altamente multiplexados con tintes Raman

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...