Estos métodos pueden ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de los biomateriales. Particularmente para la regeneración ósea. Se utilizan para evaluar la eficacia de los biomateriales y las posibles respuestas inmunitarias.
La principal ventaja de esta plataforma multidisciplinar es que proporciona una gama de parámetros para predecir la biocompatibilidad de los biomateriales utilizados para la reparación ósea. Las implicaciones de estas técnicas óseas in vitro e in vivo se extienden hacia otros trastornos óseos. Debido a la necesidad de cribado preclínico de nuevos biomateriales ortopédicos.
La metodología dermatológica puede proporcionar información sobre biomateriales para la cicatrización ósea, también se puede aplicar a las evaluaciones de biomateriales para cualquier otra indicación clínica. Aspirar medio de cultivo de osteoblastos primarios 14 días después de la adición de medio de mineralización osteogénico. Enjuagar dos veces con 0,5 mililitros de 1X PBS.
Luego fije las células agregando 0,5 mililitros de 10% de solución de formalina tamponada e incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de 10 minutos, aspirar el 10% de formalina tamponada con una pipeta de un solo uso y lavar dos veces con 0,5 mililitros de agua ultrapura. A continuación, añada 250 microlitros de 40 mililitros de solución de tinción Alizarin Red S a los osteoblastos fijos.
E incubar el plato a temperatura ambiente durante 10 minutos en una coctelera a 100 batidos por minuto. Después de la incubación con solución de tinción, aspirar la solución de tinción con una pipeta de un solo uso y enjuagar con un mililitro de agua ultrapura. Repita este paso de cinco a 10 veces hasta que la solución de enjuague se despeje para eliminar las manchas inespecíficas.
Después de aspirar el lavado final, agregue un mililitro de PBS frío. E incubar el plato a temperatura ambiente durante 10 minutos en una coctelera como antes. A continuación, transfiera los discos de fosfato tricalcio beta teñido a un nuevo pozo y escanee las placas con un escáner plano para registrar la mineralización.
Después de la captura de la imagen, añadir 250 microlitros de 10%solución de cloruro de cepilpiridinio y agitar durante 15 minutos para extraer el tinte Alizarin Red S. A continuación, transfiera la solución de los pozos a tubos individuales de 1,5 mililitros y centrífuga a 17.000 x g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Diluir el extracto con una solución de cloruro de 10%cetilpiridinio a una ración de dilución de 1:10 a 1:20 en un tubo de 1,5 mililitros.
A continuación, transfiera 300 microlitros de cada muestra diluida a los pozos de la placa de 96 pozos. Incluya dos pozos en blanco que contengan sólo cloruro de 10%cetilpiridinio. A continuación, prepare siete estándares de referencia De Alizarin Red S que van desde 4 400 micromolares diluyendo 40 mililitrolar alizarin Red S solución de tinción con 10%solución de cloruro de cetilpiridinio para generar una curva estándar.
Cargue 300 microlitros de cada estándar en la placa. Por último, lea los absorbentes de las muestras, los espacios en blanco y las normas de referencia a 520 nanómetros. Aísle los precursores del osteoplasto de médula ósea de los fémures y tibias de un ratón eutanizado mediante el uso de tijeras estériles para eliminar las piernas del cuerpo en la articulación de la cadera.
Corta las extremidades de las articulaciones de la rodilla y el tobillo y retira el tejido blando con bisturí estéril y fórceps. Corta las epífisis. Inserte una aguja de calibre 27 unida a una jeringa llena de un mililitro de medio de crecimiento óseo en el lumen y enjuague la médula en una placa petri estéril de seis centímetros.
Después de repetir esto para todos los fémures y tibias, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros. Lave el plato Petri de seis centímetros con cinco mililitros de medio de crecimiento óseo y transfiéralo al mismo tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar a 350 x g a cuatro grados Centígrados durante cinco minutos.
Después de la centrifugación re-suspender las células en un mililitro por pozo de medio de diferenciación osteoclasta. Un ratón BALB/c proporciona un número suficiente de precursores osteoclastos para una placa de cultivo de 24 pozos. Añadir osteoblastos primarios suspendidos en el medio de crecimiento óseo en el biomaterial y los controles a 8,8 * 10 x 4 células por centímetro cuadrado.
Aquí se utilizan discos de fosfato beta tricalcio, hueso bovino controlado y plástico de cultivo tisular. Incubar a 37 grados centígrados en cinco por ciento de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de 24 horas, añadir precursores osteoclastos de médula ósea recién aislados y el medio de diferenciación osteoclasto a los osteoblastos primarios cultivados y volver a la incubadora durante cinco días de cultivo a 37 grados centígrados al cinco por ciento de dióxido de carbono.
Sustituya el medio por un medio de diferenciación osteoclasal recién preparado cada dos días. A continuación, manche osteoclastos para fosfatasa ácida resistente al tartrato para evaluar la diferenciación. Afeitar el cuero cabelludo de un ratón BALB/c anestesado de ocho semanas de edad y limpiar la superficie con una solución de yodo 7,5%povidona y un 70% de etanol.
Cubra los ojos con pomada oftálmica para evitar el secado durante el procedimiento. Asegurar un nivel adecuado de anestesia por falta de una reacción a un pellizco de dedo del dedo del final y la cola. Luego, después de hacer una incisión sagital de línea media, retire los tejidos conectivos de paracanio por encima del hueso parietal derecho raspándolo con un bisturí.
A continuación, utilice una treptina dental estéril con un diámetro de cuatro milímetros a 2000 rotaciones por minuto para crear un defecto de tamaño crítico en el hueso parietal derecho. Irrigar constantemente la región con solución salina estéril mientras observa el hueso parietal adecuado y corta a través del ectocortexto y un poco de endocortex. Para evitar daños en el Dera Mater, utilice un pequeño elevador periosteal para atravesar el endocortex restante.
Luego usa fórceps para levantar cuidadosamente el hueso calvarial y retíralo. El defecto resultante debe ser circular y de aproximadamente 3,5 milímetros de diámetro. A continuación, llene el defecto calvarial con espuma de colágeno de fosfato de trimálcico beta, presoaked en PBS estéril.
Para mantener el biomaterial en su lugar, aplique 0,5 microlitros de adhesivo de tejido al final del defecto en dos puntos opuestos. A continuación, cierre la piel con una sutura no absorbible. Coloque un ratón anestesiado en su espalda, afeite el pelaje abdominal y limpie la superficie afeitada con una solución de yodo 7,5%povidona y un 70% de etanol.
Después de hacer una incisión de línea media de ocho milímetros de largo a través de la piel a lo largo de la linea alba del abdomen, implante biomaterial empapado PBS debajo de la piel. A continuación, suturar la piel con una sutura no absorbible. Ocho semanas después de la implantación, extirpar el sitio de implantación con el tejido circundante del ratón eutanizado.
Esta imagen demuestra que el crecimiento de los discos de fosfato beta tricalcio que se muestran en las barras abiertas no afecta a la viabilidad del osteoblasto en comparación con el crecimiento en el cultivo de tejidos plásticos a los siete y 14 días de cultivo. Los osteoblastos cultivados se tiñeron con Alizarin Red S después de 14 días. La mineralización fue mayor para los controles de medios de mineralización en comparación con los osteoblastos cultivados solo en medio.
Y en discos de fosfato beta tricalcio en pozos de cultivo de suspensión. Cuando se dejó vacío un defecto calvarial de tamaño crítico inducido quirúrgicamente, se observó una capa delgada que cubría todo el defecto, pero no hubo una formación ósea significativa a las 12 semanas después de la operación. En contraste, cuando el defecto contenía espuma de colágeno de fosfato beta tricalcio, restos de espuma rodeados de tejido fibroso denso, incluyendo algunos vasos sanguíneos y células inflamatorias puentearon el área del defecto sin evidencia de formación ósea.
Después de la implantación de espuma de colágeno de fosfato beta tricálcico subcutáneo, se observó una respuesta inflamatoria con células gigantes de cuerpos extraños en las secciones de hematoxilina y teñida de Eosin, una evidencia de fibrosis en las secciones tricromáticas de Masson a las ocho semanas. Por el contrario, el lugar de implantación de los controles falsos tenía una inflamación mínima y ninguna fibrosis. Al intentar este procedimiento es importante hacer muesca precisa y reproducible del calvario sin herir al animal.
Siguiendo los otros métodos de este procedimiento, como los ensayos de diferenciaciones osteoclasales y el alto rendimiento en modelos inmunes peritoneales, pueden ser preformados para responder preguntas adicionales como la respuesta del osteoclasto a los biomateriales y el tipo de respuesta inmune.
