Wir erkennen an, Silke Sachse und Beate Eisermann in der Entwicklung dieser Methodik, Pablo Traversa für das Zeichnen der Montageblock Blaupausen und Daniela Pelz für die Verwendung des in Abbildung 1 schematisch. Wir danken Silke Sachse, Pavan Ramdya und Raphael Rytz für Anmerkungen zum Manuskript. R. Bell wird von einem Boehringer Ingelheim Stiftung PhD Fellowship unterstützt. Research in R. Benton-Labor wird von einem European Research Council Starting Independent Researcher Grant und die Swiss National Science Foundation finanziert.

1. Montageblockanordnung <ol><li> Die Plexiglas-Montageblock (Abbildung 1A) sollte auf die genauen Spezifikationen in der Blaupause gegeben werden (erhältlich bei <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> ) Zu ermöglichen eine einfache Montage und Zerlegung der Fliege. Faden durch die Schrauben von der Rückseite, sondern sie erstrecken sich nicht über die vor dem Block, ihre Position wird während der Vorbereitung des Tieres angepasst werden (siehe 2.7). </li><li> Mit einer Präzisions-Bohrmaschine, eine Delle in den oberen Rand der kreisförmigen Kammer für die Fliege, unter der Oberfläche graben, um Platz für Körper der Fliege zu machen, die Verringerung der Dicke des Blocks an dieser Stelle. </li><li> Schneiden einer Kupfer-Gitter mit einem Skalpell senkrecht und in der Nähe der Unterseite des Schlitzes, um eine &quot;Kragen&quot; zu schaffen. Achten Sie darauf, die beiden entstehenden Klappen sind eben, wie dies Einsetzen der Fliege helfen. </li><li> Mit einem Zahnstocher, platzieren Sie einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf den Montageblock oberhalb der runden Kammer für die Fliege. Platzieren Sie die Kupfer Gitter auf den Klebstoff und Position, so dass der Schlitz auf dem Block (1A) zentriert ist. Drücken Sie vorsichtig und entfernen Sie überschüssigen Leim. Mit einer Pinzette, fügen winzigen Tropfen Klebstoff unter den Klappen auf jeder Seite und falten Sie das Raster über die vor dem Block, so dass der Schlitz senkrecht nach unten. Achten Sie darauf, die oben am Tisch auf gleicher Höhe mit dem Block. Vollständig trocknen lassen. </li><li> Montieren Sie einen Drahthalter: schneiden Sie ein Deckglas aus Kunststoff in zwei Hälften und entfernen Sie eine zentrale Stück, ein &quot;U&quot;-Form zu machen. Verwenden Bienenwachs zu kleben ein Stück Draht über den oberen Teil des &quot;U&quot;; nicht machen das Kabel zu straff. </li><li> Konstruieren Sie die antennalen Schild: machen Sie ein Loch in einem Kunststoff-Deckglas mit einem Papier-Locher. Schneiden der Kanten des Deckglases bis 0,5 x 0,7 cm. Kleben Sie die durchbohrten Kunststoff Deckglas zu Klebeband und legen Sie dann einen Tropfen Ethanol auf dem Band durch das Loch an exponiertenentfernen Sie den Klebstoff. </li></ol> 2. Tierische Vorbereitung <ol><li> Fliegen des entsprechenden Genotyps - also tragen die gewünschte Kombination von &quot;driver&quot;-Reporter und Aktivität Transgene - sollte 1-3 Wochen alt, die Kutikula der jüngeren Fliegen ist zu weich und schwierig zu schneiden. Bei Experimenten direkten Vergleich verschiedener Genotypen erfordern, und um die Expression der Transgene übereinstimmen, sollte Fliegen sein Alter abgestimmt auf altersbedingte physiologische Unterschiede zu vermeiden. Wenn Geschlecht nicht wichtig ist, bevorzugen wir es, weibliche Fliegen verwenden, da sie einen größeren Kopf haben und sind leichter zu manipulieren. </li><li> Anesthetize Fliegen durch Abkühlen auf Eis. </li><li> Führen Sie eine Fliege in den Montageblock. Halten der Fliege durch die Flügel zu schieben und, Rücken-Oberfläche zunächst über den Schlitz des Kupfergitter so daß sie durch den Hals (1B-C) suspendiert. Wenn nötig, drehen ihn, bis er nach unten schaut. </li><li> Legen Sie eine feine Kaktusstachel vor dem fly den Kopf, um es an der Flucht (Abbildung 1B-C) zu verhindern. Setzen Sie den Kaktus Wirbelsäule vor den Rüssel, um es zu Bewegung zu verhindern. Befestigen Sie den Kaktus Wirbelsäule auf den Block mit Bienenwachs. Stellen Sie sicher, dass die Oberseite des Kopfes mit der Oberseite des Blocks ist. </li><li> Befestigen Sie den Kopf der Fliege auf den Block mit einem kleinen Tropfen von Kolophonium (gelöst in Ethanol). Den Block in einem befeuchteten Box und lassen Sie das Kolophonium zu verhärten für etwa eine Stunde. </li><li> Mit einer Pinzette, ziehen Sie die Platte nach vorn antennalen-and-Drop den Draht an der Halterung (Wachs-Side-out, siehe 1.5) in der Kutikula Falte zwischen der Antenne und Kopf. Befestigen Sie die Halterung an der Vorderseite des Blocks mit Bienenwachs. </li><li> Verwenden Sie die Schrauben in den Block gebaut, vorsichtig in das Drahthalter uns auf etwas Platz zwischen dem antennalen Platte und der Kopf zu schaffen. </li><li> Setzen Sie den antennalen Schild (siehe 1.6) über den oberen Teil der Fliege Kopf mit dem Loch positioniert zentral. Fix mit Bienenwachs an der Spitze der Montageblock. </li><li> Mit einem Messer-Splitter, cuta kleines Loch in der Band auf dem Schild Aussetzen der Kutikula der Fliege den Kopf hinter der Antenne. Das Loch sollte nicht über den Augen erstrecken, um die Herstellung auslaufen. </li><li> Dichten Sie das Loch zwischen dem Band und die Nagelhaut mit Zwei-Komponenten-Silikon. Entfernen Sie überschüssiges Silikon von der Spitze der Fliege den Kopf. </li><li> Geben Sie einen Tropfen von Drosophila Ringer-Kochsalzlösung (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 36 mM Saccharose, 5 mM HEPES, pH 7,3) auf den Kopf. Stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind: die Antennen bleiben sollte vollständig trocken ist. Mit einem Saphir Messer, schnitt ein Loch in die Nagelhaut. Zuerst leicht Punktzahl entlang der Kutikula fach direkt hinter der Antenne, dann entlang den Augen und über den Ocellen geschnitten auf der Rückseite. Schließlich falten Sie das Blatt über die Kutikula erzielte Kante geschnitten und von der Unterseite zu vermeiden Durchtrennen der antennalen Nerven. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Drüsen und der Luftröhre mit feinen Pinzette. Spülen Sie immer wieder mit Drosophila </em&gt; Ringer, so dass ein großer Tropfen auf den Kopf. </li></ol> 3. Geruch Stimulus Lieferung <ol><li> Geruch Spritzen: legen Sie eine Cellulose-Pad in ein 2 ml Kunststoff-Spritze mit sauberem Pinzette und Pipette auf sie (mit Filter tips) 20 ul Geruch, verdünnt wie in einem geeigneten Lösungsmittel gewünscht, mit der Pipettenspitze, um das Kissen tief in den Lauf schieben . Plug-and-Kappe der Spritze, bis sie benötigt. Frischer Geruch Verdünnungen sollten mindestens alle 3 Monate (oder häufiger bei sehr flüchtigen und / oder häufig verwendete Gerüche) werden, und neue Pads sollten für Geruch Spritzen direkt vor jeder Aufnahme-Session vorbereitet werden. Verwenden Sie keine Geruchs-Pads für mehr als drei Stimulationen, da der Geruch Konzentration könnte zerfallen. </li><li> Maßgeschneiderte Olfaktometer (2): einen primären Luftstrom (1 l / min) durch Teflon-Schlauch (0,4 mm Innendurchmesser) gerichtet ist; 27 cm oberhalb vom Austritt des Rohres eine sekundäre Luftstrom (1 l / min ) zugegeben. Beide Luftströme werden durch Membranpumpen erzeugt wird, unddie Fließgeschwindigkeit wird durch zwei unabhängige Durchflussmesser geregelt. Die Luftströme können befeuchtet werden, indem es durch Wasser in Gaswaschflaschen, wobei darauf zu achten, um über-Befeuchtung zu vermeiden (dh mehr als ~ 60%) werden. Die sekundäre Luftstrom wird entweder durch eine Spritze oder Geruch einer leeren Spritze gerichtet: Spritzen werden, um den Luftstrom durch eine Spritzennadel (1,2 mm Außendurchmesser) Durchstechen des Kolbens verbunden ist. Ein Drei-Wege-Magnetventil über ein Ventil Steuereinheit (zB Harvard Apparatus VC6) gesteuert wird verwendet, um zwischen der sauberen Luft und Geruch Impulse zu wechseln. </li></ol> 4. In-vivo-Imaging <ol><li> Wir beschreiben hier eine aufrechte Bildgebung mit Fluoreszenz-Mikroskop (zB aufrecht feste Bühne Zeiss Axio Examiner D1) mit einem 20x Wasser Zielsetzung (z. B. Zeiss W &quot;Plan-Apochromat&quot; 20x / 1,0 M27 DIC) (Abbildung 2) ausgestattet. Für die Bildgebung mit G-Camp (Anregung / Emission: 488/509 nm), einen Filter verwenden, Block mit den folgenden Eigenschaften: 450-490 nm Anregungsfilter, Dichroitischen Spiegel (T495LP) und 500-550 nm Emission Filter (Chroma ET). Setzen Sie den Montageblock mit der Fliege unter dem Mikroskop. Positionieren Sie den Ausgang der Olfaktometer ca. 0,5 cm vor der Fliege Antennen. </li><li> Senken Sie das Ziel, bis es der Ringer-Lösung auf der Fliege Kopf berührt. Beim Blick durch den Betrachter unter Hellfeldbeleuchtung, Position der Vorbereitung, so dass das Loch in der Kopfkapsel zentriert ist und seine Grenzen sind im Fokus. Wechseln Sie in fluoreszierendes Licht und stellen Sie den Fokus, bis Sie die markierten Neuronen (ergibt sich aus Basal-grüne Fluoreszenz der G-cAMP) sehen kann. </li><li> Fein Fokus auf die Glomeruli von Interesse durch den Erwerb von Bildern mit einer Charge-coupled Device (CCD) Kamera (zB CoolSNAP HQ2-Digitalkamera-System) auf dem Mikroskop mit Hilfe geeigneter Software zur Erfassung (zB Metafluor) (Abbildung 3A) montiert. Schließen der Blende im Beleuchtungsstrahlengang um Anregungslicht zu dem abgebildeten Bereich zu begrenzen. </li><li> Für die Aufzeichnung Gerüche hervorgerufeneAktivität, stellen Sie den Erwerb Rate bis 4 Hz und stellen Sie die Belichtungszeit auf Fluoreszenz-Werte innerhalb des dynamischen Bereichs des CCD-Kamera zu erhalten, aber nicht niedriger als 1000 (willkürliche Einheiten), mit mindestens 12-Bit-Auflösung dynamisch. Die Belichtungszeit sollte nicht länger als 100 ms, wenn möglich, zu G-CaMP Ausbleichen zu reduzieren. Wenn die räumliche Auflösung der Kamera erlaubt, können Sie erhöhen die Binning (Anzahl der Brunnen auf dem Chip, die in eine digitale Pixel-Binning werden), um die Belichtungszeit zu reduzieren. Man erhält Bilder der 350x225 Pixel (mit Binning 2x2), entsprechend 210x135 um bei der Herstellung. Diese Einstellungen sind optimal zur glomerulären Geruchs-induzierten Reaktionen des G-Camp mit guter räumlicher und zeitlicher Auflösung zu erfassen und beschränkt Reporter Bleichen. </li><li> Stellen Sie die Messparameter. Wir in der Regel für 10 Sekunden (also 40 Frames) aufzeichnen, mit Duftstimulation sich zumeist in 4 Sekunden nach dem Beginn der Erfassungszeitraum (Bild 15) und einer Laufzeit von einem zweiten (until Frame 19). Eine Fliege Vorbereitung kann in der Regel mit getestet werden bis zu 25-30 verschiedenen Geruch Reize, die oft von einer irreversiblen Abnahme der Fluoreszenz-Signal des Reporters durch Ausbleichen begrenzt. Die Inter-Stimulus-Intervall wird von der Stärke der Reaktion beobachtet, und die von Photobleichen abhängen. Die entsprechende Länge der Inter-Stimulus-Intervall auf sensorische Anpassung vermeiden können, etwa durch wiederholte Vorlage einer positiven Kontrolle Geruch (falls bekannt) im Versuch ermittelt werden. Die Aufnahme dieses Geruchs alle ~ 10 Stimuli in einer bestimmten Serie können zulassen Überprüfung der Lebensfähigkeit und konsistente Reaktionsfähigkeit der Zubereitung. </li></ol> 5. Datenverarbeitung und-analyse Daten werden mit ImageJ (mit Mac Biophotonik-Plug-in, <a href="http://www.macbiophotonics.ca/">www.macbiophotonics.ca</a> ) und benutzerdefinierte Programme geschrieben in Matlab und R wie folgt: <ol><li> Korrigieren Sie für Probe Bewegungsartefakte:richten Sie alle Bilder, entsprechend einem Tier Zubereitung (zB 30 Messungen von 40 Bildern je) mit dem &quot;starren Körper&quot;-Modus der StackReg / TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg">bigwww.epfl.ch / Thevenaz / stackreg</a> ) in ImageJ. Dieser Schritt ist erforderlich, um Veränderungen der Position der markierten Neuronen in Bezug auf die Erfassungsfrequenz in und zwischen den Messungen zu entfernen. Es ist jedoch nur möglich, Verschiebungen in der xy-Ebene zu entfernen. Die Daten sollten verworfen werden, wenn starke Veränderungen in der Konzentration auftreten werden. </li><li> Segment den Stapel in einzelne 10-Sekunden (40 Rahmen) Messungen. </li><li> Richtig zum Bleichen von Artefakten: Belastung durch fluoreszierendes Licht führt dazu, Fluoreszenz, die während einer einzigen Messung 10 zerfallen. In einigen Fällen ist es wichtig, um für diese zerfallen, bevor die Analyse der Daten zu korrigieren. Für jede Messung Berechnung eines Hintergrundbildes. Dies sollte der Mittelwert aus mehreren Frames vor Beginn des Stimulus (zB Rahmen 6-14) sein. Unterteilen Sie jedes Bild von diesem backgrunder Rahmen um die relative Fluoreszenz Änderungen zu erhalten. Den Mittelwert der relativen Fluoreszenz für jeden Frame durch Mittelung aller Pixel innerhalb des von G-CaMP markiert. Setzen Sie einen Doppelklick auf die exponentielle mittlere Fluoreszenz-Kurve, ein stärkeres Gewicht geben den Rahmen vor dem Stimulus und null Gewicht auf die Zeit des Geruchs Antwort (20 Frames nach Reizbeginn in unserem Fall). Subtrahieren Sie die angepasste Kurve von der relativen Fluoreszenz-Kurve eines jeden Pixels. Multiplizieren Sie die korrigierten Bilder von der Hintergrund-Frame neu zu erhalten Rohdaten. Diese Art der Korrektur kann zu einer Veränderung in der Dynamik Reaktion führen, wenn das Signal nicht auf die Grundlinie zurückzusetzen, indem das Ende der Messung (z. B. wenn inhibitorischen oder exzitatorischen sehr starke Reaktionen hervorgerufen werden) (Abbildung 4). Während Korrektur zum Bleichen Artefakte ist in vielen Fällen sollte Auslegung der zeitliche Parameter mit Vorsicht durchgeführt werden, wenn ein Bleichmittel Korrektur angewendet. </li><li> Berechnen der relativen Änderung in der Fluoreszenz (&amp; Delta, F / F) für jedes Bild jeder Messung (F i-F 0) / F 0 * 100, wobei F 0 die Hintergrund-Frame (siehe 5.3), und F i die Fluoreszenz-Wert für den i-ten Vollbild die Messung. </li><li> Berechnen Sie die mittlere &amp;Dgr; F / F in einem kreisförmigen Bereich von Interesse in einer Glomerulus (3B) mit einem Durchmesser von 10 Pixel, um die Aktivität Spuren (5A) zu erhalten. Wenn gewünscht, diese Spuren zu wandeln Heatmaps mit ImageJ (5A). </li><li> Berechnen Sie die Spitzenamplitude der Antwort durch Subtrahieren der mittleren &amp;Dgr; F / F von vier Rahmen vor der Stimulation von der mittleren &amp;Dgr; F / F von vier Rahmen in der Spitze der Antwort. Das gleiche Verfahren wird auch verwendet, um räumliche Antwortmuster (siehe Abbildung 3B) zu illustrieren und die Antwort Amplitude in bestimmten Regionen von Interesse über Fliegen zu quantifizieren (siehe Abbildung 5B). Die maximale Empfindlichkeit kann auch durch Integrieren der Fläche unter der Kurve während der Zeit des Reizes oder quantifiziert werden averaging die Rahmen um das Maximum der Reaktion. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wir verwendeten die Protokolle über die Erfassung und Auswertung Propionsäure hervorgerufenen Reaktionen von Fliegen, welche G-28 unter CaMP1.6 der Kontrolle des Promotors für die olfaktorische Korezeptor IR8a, die aktiv ist in verschiedenen Populationen von OSN 29,30 ( Abb. 3-5). Stimulation mit 1% Propionsäure entlockt Anstieg der G-CaMP Fluoreszenz - was auf einen Anstieg der intrazellulären Calcium - in OSNs innervieren zwei Glomeruli, DC4 und DP1l (3B). Wir stellen verschiedene Arten der Darstellung von Daten aus mehreren Fliegen in Abbildung 5: Linie Aktivität Spuren, Heatmaps und eine Bar Grundstück von Peak Antworten. Propionsäure hervorgerufenen Reaktionen haben deutliche Spitzenamplituden und zeitliche Dynamik in DC4 und DP1l. Darüber hinaus, obwohl die Immunantworten generell sind robust, kann Variabilität zwischen den einzelnen Tieren auch in den beiden Glomeruli beobachtet werden (siehe eratmaps in 5A). Die Quantifizierung der Peak-Response (Abbildung 5B) ermöglicht eine einfache statistische Vergleich zwischen verschiedenen Glomeruli und verschiedener Riechstoffe über Tiere. Allerdings können Gerüche hervorgerufene Kalzium Antworten haben uneinheitliche zeitliche Dynamik und die Quantifizierung ihrer Größenordnung mit einem einzigen Wert wird diese Komplexität zu ignorieren. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig1.jpg" /> 1. Schaltplan der Montageblock (A) vor und (B) nach dem Einbringen der Fliege, und (C) einer Draufsicht in Nahaufnahme (aus 31). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Versuchsanordnung. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig3.jpg" /> Abbildung 3. (A) Draufsicht der Fliege Vorbereitung nach der Stufe 2,8 (linkes Bild) und rohes Bild der Fluoreszenz-ante-NNAL Lappen mit G-CaMP1.6 (;: G-CaMP1.6:: IR8a Promoter GAL4 UAS Genotyp) beschriftet. DC4 und DP1l Glomeruli können durch ihre Morphologie, Größe und Position unterschieden werden und sind in rot und blau markiert, beziehungsweise. (B) Farbe-codiertes Bild aus der Antwort auf Propionsäure (1% v / v). Das Bild entspricht der &amp;Dgr; F / F des Peaks der Antwort berechnet, wie in Schritt 5.6 erläutert (siehe auch 5A). Die ColorScale auf der linken Seite zeigt den% &amp;Dgr; F / F-Wert. Die schwarzen Kreise zeigen die Position und Größe der Region von Interesse verwendet werden, um die Antworten zu quantifizieren (siehe Abbildung 5). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig4.jpg" /> Abbildung 4. Korrektur Ausbleichen der fluoreszierenden Reporter-Signal. Beispiele für die Wirkung des Bleichmittels Korrektur wie in Schritt 5.3 beschrieben. Musterdaten auf der linken Seite kann ohne größere Änderungen in der Form der Antwort korrigiert werden. Sample-Daten auf der rechten Seite ist stark beeinflussenHrsg. v. Bleich-Korrektur, wahrscheinlich, weil das Signal abfällt und wird unter den Ausgangswert nach Beendigung Geruch Stimulus aufrechterhalten. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/2976/2976fig5.jpg" /> Abbildung 5 (A) Oben:. Zeitliche Dynamik von Kalzium Antworten der Glomeruli DC4 (links) und DP1l (rechts) zu Propionsäure (1% v / v). Die schwarzen Kurven zeigen den Median der Mittelwert &amp;Dgr; F / F in der Region von Interesse (siehe Abbildung 3B) über acht Tieren. Die graue Fläche zeigt den Bereich zwischen dem ersten und dritten Quartil der Verteilung. Präsentation der Median und Quartil-Werte enthält weitere Informationen über die Variabilität und Verteilung der beobachteten Reaktionen als Mittelwert und Standardabweichung. Die Grün und Magenta Kästen zeigen die Rahmen gemittelt, um die Peak-Response in 3B gezeigt, und quantifiziert in 5B zu berechnen. Unten: die Heatmaps für die Antwortdaten für die einzelnen Tiere in getrennten Reihen mit &amp;Dgr; F / F-Werte represented durch die ColorScale (ganz rechts). Die horizontalen schwarzen Balken zeigen die Uhrzeit und die Dauer des Reizes. (B) Median Gipfel Antworten auf Propionsäure in acht Tieren, die für DC4 und DP1l Glomeruli. Die Fehlerbalken geben den Bereich zwischen dem ersten und dritten Quartil der Verteilung.

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Biol. 12, 1877-1884 (2002).</li><li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly.">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36, 463-474 (2002).</li><li>Sachse, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+plasticity+in+an+olfactory+circuit.">Activity-dependent plasticity in an olfactory circuit.</a> Neuron. 56, 838-850 (2007).</li><li>Pelz, D., Roeske, T., Syed, Z., de Bruyne, M., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+receptive+range+of+an+olfactory+receptor+in+vivo+&#40;Drosophila+melanogaster+Or22a&#41;.">The molecular receptive range of an olfactory receptor in vivo &#40;Drosophila melanogaster Or22a&#41;.</a> J. Neurobiol. 66, 1544-1563 (2006).</li><li>Silbering, A. F., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+odor+mixtures+in+the+Drosophila+antennal+lobe+reveals+both+global+inhibition+and+glomerulus-specific+interactions.">Processing of odor mixtures in the Drosophila antennal lobe reveals both global inhibition and glomerulus-specific interactions.</a> J. Neurosci. 27, 11966-11977 (2007).</li><li>Reiff, D. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variant+ionotropic+glutamate+receptors+as+chemosensory+receptors+in+Drosophila.">Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila.</a> Cell. 136, 149-162 (2009).</li><li>Pelz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Functional characterization of Drosophila melanogaster Olfactory Receptor Neurons. , (2005).</li><li>Ai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid+sensing+by+the+Drosophila+olfactory+system.">Acid sensing by the Drosophila olfactory system.</a> Nature. 468, 691-695 (2010).</li><li>Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Brain+Imaging:+Fluorescence+or+Bioluminescence,+Which+to+Choose?.">In Vivo Brain Imaging: Fluorescence or Bioluminescence, Which to Choose?.</a> Journal of Neurogenetics. , 1-23 (2008).</li><li>Jayaraman, V., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+a+genetically+encoded+optical+sensor+of+neural+activity+using+electrophysiology+in+intact+adult+fruit+flies.">Evaluating a genetically encoded optical sensor of neural activity using electrophysiology in intact adult fruit flies.</a> Front. Neural Circuits. 1, 3-3 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9715-9720 (2008).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Aufbereitung und die Analyse hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um Geruchs-evozierte Potentiale in jeder Population von Neuronen im Antennallobus (OSN, LN und PNS), für die ein entsprechender Treiber verfügbar ist Transgen zu analysieren. Während wir seine Anwendung mit einem Fluoreszenzmikroskop beschreiben, können optische Bildgebung dieser Zubereitung ebenso durchgeführt mittels konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie 22,32 werden. In der Tat, lindern diese letztgenannten Instrumente der Licht streuenden Problem der Weitfeld-Mikroskopie, die die Auflösung von Bildern reduzieren können, insbesondere wenn eine große Zahl von Neuronen Express der Reporter. Diese Zubereitung Regel erlaubt Aufnahmen Geruch hervorgerufenen Reaktionen für mindestens eine halbe Stunde, aber dieses Mal kann erheblich länger oder kürzer in Abhängigkeit von der Anzahl und Länge der aufgezeichneten Messungen, die Belichtungszeit für jeden Rahmen und der Inter-Stimulus-Intervall verwendet. Darüber hinaus können zwei-Photonen-Anregung reduzieren Ausbleichen der Fluoreszenz-reporter, sowie zelluläre Phototoxizität, um die Messung über einen längeren Zeitraum 22,32 ermöglichen. Unabhängig von der Wahl des Mikroskops ist die Bewegung der Fliege Gehirns im Kopf Kapsel die meisten immer wieder auftretendes Problem bei der Bildgebung bei gesunden Tieren. Während Bewegungskorrektur kleinere Probleme (Schritt 5.1) korrigieren kann, ist es meist besser nur aus sehr stabilen Vorbereitungen aufzunehmen. Strategien, um Bewegungsartefakte zu reduzieren sind: (i) richtig Einschränken der Rüssel der Fliege mit dem Kaktus Wirbelsäule, (ii) Immobilisierung der Fliege Beine durch Befestigung an der Bühne mit Eicosan (vor 2,6 Schritt) (Eicosan kann geschmolzen werden ~ 37 ° C; verwenden Sie einen Silberdraht zu erweitern und zu verfeinern, die Spitze des Lötkolbens für diesen Zweck), (iii) Nicking die Speiseröhre (sichtbar zwischen den Fühlern Nerven) mit feinen Pinzette. Neben den G-CaMP1.6 hier verwendet, gibt eine Reihe von optimierten Versionen von G-CaMP Calcium und andere Indikatoren,Sie unterscheiden sich in ihrer Signal-zu-Rausch-Verhältnis, Fluoreszenzbasismesswert und zeitliche Dynamik 12,28,33. Die genaue Wahl des Sensors sollte berücksichtigt werden, alle diese Eigenschaften, die Art der Neuronen zu analysieren und die biologische Frage angesprochen. Aktuelle Sensoren melden Kalzium Veränderungen, die ziemlich gut korrelieren mit Aktionspotentiale 12,34, und ihre weitere Verbesserung, mit steigender Anzahl von spezifischen genetischen Fahrer Linien 35 gekoppelt wird auch weiterhin das Potenzial der optischen Bildgebung neuronaler Aktivität im intakten Fliege zu verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lieferant </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Cactus Wirbelsäule </td><td> Garten-Center </td><td></td><td> ~ 7mm langen, dünnen, nicht zu flexibel </td></tr><tr><td> Kolophonium </td><td> Saiteninstrument Shop </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zweikomponenten-Silikon </td><td> WPI </td><td> KWIK-SIL </td><td></td></tr><tr><td> Custom made Plexiglas Montageblock </td><td> Blueprints zur Verfügung <a href="http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/" target="_blank">http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint /</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kupfergitter </td><td> Athene Grids </td><td> G220-5 </td><td> Normalerweise für die Elektronenmikroskopie Proben verwendet. </td></tr><tr><td> Schrauben </td><td> Eisenwarengeschäft </td&gt; <td></td><td> 2 mm Durchmesser </td></tr><tr><td> Kunststoff-Deckgläschen </td><td> Plano-em </td><td> L4193 </td><td> 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> Lötspitzen </td><td> Conrad Electronics </td><td> 830283-62 </td><td></td></tr><tr><td> Geregelte Stromversorgung </td><td> Conrad Electronics </td><td> 511407-62 </td><td></td></tr><tr><td> Dünner Draht </td><td> Isabellenhütte </td><td> Isa-Ohm- </td><td> 0,013 mm </td></tr><tr><td> Eicosan </td><td> Sigma </td><td> 21,927-4 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioexaminer D1 </td><td></td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Visitron </td><td> CoolSnap HQ </td><td></td></tr><tr><td> Metafluor </td><td> Visitron </td><td></td><td> Acquisition Software </td></tr><tr><td> Monochromator </td><td> Visitron </td><td> Visichrome </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Breakable Klingen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10050-00 </td><td></td></tr><tr><td> Halter für Klinge </td><td> WPI </td><td> 14134 </td><td></td></tr><tr><td> Sapphire Klinge </td><td> WPI </td><td> 500314 </td><td> Zweischneidige Klinge 1mm </td></tr><tr><td> Membran-Zapfsäulen </td><td> KNF Neuberger AG </td><td> NMP 830 KVE </td><td></td></tr><tr><td> Saphir Klingenhalter </td><td> WPI </td><td> 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Drei-Wege-Ventil </td><td> Lee Company </td><td> LFAA1200118H </td><td> E-Konfiguration </td></tr><tr><td> Rotameter 500 ml / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 112-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Rotameter 5 l / min </td><td> Analyt-MTC </td><td> 102-08SA </td><td></td></tr><tr><td> Bienenwachs </td><td> Siladent Technik </td><td> 209212 </td><td>; </td></tr><tr><td> Cellulose-Pad </td><td> Kettenbach Medical </td><td> 31003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzette </td><td> Plano-em </td><td> T5130 </td><td> Dumont Biologie # 5 </td></tr><tr><td> Spritzen </td><td> BD </td><td> 300928 </td><td> 2ml, Discardit II, 2Stück </td></tr><tr><td> Needles </td><td> Braun Sterican </td><td> 4665120 </td><td> 1,2 mm OD </td></tr></tbody></table>

calcium imaging of odor-evoked responses in the drosophila antennal lobe

Die Antennallobus ist das primäre olfaktorische Zentrum im Gehirn der Insekten und stellt die anatomischen und funktionellen Äquivalent der Wirbeltiere Riechkolben 1-5. Olfaktorische Informationen in der äußeren Welt ist mit dem Antennallobus von Riechzellen (OSN), die unterschiedliche Regionen des Neuropil genannt Glomeruli je nach der spezifischen olfaktorischen Rezeptor sie ausdrücken zu trennen übertragen. Hier können OSN Axone Synapsen mit lokalen Interneuronen (LNS), deren Prozesse innervieren viele verschiedene Glomeruli, und Projektion Neuronen (PNS), die olfaktorische Information an höhere olfaktorische Hirnregionen zu vermitteln. Die optische Bildgebung der Aktivität von OSN, LNS und PNS im Antennallobus - traditionell unter Verwendung von synthetischen Kalzium-Indikatoren (z. B. Calcium grün, Fura-2) oder spannungsabhängigen Farbstoffen (zB RH414) - ist seit langem eine wichtige Technik zu verstehen, wie olfaktorische Reize werden als räumliche und zeitliche Muster vertretender Glomeruliaktivität in vielen Insektenarten 10.06. Entwicklung genetisch kodierten neurale Aktivität Reporter, wie die fluoreszierende Calciumindikatoren G-CaMP 11,12 Cameleon 13, die Calcium-Indikator biolumineszierende Aequorin-GFP 14,15 oder ein Reporter der synaptischen Übertragung, hat im Gegensatz zu GFP Synaptosomen 16 die aus olfaktorische System der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, besonders zugänglich für neurophysiologische Imaging, ergänzt durch einen umfassend beschriebenen molekularen, elektrophysiologischen und neuroanatomischen Eigenschaften 2,4,17. Diese Reporter kann wahlweise über binäre Transkriptionskontrolle Systeme (z. B. GAL4/UAS 18, LexA / LexAop 19,20, Q-System 21) in definierten Populationen von Neuronen im olfaktorischen Schaltungen, um mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung, wie Gerüche hervorgerufene sezieren ausgedrückt werden neurale Aktivität dargestellt wird, moduliert und verändert 22-24 &lt;/ Sup&gt;. Hier beschreiben wir die Herstellung und Analyse-Methoden, um Geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus mit G-CaMP 25-27 zu messen. Das Tier Vorbereitung ist minimal-invasiv und kann auf Bildgebung mit Weitfeld-Fluoreszenz, konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie eingesetzt werden.

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Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Wir beschreiben eine etablierte Technik zur Messung und Analyse Gerüche hervorgerufene Kalzium-Reaktionen im Antennallobus Lebensstandard<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

25.8K Aufrufe.  University of Lausanne. Wir beschreiben eine etablierte Technik zur Messung und Analyse Gerüche hervorgerufene Kalzium-Reaktionen im Antennallobus Lebensstandard Drosophila melanogaster.

Serie: Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Imaging Gerüche hervorgerufene Aktivitäten in der Maus Riechhirn mit Optical Reflexions-und Autofluoreszenzsignale

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Imaging neuronalen Antworten in Scheiben Zubereitungen von Vomeronasalorgan Ausdruck eines genetisch kodierte Kalzium-Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Identifikation der olfaktorischen Flüchtige mittels Gaschromatographie-Multi-unit Recordings (GCMR) im Insect Antennallobus

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

Kultur der Hirnkapillarpericyten für zytosolische Kalziummessungen und Calcium-Imaging-Studien

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using calcium as a proxy for neuronal activity, these techniques provide a way to monitor the responses of individual cells within large neuronal ensembles to a variety of stimuli in real time. We, and others, have applied these techniques to image the responses of individual geniculate ganglion neurons to taste stimuli applied to the tongues of live anesthetized mice. The geniculate ganglion is comprised of the cell bodies of gustatory neurons innervating the anterior tongue and palate as well as some somatosensory neurons innervating the pinna of the ear. Imaging the taste-evoked responses of individual geniculate ganglion neurons with GCaMP has provided important information about the tuning profiles of these neurons in wild-type mice as well as a way to detect peripheral taste miswiring phenotypes in genetically manipulated mice. Here we demonstrate the surgical procedure to expose the geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, initial steps for data analysis, and troubleshooting. This technique can be used with transgenically encoded GCaMP, or with AAV-mediated GCaMP expression, and can be modified to image particular genetic subsets of interest (i.e., Cre-mediated GCaMP expression). Overall, in vivo calcium imaging of geniculate ganglion neurons is a powerful technique for monitoring the activity of peripheral gustatory neurons and provides complementary information to more traditional whole-nerve chorda tympani recordings or taste behavior assays.

Here we present how to expose the geniculate ganglion of a live, anesthetized laboratory mouse and how to use calcium imaging to measure the responses of ensembles of these neurons to taste stimuli, allowing for multiple trials with different stimulants. This allows for in depth comparisons of which neurons respond to which tastants.

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Calcium-Handlings in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...