Nous reconnaissons Silke Sachse et Beate Eisermann dans le développement de cette méthodologie, Pablo Traversa pour dessiner les plans de blocs de montage et Daniela Pelz pour l&#39;utilisation du schéma de la figure 1. Nous sommes reconnaissants à Silke Sachse, Pavan Ramdya et Raphaël Rytz pour les commentaires sur le manuscrit. R. Bell est soutenu par une bourse de la Fondation Boehringer Ingelheim doctorat. Recherche dans le laboratoire de R. Benton est financé par un Conseil européen de la recherche Starting Grant chercheur indépendant et le Fonds national suisse.

<ol>
	<li>Galizia, C. G., Rossler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+olfactory+systems+in+insects:+anatomy+and+function.">Parallel olfactory systems in insects: anatomy and function.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 399-420 (2010).</li><li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Architecture+of+Smell+and+Taste+in+Drosophila.">Molecular Architecture of Smell and Taste in Drosophila.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 505-533 (2007).</li><li>Wilson, R. I., Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+olfactory+processing.">Early events in olfactory processing.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 163-201 (2006).</li><li>Masse, N. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies.">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li><li>Abuin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+olfactory+ionotropic+glutamate+receptors.">Functional architecture of olfactory ionotropic glutamate receptors.</a> Neuron. 69, 44-60 (2011).</li><li>Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les méthodes de préparation et d&#39;analyse décrites ici peuvent être utilisées pour analyser les odeurs réponses évoquées dans une population de neurones dans le lobe antennaire (ARS, LN et PNS) pour lequel un transgène pilote correspondant est disponible. Alors que nous décrivons son application en utilisant un microscope à fluorescence, l&#39;imagerie optique de cette préparation peut également être effectuée en utilisant la microscopie confocale à deux photons ou 22,32. En effet, ces derniers instruments d&#39;atténuer le problème de la diffusion de la lumière à large champ microscopique, ce qui peut réduire la résolution des images, notamment lorsqu&#39;un grand nombre de neurones expresse de la journaliste. Cette préparation permet généralement des enregistrements de mauvaises odeurs réponses évoquées pendant au moins une demi-heure, mais ce temps peut être plus ou moins longtemps selon le nombre et la longueur des mesures enregistrées, le temps d&#39;exposition utilisé pour chaque trame et l&#39;intervalle inter-stimulus. En outre, excitation à deux photons permet de réduire photoblanchiment de l&#39;fluorescente représentantorter, ainsi que de phototoxicité cellulaire, pour permettre la mesure au cours des périodes plus longues 22,32. Peu importe le choix d&#39;un microscope, le mouvement du cerveau à la mouche au sein de la capsule céphalique est le problème le plus récurrent lorsque l&#39;imagerie chez les animaux intacts. Alors que la correction du mouvement peut corriger les problèmes mineurs (étape 5.1), il est généralement préférable que d&#39;enregistrer à partir de préparations très stables. Stratégies visant à réduire les artefacts de mouvement comprennent: (i) bien contraignant la trompe de la mouche avec la colonne vertébrale de cactus; (ii) à immobiliser les jambes de la mouche en les fixant à la scène avec eicosane (avant l&#39;étape 2.6) (eicosane peut être fondu à ~ 37 ° C, utiliser un fil d&#39;argent pour étendre et affiner la pointe du fer à souder à cet effet); (iii) d&#39;entailler l&#39;œsophage (visible entre les nerfs antennaires) avec des pincettes fines. En plus du G-CaMP1.6 utilisé ici, un certain nombre de versions optimisées de G-Camp et indicateurs de calcium d&#39;autres sont disponibles,qui diffèrent par leur rapport signal-bruit, la fluorescence de base et la dynamique temporelle 12,28,33. Le choix précis de la sonde devrait prendre en compte l&#39;ensemble de ces propriétés, le type de neurones à être analysées et la question biologique abordée. Les capteurs de courant signaler les changements de calcium qui se corrèlent assez bien avec les potentiels d&#39;action 12,34, et leur amélioration, associée à un nombre croissant de lignes spécifiques du pilote génétiques 35 continuera d&#39;améliorer le potentiel de l&#39;imagerie optique de l&#39;activité neuronale chez la mouche intacte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Fournisseur </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Cactus colonne vertébrale </td><td> Garden centre </td><td></td><td> ~ 7mm long et mince, pas trop souple </td></tr><tr><td> Colophane </td><td> Instrument à cordes boutique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deux silicium composante </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Custom made bloc de plexiglas de montage </td><td> Blueprints disponibles à partir <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Des grilles de cuivre </td><td> Grilles Athene </td><td> G220-5 </td><td> Normalement utilisé pour les échantillons en microscopie électronique. </td></tr><tr><td> Vis </td><td> Quincaillerie </td&gt; <td></td><td> 2 mm de diamètre </td></tr><tr><td> Lamelles en plastique </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 X 22 mm </td></tr><tr><td> Pointes de fer à souder </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentation régulée </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Mince fil de fer </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-ohm </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eicosane </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope </td><td> Zeiss </td><td> D1 Axioexaminer </td><td></td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> Visitron </td><td> Coolsnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Logiciel d&#39;acquisition </td></tr><tr><td> Monochromateur </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Lames cassables </td><td> Outils belle science </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Titulaire de la lame </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire lame </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Double tranchant 1mm </td></tr><tr><td> Les pompes à essence à membrane </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Porte-lame en saphir </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Vanne à trois voies </td><td> Société Lee </td><td> LFAA1200118H </td><td> Configuration E </td></tr><tr><td> Rotamètre 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotamètre 5 L / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Cire d&#39;abeille </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulose pad </td><td> Kettenbach médicale </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pince à épiler </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont biologie n ° 5 </td></tr><tr><td> Seringues </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2pieces </td></tr><tr><td> Aiguilles </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1.2mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

Le lobe antennaire est le centre olfactif primaire dans le cerveau des insectes et représente l&#39;équivalent anatomique et fonctionnelle de l&#39;ampoule olfactive des vertébrés 1-5. Olfactive informations dans le monde extérieur est transmise à l&#39;lobe antennaire par olfactifs neurones sensoriels (ARS), qui séparent les régions distinctes de neuropile appelés glomérules selon au récepteur spécifique olfactive ils expriment. Ici, OSN axones font synapse avec les deux interneurones locaux (LNS), dont le processus peut innerver de nombreux glomérules différents, et les neurones de projection (SNP), qui véhiculent l&#39;information olfactive à la hausse des régions du cerveau olfactif. L&#39;imagerie optique de l&#39;activité de ARS, LNS et le PNS dans le lobe antennaire - traditionnellement en utilisant des indicateurs synthétiques de calcium (calcium, par exemple vert, FURA-2) ou la tension des colorants sensibles (par exemple RH414) - a longtemps été une technique importante pour comprendre comment olfactive stimuli sont représentés comme des modèles spatiaux et temporelsde l&#39;activité glomérulaire chez de nombreuses espèces d&#39;insectes 6-10. Développement des organismes génétiquement codés journalistes activité neuronale, comme les indicateurs de calcium fluorescents G-CAMP 11,12 et Cameleon 13, l&#39;indicateur de calcium GFP-aequorine bioluminescente 14,15, ou un journaliste de la transmission synaptique, synapto-pHluorin 16 a fait l&#39; système olfactif de la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, particulièrement accessibles à l&#39;imagerie neurophysiologique, complétant ses globale-décrites propriétés moléculaires, électrophysiologiques et neuroanatomiques 2,4,17. Ces journalistes peuvent être sélectivement exprimé par l&#39;intermédiaire des systèmes binaires de contrôle transcriptionnel (par exemple GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q le système 21) dans des populations définies de neurones au sein du circuit olfactif à disséquer avec une résolution spatiale et temporelle élevée comment odeur évoquée l&#39;activité neuronale est représenté, modulé et transformé 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Nous décrivons ici les méthodes de préparation et d&#39;analyse pour mesurer les odeurs réponses évoquées dans le lobe antennaire chez la drosophile à l&#39;aide du G-CAMP 25-27. La préparation animal est minimalement invasive et peut être adapté à l&#39;imagerie en utilisant à grand champ microscopes, confocale et à deux photons.

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Nous décrivons une technique mis en place pour mesurer et analyser les odeurs évoquées réponses calciques dans le lobe antennaire de la vie<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Imagerie de calcium des odeurs évoquées réponses dans le Drosophila Lobe antennaire

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

25.7K vues.  University of Lausanne. Nous décrivons une technique mis en place pour mesurer et analyser les odeurs évoquées réponses calciques dans le lobe antennaire de la vie Drosophila melanogaster.