Reconocemos Silke Sachse y Beate Eisermann en el desarrollo de esta metodología, Pablo Traversa para la elaboración de los planos de montaje del bloque y Pelz Daniela para el uso del esquema de la Figura 1. Estamos muy agradecidos a Silke Sachse, Ramdya Pavan y Rafael Rytz de comentarios sobre el manuscrito. R. Bell con el apoyo de una Fundación Boehringer Ingelheim doctorado de Becas. La investigación en el laboratorio de R. Benton es financiado por un Consejo Europeo de Investigación Starting Grant Investigador Independiente y el Swiss National Science Foundation.

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	<li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+olfactory+systems+in+insects:+anatomy+and+function.">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li><li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila.">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li><li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+olfactory+processing.">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li><li>Masse, N. 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Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila.">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li><li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).</li><li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system.">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li><li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de preparación y análisis descritos aquí se pueden utilizar para analizar los olores de respuestas evocadas en una población de neuronas en el lóbulo antenal (OSN, LN y PN) para los que un transgén de conducir correspondiente está disponible. Mientras que se describe su aplicación mediante un microscopio de fluorescencia, imágenes ópticas de esta preparación igualmente se puede realizar utilizando microscopía confocal o dos fotones 22,32. De hecho, estos últimos instrumentos aliviar el problema de dispersión de luz de amplio campo de la microscopía, que puede reducir la resolución de las imágenes, especialmente cuando un gran número de neuronas expresa del reportero. Esta preparación por lo general permite grabaciones de olor de respuestas evocadas por lo menos durante media hora, pero esta vez puede ser significativamente más larga o más corta dependiendo de la cantidad y la duración de las mediciones registradas, el tiempo de exposición para cada cuadro y el intervalo entre estímulos. Por otra parte, la excitación de dos fotones puede reducir photobleaching de la representante de fluorescentesorter, así como fototoxicidad celular, para permitir la medición durante períodos de tiempo más largos 22,32. Independientemente de la elección del microscopio, el movimiento del cerebro de la mosca dentro de la cápsula de la cabeza es el problema más recurrente cuando la imagen en animales intactos. Mientras que la corrección de movimiento puede corregir problemas menores (paso 5.1), por lo general es mejor sólo para grabar a partir de preparaciones de gran estabilidad. Las estrategias para reducir los artefactos de movimiento incluyen: (i) debidamente limitar la probóscide de la mosca con la espina de cactus, (ii) la inmovilización de las piernas de la mosca por su fijación en el escenario con eicosano (antes de la etapa 2.6) (eicosano pueden ser disueltos a ~ 37 ° C, use un alambre de plata para ampliar y afinar la punta del soldador para este propósito), (iii) hacer muescas en el esófago (visible entre los nervios de las antenas) con unas pinzas finas. Además de G-CaMP1.6 utiliza aquí, una serie de versiones optimizadas de G-CAMP y otros indicadores de calcio están disponibles,que difieren en su relación señal-ruido, la fluorescencia basal y dinámica temporal 12,28,33. La elección precisa de los sensores deben tener en cuenta todas estas propiedades, el tipo de neuronas a analizar y la cuestión biológica que se aborde. Sensores de corriente de calcio informar de los cambios que se correlacionan bastante bien con los potenciales de acción 12,34, y su mejora, junto con el creciente número de líneas específicas de impulso genético 35 seguirá mejorando el potencial de la imagen óptica de la actividad neuronal en la mosca intacto.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cactus columna </td><td> Garden Center </td><td></td><td> ~ 7 mm de largo y delgado, no demasiado flexible </td></tr><tr><td> Colofonia </td><td> Cadena de tienda de instrumentos </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dos componentes de silicio </td><td> IPM </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Una medida que se bloque de plexiglás de montaje </td><td> Planos disponibles en <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Redes de cobre </td><td> Atenea Rejillas </td><td> G220-5 </td><td> Normalmente se utiliza para muestras de microscopía electrónica. </td></tr><tr><td> Tornillos </td><td> Ferretería </td&gt; <td></td><td> 2 mm de diámetro </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de plástico </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> Puntas de soldadura de hierro </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Suministro de energía regulada </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Alambre delgado </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eicosano </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Adquisición de software </td></tr><tr><td> Monocromador </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Hojas Rompibles </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Titular de la hoja </td><td> IPM </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire hoja de </td><td> IPM </td><td> 500314 </td><td> Hoja de 1 mm de doble filo </td></tr><tr><td> Las bombas de membrana de gas </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire soporte de la cuchilla </td><td> IPM </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Válvula de tres posiciones </td><td> Lee Company </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configuración de correo </td></tr><tr><td> Rotámetro 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotámetro 5 l / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Cera de abejas </td><td> SILADENT Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Celulosa pad </td><td> Kettenbach Médico </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biología # 5 </td></tr><tr><td> Jeringas </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> Agujas </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 mm de diámetro exterior </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

El lóbulo antenal es el principal centro olfativo en el cerebro del insecto, y representa el equivalente anatómico y funcional del bulbo olfatorio de vertebrados 1-5. Información olfativa en el mundo exterior se transmite hasta el lóbulo antenal por las neuronas sensoriales olfativas (OSN), que segregan a regiones distintas de neuropilo llamados glomérulos de acuerdo con el receptor específico olfativa que expresan. En este caso, OSN axones hacen sinapsis con dos interneuronas locales (LN), cuyos procesos pueden inervar muchos glomérulos diferentes, y las neuronas de proyección (SNP), que transmiten la información olfativa a las regiones superiores del cerebro olfativo. Imágenes ópticas de la actividad de la OSN, LNS y RdP en el lóbulo antenal - Tradicionalmente, la utilización de indicadores sintéticos de calcio (por ejemplo, calcio verde, FURA-2) o sensibles al voltaje colorantes (por ejemplo, RH414) - ha sido durante mucho tiempo una técnica importante para entender cómo olfativa estímulos se representan como patrones espaciales y temporalesde la actividad glomerular en muchas especies de insectos 6-10. Desarrollo de organismos genéticamente codificados en la prensa de la actividad neural, tales como los indicadores de calcio fluorescentes G-CAMP 11,12 y 13 Cameleon, el indicador de calcio bioluminiscente GFP-aequorin 14,15, o un reportero de la transmisión sináptica, synapto pHluorin-16 ha hecho que el sistema olfatorio de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular acceso a las imágenes neurofisiológico, como complemento de sus ampliamente descritas las propiedades moleculares, electrofisiológicas y neuroanatómicas 2,4,17. Estos reporteros se expresa selectivamente a través de sistemas binarios de control de transcripción (por ejemplo, GAL4/UAS 18, la serie LEXA / LexAop 19,20, sistema de Q 21) en poblaciones definidas de neuronas dentro del circuito olfatorio para diseccionar con alta resolución espacial y temporal de la forma de olor evoca la actividad neuronal está representado, modularse y transformarse 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Aquí se describen los métodos de preparación y análisis para medir el olor de respuestas evocadas en el lóbulo antenal Drosophila usando G-CAMP 25-27. La preparación de los animales es mínimamente invasivo y se puede adaptar a las imágenes de campo amplio uso de microscopios de fluorescencia, confocal y dos fotones.

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de vida<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

25.7K vistas.  University of Lausanne. Se describe una técnica establecida para medir y analizar el olor de respuestas evocadas de calcio en el lóbulo antenal de vida Drosophila melanogaster.