Nuestro protocolo permite a los investigadores analizar el proceso de arteriogénesis in vivo mediante el seguimiento de la adherencia de las células inmunes y la extravasación en el crecimiento de arterias colaterales en tiempo real. La técnica de microscopía multifotónica permite la visualización de la dinámica celular en el tejido profundo de modelos de ratón vivos con baja fototoxicidad y con alta resolución espaciotemporal. El procedimiento de microscopio será demostrado por Dominic van den Heuvel, asistente técnico de la plataforma de imágenes multifotónicas del laboratorio de la Dra. Helen Ishikawa-Ankerhold.
Demostraré el procedimiento quirúrgico. Para comenzar, coloque el ratón anestesiado en posición supina. Luego coloque dos piezas de arcilla moldeada debajo de la extremidad posterior superior del ratón para asegurar una posición plana del músculo aductor.
Coloque el ratón bajo el microscopio estéreo. Después de quitar el vello de ambas piernas, desinfecte y corte la piel en un círculo alrededor de la cicatriz de la ligadura anterior de la arteria femoral de la extremidad posterior derecha. Retire la piel y la capa de grasa de la parte superior de la pierna y retire la piel restante con suturas para crear un bolsillo alrededor del músculo aductor con los vasos colaterales.
A continuación, retire la grasa subcutánea para obtener una visión clara del músculo aductor, la arteria y vena profunda, así como los vasos colaterales. Retire la capa muscular superficial en la parte superior de los vasos colaterales usando pinzas finas. Llene el bolsillo preparado con solución salina para evitar que el tejido se seque y continúe el mismo procedimiento para la extremidad posterior izquierda operada de forma simulada.
Antes de la obtención de imágenes, agregue gel ultrasónico en ambos bolsillos, lo que evita el secado y sirve como medio de inmersión para el acoplamiento óptico con el objetivo. Encienda la llave de la caja láser de zafiro de titanio, la caja de interfaces electrónicas, la unidad de calefacción de la cámara de la incubadora, la lámpara fluorescente y la computadora. Inicie el software de adquisición.
Ajuste la longitud de onda a 800 nanómetros y abra el obturador del microscopio. En el cuadro de diálogo del asistente de medición, elija el modo de instrumento como haz único y el modo de medición como timelapse de escaneo 3D. Luego transfiera el ratón anestesiado a la cámara de incubación precalentada del microscopio y coloque el área con el gel ultrasónico directamente en contacto con la lente frontal del objetivo.
Abra el obturador del microscopio de epifluorescencia. A continuación, elija un filtro adecuado o un ajuste dicroico para la visualización FTSE. Defina el área de interés siguiendo el flujo sanguíneo bajo iluminación de epifluorescencia.
Después de llevar el área de interés al campo de visión central, cierre el obturador del microscopio de epifluorescencia. En el cuadro de diálogo del escáner XY, defina los parámetros necesarios para el tamaño de la imagen, el píxel, la frecuencia y el promedio de línea. Ajuste la potencia del láser y establezca la ganancia del multiplicador de fotos para los canales verde, rojo y azul.
Seleccione un objetivo adecuado para los ajustes de imágenes intravitales y corrección de deriva. Defina el rango de la pila de imágenes iniciando el modo de adquisición de vista previa presionando el botón rojo en la ventana de diálogo del asistente de medición. Para obtener buenas imágenes, defina el área y la estructura de interés enfocando.
Mientras observa la pantalla, cambie el enfoque moviendo el objetivo hasta que la imagen desaparezca y configúrelo como cero. Establezca la posición objetivo como la última posición en la dirección axial. Luego cambie el enfoque en la dirección opuesta moviendo el objetivo hacia abajo hasta que la imagen desaparezca de la pantalla nuevamente.
Haga clic en el botón detener en la esquina superior izquierda del cuadro de diálogo del asistente de medición y establezca el tamaño del paso en dos micrómetros. Elija el eje python como el primer dispositivo de eje en el cuadro de diálogo del asistente de medición y seleccione no activar el modo de guardado automático. A continuación, marque la casilla de guardado automático solo en el eje de tiempo.
A continuación, presione el icono de Python en la ventana de dispositivos disponibles para abrir la ventana de diálogo de Python. En la configuración del eje de diálogo de Python, introduzca las secciones desde y destino y, a continuación, introduzca el número de pasos. Vaya a la ventana de diálogo Etapa Z XYZ y amplíe el rango de escaneo en 200 micrómetros en ambos extremos.
Para hacerlo, ingrese 200 micrómetros en el inicio e ingrese menos 240 micrómetros en el final y el rango se establecerá automáticamente como menos 440 micrómetros. Abra el cuadro de diálogo front-end de VivoFollow. Inicie la adquisición de imágenes presionando la punta de flecha verde en la esquina superior izquierda del cuadro de diálogo del asistente de medición.
Si se utiliza la corrección de desviación en vivo, busque un cuadro de diálogo para que aparezca la configuración de corrección de deriva. A continuación, establezca el canal de adquisición utilizado como en una referencia de referencia móvil. Introduzca el desplazamiento de corrección máximo en micrómetros añadido a la primera y última posición Z y haga clic en Aceptar. Monitoree el desplazamiento de la deriva de corriente en X, Y y Z en tiempo real durante la adquisición de imágenes en la ventana de diálogo front-end de flujo vivo y detenga la adquisición de imágenes después de 35 minutos cuando se requiera otro ciclo de reinyección de anestesia.
Inyecte media dosis de la mezcla MMF y reinicie la adquisición de imágenes hasta que finalice el experimento. Esta herramienta permite la adquisición de imágenes a largo plazo, permite la recopilación de datos de alta calidad y es adecuada para rastrear las celdas para mediciones de velocidad. Como se muestra sin corrección de deriva, la región de interés se aleja progresivamente de la vista de grabación, lo que afecta la capacidad de rastrear celdas para el análisis de velocidad.
Sin embargo, se pueden grabar películas estables con el software de corrección de deriva y se pueden rastrear más celdas durante un largo período. El software de corrección de deriva también puede proporcionar una visualización de los desplazamientos X, Y y Z a lo largo del tiempo que se corrigió en el sistema. La microscopía multifotónica ofrece una alta resolución espaciotemporal para el seguimiento de leucocitos en la que se pueden rastrear y monitorear los pasos y la velocidad de la migración celular.
Al preparar los vasos colaterales para imágenes multifotónicas, es esencial evitar daños en las arterias colaterales. Antes de obtener imágenes, es importante identificar de manera segura la arteria colateral correcta. Con este nuevo procedimiento de imagen multifotónica intravital de las arterias colaterales, es posible analizar la adherencia y extravasación de todas las células sanguíneas in vivo cambiando la etiqueta de anticuerpos.
