Esta investigación fue financiada en parte por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer.

1. Mantenimiento de los cultivos de células de líneas celulares tumorales metastásicas latentes y <ol><li> Crecen las células tumorales inactivas (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) y metástasis (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) en placas de 10 cm de cultivo que contienen Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM), la glucosa alta y 10% de suero fetal bovino ( FBS) y antibióticos. Una vez que las células alcanzan el 70-80% de confluencia, proceder a los siguientes ensayos. </li></ol> 2. Ensayo de proliferación celular de las células tumorales inactivas (en reposo) y metástasis (proliferación) cultivadas en un sistema 3D-BME Cultivo latente / las células metastásicas en el sistema 3D <ol><li> Descongele el crecimiento Cultrex factor de reducción del sótano extracto de membrana (BME) en 4 ° C refrigerador una noche antes de llevar a cabo el ensayo. Nota del BME deben ser manejados en el hielo en todo momento. </li><li> Al día siguiente, colocar una placa de 96 pocillos en una bandeja de hielo dentro de una campana laminar. Escudo cada pocillo con 50-100μl de BME fría mediante un dispensador con una jeringa. Asegúrese de que no se forman burbujas en los pozos. Coloque la placa de 96 pozos cubierto con BME en una incubadora humidificada con 5% de CO 2 a 37 ° C durante 30 minutos. </li><li> Mientras tanto aspirar los medios de comunicación de las células tumorales latentes y o metastásico (preparado en la sección 1). Enjuagar las placas de cultivo con 10 ml de tampón fosfato salino pH 7,4 (PBS). Aspirar el PBS y añadir 2 ml de tripsina precalentada a 37 ° C, para las placas de cultivo. Las placas se incuban en un 5% humidificado de CO 2 a 37 ° C, durante 5 minutos. </li><li> La transferencia de células a un tubo cónico de 15 ml que contienen 5 ml de glucosa en DMEM alto suplementado con 10% FCS y antibióticos y el recuento de las células. </li><li> Centrifugar el número total de células que se cultivaron en una centrífuga de cultivo de tejidos a una velocidad de 1500 g, a temperatura ambiente durante 5 min. En nuestros ensayos preparamos 2X10 3 células / pocillo para cada línea celular o un punto de tiempo para ser examinados. Sin embargo, esto puede variar dependiendo de las líneas celulares. </li><li> Con cuidado, aspirar el sobrenadante. Tenga en cuenta, en la mayoría de los casos la pastilla no es visible. Por lo tanto, dejar un poco detrás de los medios de comunicación. Toque en la parte inferior del tubo cónico de 15 ml con los dedos para asegurarse de que una suspensión de células individuales se obtiene. Vuelva a suspender el pellet con la glucosa baja DMEM con antibióticos suplementado con 2% FCS BME + 2% (ensayo de los medios de comunicación). 100 l de los medios de prueba deberá ser agregado por cada 2x10 3 células. Triturar las células muchas veces con una pipeta de 5 ml para asegurarse de que una única suspensión de células se mantiene. </li><li> Una placa 100μl de la mezcla de células por pozo en la parte superior de los 96 y placa recubierta BME. Para la evaluación de antecedentes (en la sección 2.8) en la placa 100μl además por pocillo de ensayo sólo los medios de comunicación en la parte superior de la placa de recubrimiento 96 y BME. Incubar el cultivo en placas de 96 y un 5% humidificado incubadora de CO 2 a 37 ° C. Las células deben ser re-alimentados cada 4 días con los medios de prueba. </li></ol> Proliferación de ensayo: <ol start="8"><li> Ensayo de proliferación de las células: añadir a los pozos en el momento deseado puntos de 20 l de la titulación de la célula 96 Una solución acuosa kit de ensayo de proliferación celular. Incubar humidificado en un 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C durante 2 horas. El uso de un lector de placas ELISA registro de la absorbancia a 490nm. Para la evaluación de antecedentes y resta, añadir 20μl del título de la célula 96 Una solución acuosa kit de ensayo de proliferación de células de pozos revestidos con pre BME y sólo cubierta con los medios de ensayo. El uso de un lector de placas ELISA registro de la absorbancia a 490 nm. </li></ol> 3. Inmunofluorescencia para las moléculas de señalización celular en la inactiva (latente) las células tumorales y / o metastásico (proliferación) las células tumorales Cultivo latente / las células metastásicas en el sistema 3D para la tinción immunfluorescence * El siguiente protocolo es una modificación de un protocolo de cultivo en 3D publicado por Debnath J et al 18. <ol><li> BME preparar como se describe en la sección 2.1. Al día siguiente: establecer un sistema de vaso de 8 cámaras de diapositivas en una bandeja de hielo dentro de una campana laminar. Escudo cada pocillo con 50 ul de helado de BME con una 200μl Pipetman. Asegúrese de que BME se distribuye uniformemente y no se forman burbujas en los pozos. Colocar la placa de la cámara 8 de vidrio recubierta de BME en un 5% humidificado de CO 2 a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Cosecha o latente y las células metastásicas de la sección 1 y preparar a la cultura tal como se describe en la sección 2.3 a 2.4. Recoge el número total de células que se cultivaron en un tubo cónico de 15 ml. Preparamos 5 x 10 3 células / pocillo para cada línea celular y el punto de tiempo para ser examinados. Centrifugar las células en una centrífuga de cultivo de tejidos a una velocidad de 1500 g, a temperatura ambiente durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con cuidado. Tenga en cuenta que la pastilla no es visible, por lo que dejan detrás de algunos medios de comunicación. Toque en la parte inferior del tubo cónico de 15 ml con los dedos para asegurarse de que una única suspensión de células se obtiene.Vuelva a suspender el pellet con los medios de prueba. 400μl de los medios de prueba deberá ser agregado por cada 5x10 3 células. Triturar las células muchas veces con una pipeta de 5 ml. Este paso es muy importante asegurarse de que la única suspensión de células se mantiene. </li><li> 400μl plato de la mezcla de células por pozo en la parte superior de cada una de las 8 cámaras recubiertas con BME. Incubar el cultivo vaso de 8 cámaras de sistema de diapositivas en un 5% humidificado incubadora de CO 2 a 37 ° C. Las células deben ser re-alimentados cada 4 días con los medios de prueba. </li></ol> La tinción de inmunofluorescencia: <ol start="4"><li> En los puntos de tiempo deseado, aspirado de la capa superior de los medios de comunicación y añadir 200μl de fijador que contiene 4% de paraformaldehído (PFA), 5% de sacarosa y 0,1% de Triton X-100 y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. Aspirar el fijador y añadir 200μl de PFA al 4% que contiene sacarosa al 5% e incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos. </li><li> Aspirar el fijador; añadir 400 l de tampón fosfato salino (PBS) a cada pocillo. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el PBS y añadir 400 μ PBS que contenía 0,05% de Tween 20 durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Bloquear las células fijas a temperatura ambiente con 200μl de cualquiera de burro 10% de suero o con BSA al 3% durante 1 hora (solución de bloqueo que se utiliza debe ser determinada empíricamente para cada anticuerpo primario). </li><li> Aspirar la solución de bloqueo y añadir 200μl del anticuerpo primario (dilución debe ser determinada empíricamente para cada anticuerpo primario que se utiliza). Diluir el anticuerpo primario en el suero de burro al 10% si el 10% de suero asno fue utilizado para bloquear o diluir el anticuerpo primario de 3% de BSA, si el 3% BSA solución de bloqueo se utiliza. Incubar con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. </li><li> Aspirar el anticuerpo, lavar los pocillos con 400μl PBS durante 15 minutos y repetir dos veces. Aspirar el PBS y añadir 200μl de burro anti-respectiva-IgG conjugado con rodamina rojo (dilución debe ser determinada empíricamente), la cubierta de la diapositiva cámara de 8 con papel de aluminio y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los pocillos con PBS 400μl (3x15 minutos cada lavado). Aspirar PBS. Montadas con Vectashield medio de montaje con DAPI. Portaobjetos secos durante 40 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las diapositivas se pueden conservarse durante una semana a 4 ° C. Tienda de las diapositivas en la oscuridad. Imagen se desliza por microscopía confocal. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Un ejemplo de un análisis de la proliferación de la D2.0R latente y metastásico D2A1 las células tumorales en la cultura en 3D se muestra en la Figura 1. Células D2.0R están inactivos (inactivo) a través de todo el período experimental 14 días mientras que la cultura altamente metastásico D2A1 células permanecen inactivas sólo de cuatro a seis días después de que empiezan a proliferar. Durante la fase de letargo inicial, muchas células permanecen solitarios en la cultura 3-D (Figura 1 B, el día 4), ​​mientras que otras células no proliferantes forma esferoides multicelulares. La transición de D2A1 células de un inactivo a estado proliferativo en 3-D de cultivo (Figura 1B, día 12) se asocia con cambios drásticos en la morfología celular. Por lo tanto, este ensayo puede ser utilizado para probar qué factor / s pueden desencadenar las células inactivas D2.0R a salir de su estado latente y qué factor / s puede prevenir D2A1 células de transición de su estado latente. Figura 2 es un ejemplo de un agente la prevención de D2A1 células de transición de un estado latente de proliferación. Como se ilustra en la Figura 2, los tratamientos de D2A1 células con un inhibidor específico de la cinasa de cadena ligera de miosina (ML-7) mantiene D2A1 células en un estado latente. Señalización celular en las células tumorales latentes y la proliferación de cultivos en el sistema 3D puede ser estudiada por inmunofluorescencia para las moléculas de señalización celular. Como se ilustra en la Figura 3 un aumento significativo en la fosforilación de la miosina de cadena ligera en D2A1 células (tinción con rojo), seguido por la reorganización de los filamentos de actina F que forman las fibras de actina estrés (tinción verde) se produce durante la transición de la latencia (1-4 días) proliferación (día 7). Sin embargo, el bloqueo de la cadena ligera de la miosina actividad de la cinasa en las células D2A1 por ARNhc o medicamento específico (ML-7) mantiene D2A1 células en un estado latente y los resultados en la inhibición de la fosforilación de la miosina de cadena ligera y F-actina organización de fibra de estrés (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig1.jpg" /> Figura 1. Modelo in vitro para estudiar la latencia de aislamiento de las células tumorales y el cambio hacia el crecimiento metastásico. A) La proliferación de D2.0R latente y D2A1 metastásico en 3-D BME Cultrex, n = 8 (media ± DE). Los resultados representativos de tres experimentos (* p ≤ 0,05). B) Las imágenes de microscopía de luz y las células de D2.0R D2A1 cultivadas en 3-D x20 aumentos Cultrex BME.Figura modificada de Barkan et al 17. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig2.jpg" /> Figura 2. Evitar que el interruptor de D2A1 células de latencia (reposo) a la proliferación en el sistema de cultivo en 3D mediante la inhibición de la cinasa de cadena ligera de miosina (MLCK). Curso del tiempo de la proliferación celular D2A1 cultivadas en 3-D BME Cultrex, n = 8 (media ± DE). Las células fueron tratadas (control), o tratados con un inhibidor específico de MLCK (ML-7, 5 M) para el comienzo de 48 horas en el día de la cultura 5. Figura modificada de Barkan et al 17. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig3.jpg" /> Figura 3. Fosforilación de la miosina de cadena ligera seguida por la reorganización de F-actina durante el cambio de D2A1 células de latencia de crecimiento proliferativo. D2A1 células fueron cultivadas en 3-D BME Cultrex el 8 de portaobjetos de vidrio de cámara. Las células fueron fijadas y teñidas con DAPI (azul) para la localización nuclear, phalloidin (verde) de F-actina y con un anticuerpo contra la forma fosforilada de la cadena ligera de la miosina (MLC-p) (rojo), como se indica en diversos puntos temporales. Fusión de la F-actina, y MLC-p coloración (amarillo). Expresión de la CTM-p se incrementó durante la transición de las células D2A1 de latencia (días1-4) para el crecimiento proliferativa (día 7) seguido por la formación de fibras de actina estrés (flechas). La microscopía confocal, la ampliación x63. Barra blanca es igual a 20 micras. Figura modificada de Barkan et al 17. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2914/2914fig4.jpg" /> Figura 4. . Inhibición de la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK) mediada por la F-actina formación de fibras de estrés en las células D2A1 D2A1 Las células fueron tratadas (control), o tratados con un inhibidor de la MLCK (ML-7, 5 M), para el inicio de 48 horas en el día de la cultura 5, o tratados con huevos revueltos o ARNhc MLCK y teñidas de la forma fosforilada de la cadena ligera de la miosina (MLC-p) (rojo), f-actina (verde), y los núcleos (azul). Fusión de la F-actina, y MLC-p coloración (amarillo). La microscopía confocal, la ampliación x63. Barra blanca es igual a 20 micras.

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	<li>Aguirre-Ghiso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models,+mechanisms+and+clinical+evidence+for+cancer+dormancy.">Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy.</a> Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).</li><li>Pantel, K., Woelfle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micrometastasis+in+breast+cancer+and+other+solid+tumors.">Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors.</a> J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffectiveness+of+doxorubicin+treatment+on+solitary+dormant+mammary+carcinoma+cells+or+late-developing+metastases.">Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases.</a> Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).</li><li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Framework+models+of+tumor+dormancy+from+patient-derived+observations.">Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations.</a> Curr Opin Genet Dev. , (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+solitary+mammary+carcinoma+cells+in+a+secondary+site:+a+possible+contributor+to+dormancy.">Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy.</a> Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).</li><li>Townson, J. L., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dormancy+of+solitary+metastatic+cells.">Dormancy of solitary metastatic cells.</a> Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).</li><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li><li>Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proliferation-associated+molecules+in+individual+micrometastatic+carcinoma+cells.">Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).</li><li>Demicheli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+dormancy:+findings+and+hypotheses+from+clinical+research+on+breast+cancer.">Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).</li><li>Braun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pooled+analysis+of+bone+marrow+micrometastasis+in+breast+cancer.">A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer.</a> N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).</li><li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+micrometastases.">Cancer micrometastases.</a> Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).</li><li>Goss, P. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+tumour+dormancy+offer+a+therapeutic+target.">Does tumour dormancy offer a therapeutic target.</a> Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).</li><li>Mendoza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metastasis+biology+and+therapy+in+real+time+in+the+mouse+lung.">Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung.</a> J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).</li><li>Naumov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+human+tumor+dormancy:+an+angiogenic+switch+from+the+nonangiogenic+phenotype.">A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype.</a> J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).</li><li>Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix:+A+gatekeeper+in+the+transition+from+dormancy+to+metastatic+growth.">Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth.</a> Eur J Cancer. , (2010).</li><li>Barkan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+metastatic+outgrowth+from+single+dormant+tumor+cells+by+targeting+the+cytoskeleton.">Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton.</a> Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Morris, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+carcinoma+cell+lines+of+high+and+low+metastatic+potential+differ+not+in+extravasation+but+in+subsequent+migration+and+growth.">Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth.</a> Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Los mecanismos subyacentes que mantienen difundido las células tumorales en un estado latente o como resultado de su transición hacia un crecimiento metastático siguen siendo desconocido. Este fenómeno ha sido muy difícil de estudiar en pacientes humanos 4,12 y pocos modelos preclínicos se han desarrollado para abordar esta cuestión. Sin embargo, algunos en vivo y ex vivo modelos de sistemas de latencia del tumor se han caracterizado (revisado en 1,12). Sin embargo, los <em...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> DMEM altos de glucosa </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM bajos de glucosa </td><td> Invitrogen </td><td> 11885-092 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (SFB) </td><td> Invitrogen </td><td> 10091-148 </td><td></td></tr><tr><td> El factor de crecimiento reducido en 3-D Sótano Cultrex extracto de membrana </td><td> Trevigen Inc. </td><td></td><td> Concentración de proteínas entre 14-15mg/ml </td></tr><tr><td> D2.0R D2A1 y líneas celulares </td><td></td><td></td><td> 5,19 </td></tr><tr><td> K7M2 y K7M2AS1.46 células </td><td></td><td></td><td> 20 </td></tr><tr><td> MCF-7 y MDA-MB-231 células de cáncer de mama </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Un vaso de 8 cámara de diapositivas del sistema </td><td> (Lab-Tek, Thermo Scientific) </td><td> 177402 </td><td></td></tr><tr><td> Celular Titer 96 Una célula acuosa Solución proliferación kit de ensayo </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield medio de montaje con DAPI </td><td> Vector Laboratories Inc. </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Suero normal de burro </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 017-000-121 </td><td></td></tr><tr><td> Lector de placas ELISA </td><td> Bio-Tec </td><td></td><td> 490nm registro </td></tr><tr><td> Microscopio confocal </td><td> Zeiss-LSM-510 </td><td></td><td> Ampliación x63 </td></tr></tbody></table>

an in vitro system to study tumor dormancy and the switch to metastatic growth

La recurrencia de cáncer de mama a menudo sigue a un período de latencia en el que no hay signos de cáncer y las metástasis pueden no ser clínicamente evidentes hasta muchos años después de la extirpación del tumor primario y la terapia adyuvante. Una probable explicación de este fenómeno es que las células tumorales han sembrado los sitios de metástasis, son resistentes a las terapias convencionales, y permanecer latente durante largos períodos de tiempo 1.4. La existencia de las células del cáncer latente en sitios secundarios se ha descrito previamente como reposo celdas de aislamiento que no proliferan ni la apoptosis 5-7. Además, estas celdas de aislamiento se ha demostrado que la difusión del tumor primario en una etapa temprana de la progresión de la enfermedad 80-10 y residir crecimiento detenido de nuevo en la médula ósea del paciente, la sangre y los ganglios linfáticos 1,4,11. Por lo tanto, comprender los mecanismos que regulan la latencia o el salto hacia un estado proliferativo es fundamental para el descubrimiento de nuevos objetivos y las intervenciones para prevenir la recurrencia de la enfermedad. Sin embargo, desentrañar los mecanismos que regulan el paso de la latencia del tumor de crecimiento metastásico se ha visto obstaculizada por la falta de sistemas de modelos disponibles. in vivo y ex vivo sistemas modelo para estudiar la progresión metastásica de las células tumorales se han descrito anteriormente 1,12-14. Sin embargo estos sistemas no han proporcionado el modelo en tiempo real y en una visión de alto rendimiento en forma mecánica lo que desencadena la aparición de células tumorales latentes solitario a proliferar como la enfermedad metastásica. Recientemente hemos desarrollado un sistema in vitro 3D para modelar el crecimiento en las características in vivo de células que presentan un comportamiento metastásico o latente (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) o proliferativa (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) en vivo. Hemos demostrado que las células tumorales que exhiben latencia en vivo en el lugar de la metástasis permanecer en reposo cuando se cultivan en un niño de 3 dimensiones (3D) el extracto de la membrana basal (BME), mientras que las células altamente metastásico in vivo fácilmente proliferan en la cultura 3D después de variables, pero relativamente corto períodos de inactividad. Es importante destacar que mediante la utilización del 3D en el sistema de modelo in vitro se demostró por primera vez que la composición ECM desempeña un papel importante en la regulación de las células tumorales inactivas si se cambia a un estado proliferativo y lo han confirmado en estudios in vivo 15-17. Por lo tanto, el sistema de modelos descritos en este informe proporciona un método in vitro a la latencia modelo de tumor y el estudio de la transición hacia un crecimiento proliferativo inducido por el microambiente.

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An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Una modificación en 3-D in vitro sistema se presenta en el que las características del crecimiento de varias líneas de células tumorales en la membrana basal reconstituida se correlacionan con el comportamiento inactivo o proliferativa de las células tumorales en un sitio secundario metastásico<em&gt; In vivo</em&gt;.

Un In Vitro Sistema para el Estudio de latencia del tumor y el salto hacia el crecimiento metastásico

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

15.7K vistas.  University of Haifa. Una modificación en 3-D in vitro sistema se presenta en el que las características del crecimiento de varias líneas de células tumorales en la membrana basal reconstituida se correlacionan con el comportamiento inactivo o proliferativa de las células tumorales en un sitio secundario metastásico In vivo.

Video: An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

Utilizando estimulación magnética transcraneal para Estudiar el Sistema Neuromuscular Humanos

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Investigación

Medicina

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

La medición y tratamiento de la represión en la ambliopía

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Establecimiento de un modelo de xenoinjerto Humano mieloma múltiple en el pollo para estudiar el crecimiento del tumor, la invasión y la angiogénesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

La inyección de células de melanoma murino singénico para determinar su potencial metastásico en los pulmones

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Usando proyección de imagen retiniana para el estudio de la demencia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...

Surgical Labyrinthectomy of the Rat to Study the Vestibular System

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including surgical or chemical labyrinthectomy and vestibular neurectomy. Surgical labyrinthectomy is a relatively simple, reliable, and rapid method. Here, we describe the surgical technique for rat labyrinthectomy. A postauricular incision is made under general anesthesia to expose the external auditory canal and the tympanic membrane, after which the tympanic membrane and the ossicles are removed without the stapes. The stapes artery, which is located between the stapes and the oval window, is a vulnerable structure and must be preserved to obtain a clear surgical field. A hole to fenestrate the vestibule is made with a 2.1-mm drill bur superior to the stapes. Then, 100% ethanol is injected through this hole and aspirated several times. Meticulous dissection under a microscope and careful bleeding control are essential to obtain reliable results. Symptoms of vestibular loss, such as nystagmus, head tilting, and a rolling motion, are seen immediately after surgery. The rotarod or rotation chair test can be used to objectively and quantitatively evaluate the vestibular function.

This protocol describes the surgical labyrinthectomy of a rat, which is a useful method for studying the vestibular system.

Labyrinthectomy quirúrgica de la rata para el estudio del sistema Vestibular

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...

Protocolo Tuina estandarizado para el modelo de compresión DRG de ratas

Analgesic Effect of Tuina on Rat Models with Compression of the Dorsal Root Ganglion Pain

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar disc herniation, spinal canal stenosis, and intervertebral foramen stenosis. Although Tuina, a traditional Chinese manual therapy, has shown analgesic effects in clinical practice for the treatment of neuropathic pain, its underlying neurobiological mechanisms remain unclear. Animal models are essential for elucidating the basic principles of Tuina. In this study, we propose a standardized Tuina protocol for rats with compression of the dorsal root ganglion (DRG), which involves inducing DRG compression by inserting a stainless steel rod into the intervertebral foramen, performing Tuina manipulation with specific parameters of location, intensity, and frequency in a controlled environment, and assessing the behavioral and histopathological outcomes of Tuina treatment. This article also discusses the potential clinical implications and limitations of the study and suggests directions for future research on Tuina.

Autor destacado: Efecto analgésico de Tuina en modelos de ratas con compresión del dolor del ganglio de la raíz dorsal  

This article presents a manipulation for treating chronic compression of the dorsal root ganglion in rats using Tuina therapy, along with a method for evaluating its effectiveness based on pain behavior and histopathological results.

Efecto Analgésico de Tuina en Modelos de Ratas con Compresión del Dolor del Ganglio de la Raíz Dorsal

Neuropathic pain is a prevalent condition that affects 6.9%-10% of the population and results from nerve damage due to various etiologies, such as lumbar ...