Creamos un modelo individual rico en colágeno para imitar el entorno que las células experimentan in vivo utilizando la técnica de aglomeración macromolecular. La piel es un ambiente lleno de gente, a diferencia del ambiente líquido que ya utilizamos para cultivar células in vitro. En comparación con el sistema tradicional de cultivo celular monocapa, este modelo recrea el ambiente molecular abarrotado que las células experimentan in vivo, especialmente en los tejidos cicatriciales donde abundante matriz extracelular desplaza el agua líquida.
Además de las cicatrices hipertróficas, esta técnica de hacinamiento macromolecular se puede utilizar para estudios donde la matriz extracelular es abundante, como la fibrosis pulmonar. Cultivar fibroblastos normales y derivados de cicatrices de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego sembrarlas en 24 placas de pozo a 50.000 células por pozo en un mililitro de medio.
Incubar la placa durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Prepare el hacinamiento macromolecular o los medios MMC mezclando Ficoll 70, Ficoll 400 y ácido ascórbico en 10%FCS DMEM. Incubar los medios en un baño de agua para dispersar a los hacinadores en la solución.
A continuación, esterilizarlo con un filtro de 0,2 micrómetros. Aspirar los medios gastados de los fibroblastos y reemplazarlos por medios MMC recién hechos. Incubar las células a 37 grados centígrados durante seis días, cambiando los medios de MMC cada tres días.
Preparar una solución Sirius Red disolviendo 0,2 gramos de polvo Direct Red 80 en 200 mililitros de agua desionizada destilada con un mililitro de ácido acético. Aspirar los medios MMC de las células y añadir 300 microlitros de la solución Sirius Red a cada pozo. Luego devuelva las células a la incubadora durante 90 minutos.
Después de la incubación, enjuague suavemente la solución Sirius Red con agua del grifo y deje que la placa se seque al aire durante la noche. Al día siguiente, extraiga el Sirius Red añadiendo 200 microlitros de 0,1 molar de hidróxido de sodio en cada pozo y agitando la placa durante cinco a 10 minutos. Transfiera 100 microlitros de la mancha extraída a una placa transparente de 96 pozos y mida la absorbancia a 620 nanómetros con un lector de microplamas.
Lave cada pozo con 200 microlitros de PBS y fije las células con metanol a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, añadir 3%BSA a los pozos e incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Aspirar la solución de bloqueo y añadir 200 microlitros de anti-colágeno un anticuerpo a cada pozo.
Incubar el plato durante 90 minutos. A continuación, aspirar el anticuerpo y lavar los pozos tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Añadir 200 microlitros de Goat Anti-Rabbit-FITC Secondary Anticuerpo y DAPI a cada pozo.
Cubra la placa con papel de aluminio e incubarlo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Deseche el anticuerpo secundario y el DAPI y repita los lavados con PBS. A continuación, visualice la fluorescencia directamente bajo un microscopio.
Después de lavar las células dos veces con PBS, agregue 40 microlitros de tampón de lysis en cada pozo y raspe la capa celular con una punta de pipeta. A continuación, transfiera el izado proteico a tubos de micro centrífuga para medir la concentración de proteínas. Cargue 10 microgramos de proteína en cada pozo de un gel proteico de cuatro a 12%Bis-Tris y realice SDS-PAGE a 200 voltios durante 30 minutos.
Cuando haya terminado, transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa ejecutando una mancha occidental a 90 voltios durante 90 minutos, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas entre el gel y la membrana. Bloquee la membrana con 10 mililitros de tampón de bloqueo. Luego incubarlo con anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, lave la membrana cinco veces con 0.1 por ciento de TBS Tween 20 durante cinco minutos por lavado. A continuación, incubar la membrana con un anticuerpo secundario apropiado para la especie durante una hora a temperatura ambiente. Repita los lavados y visualice la fluorescencia con un sistema de imágenes.
Después de purificar el ARN total con un kit comercial de extracción de ARN, mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de micro volumen. A continuación, utilice un kit de síntesis de ADNc para realizar una síntesis de ADN de primera hebra. Mezcle el ADNc con 10 microlitros de SYBR Green Supermix y transfiera las muestras a una placa personalizada de 96 pozos pre-recubierta con imprimadores de oligonucleótidos.
Ajuste el volumen total a 20 microlitros por pozo con agua y ejecute RT-PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. La densidad celular de los fibroblastos de piel humana derivados de cicatrices hipertróficas aumentó significativamente después del cultivo con Ficoll en comparación con el uso de PVP o el control. El hacinamiento macromolecular con Ficoll a una ocupación de volumen de 9% fraccionado mejoró significativamente la deposición de colágeno, incluido el colágeno, en comparación con otras formulaciones.
Esto se demostró aún más con el análisis cuantitativo. Se encontró fibroblastos derivados de cicatrices y fibroblastos dérmicos normales cultivados en ambientes de MMC para regular la expresión de especies de ECM además de colágeno. En particular, se encontró que una expresión elevada de metaloproteinasas de matriz o MMP se acumulaba en tejidos cicatriciales hipertróficos en comparación con los tejidos nativos.
Se observó que la expresión de MMP2, nueve y 13 estaba significativamente regulada en ambos cultivos celulares cultivados en condiciones de hacinamiento macromolecular. Los MMP desempeñan un papel importante durante la cicatrización de heridas y la formación de cicatrices, regulando el montaje y la remodelación de ECM. La síntesis de interleucina seis y el factor de crecimiento endotelial vascular era indetectable en una mancha occidental.
Pero el análisis de RT-PCR reveló que la expresión de la interleucina seis estaba significativamente regulada hacia arriba, mientras que la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular estaba regulada hacia abajo en fibroblastos cultivados en condiciones de MMC. Al intentar este protocolo, es muy importante elegir fibroblastos dérmicos que tengan muy pocos patógenos de CO. También tenemos que tener en cuenta que el ácido ascórbico es un ingrediente esencial en el medio MMC.
Estamos particularmente interesados en detectar aún más la deposición y alineación del colágeno en este modelo MMC. Planeamos utilizar técnicas microscópicas avanzadas para comparar este modelo in vitro con los tejidos cicatriciales nativos in vivo. Animamos a otros a utilizar esta técnica de hacinamiento macromolecular para mejorar la autenticidad in vitro de los tejidos modales auxiliares.
Por supuesto, el hacinamiento macromolecular también se puede utilizar para recalcular modelos de enfermedad y patología in vitro.
