Los autores desean agradecer al Dr. James (Zhijian) Chen (UT Southwestern, Biología Molecular) para proporcionar reactivos esenciales, incluidos los Mavs - / - ratones, y el Dr. Ren Sol (Universidad de California-Los Angeles, Farmacología y Medicina Molecular ) para proporcionar el cromosoma bacteriano artificial de γHV68 para este estudio.

1. Ratón infección con γHV68 <ol><li> De seis a ocho semanas de edad, género de concordancia de ratones hermanos de camada (8 a 12 ratones / grupo) se utilizan para la infección viral. Permitir ratones para aclimatarse durante cuatro días completos (96 horas) después del envío. </li><li> Protocolo de pasos utilizando virus debe llevarse a cabo en un gabinete de bioseguridad de nivel 2 (BSL2) usando BSL2 precauciones. </li><li> Preparar una suspensión viral (40 a 1 x 10 5 unidades formadoras de placa [UFP]) de γHV68 en 30 l de PBS estéril por ratón justo antes del experimento. Mantenga suspensión viral en hielo. </li><li> Preparar la solución de ketamina / xilazina (1,5 mg de ketamina y 0,15 mg xylazine/20 g de peso corporal, 100 l / ratón) para la sedación ratón. Asegúrese de que los ratones han sido sedados mediante la realización de un sujetador del pie. </li><li> Sedate ratones con ketamina 1,5 mg y 0,15 mg por xilazina 20 mg de peso corporal (100 l / ratón) por inyección intra-peritoneal. </li><li> Entregar suspensión viral (30 l / ratón) por vía intranasal, en un gota a gotamoda, a una ventana de la nariz de los ratones sedados. </li><li> Lay ratones en un lado durante 5 - 10 min para facilitar la entrega de las vías respiratorias del virus en el pulmón. </li><li> Ratones vuelva a colocarlo en ratones jaula y el monitor hasta que se hayan recuperado totalmente de la sedación. </li><li> En varios días después de la infección, sacrificar los ratones por asfixia de CO 2 y la cosecha de los pulmones después de asegurar la muerte / pérdida del conocimiento profundo. Coloque los pulmones en estériles de 1,5 ml con tapón de rosca tubos que contienen 500 l de 1,0 mm de zirconia / sílice cuentas. Mantenga los tubos en hielo. Almacene las muestras a -80 ° C si no se continuar con el paso siguiente en el mismo día. El bazo o tejido del hígado podría ser recogidos en este momento para el análisis de la latencia viral en función de marco de tiempo del experimento. </li><li> Añadir 1 ml de frío DMEM libre de suero en el tubo y homogeneizar los pulmones por bead-latidos 30 segundos. Enfriar los tubos en hielo durante al menos 1 min. Repita este proceso una vez. </li><li> Pulmón centrífuga lisados ​​a 16.000 RCF a 4 ° C durante 1 min y utilizar supernatant para determinar el título viral mediante un ensayo en placa utilizando una monocapa NIH3T3 o BHK21 (véase la Sección 5 para más detalles). </li></ol> 2. Determinar γHV68 varios pasos cinética de crecimiento de fibroblastos de embriones de ratón <ol><li> Grow tipo salvaje fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) y deficientes en un gen del huésped a sub-confluente (aproximadamente 80%) antes de la densidad de células en placas. </li><li> Dividir en MEFs 24-así placa a 10.000 células / pocillo para un bajo multipilicity-de-infección (MOI) en el día antes de la infección. Los experimentos se llevan a cabo normalmente por triplicado y en un MOI entre 0,001 a 0,05 se utiliza generalmente. </li><li> Preparar γHV68 suspensión que contiene la cantidad deseada de virus (0,5 ml por pocillo). </li><li> Eliminar el medio y cubrir MEFs con 0,5 ml de γHV68 suspensión por pocillo. </li><li> Se incuba la placa en la incubadora de cultivo de tejidos, roca cada 30 min, y permitir incubación proceder durante 2 h. </li><li> Retire suspensión viral, y cubra las células con 0,5 ml fresco complete medio DMEM que contenía 8% de suero bovino fetal. </li><li> En días diferentes después de la infección, se recoge el medio y las células en tubos de 1,5 ml estériles de centrífuga. Inmediatamente congelar tubos a -80 ° C. </li><li> Release γHV68 de MEFs por congelación a -80 ° C, la descongelación en 37 ° C baño de agua y agitar. Tres ciclos de congelación y descongelación se aplica generalmente a las muestras. </li><li> Determinar el título viral en un ensayo en placa utilizando una monocapa NIH3T3 o BHK21 (véase la Sección 5 para más detalles). </li><li> Lea título viral y la trama γHV68 varios pasos curva de crecimiento en MEFs. </li></ol> 3. Disección molecular de la replicación lítica γHV68 en fibroblastos de embriones de ratón <ol><li> Realice una infección viral como se describe en los pasos 2.1 a 2.6 de la sección 2. </li><li> En días diferentes después de la infección, descartar el sobrenadante. Enjuagar las células con PBS frío y células Tripsinizar. Pellet las células por centrifugación a 1.000 RCF a temperatura ambiente durante 1 min. Eliminar el sobrenadante yLas células se almacena a -80 ° C. </li><li> Extraer el ADN total (anfitrión y el genoma viral) y el ARN total de acuerdo con métodos previamente publicados 5,6. </li><li> Realizar PCR en tiempo real utilizando ADN total y cebadores específicos para transcripciones virales líticos, tales como RTA (ORF50), ORF57 y ORF60. Determinar la cantidad relativa de intracelular γHV68 genoma en referencia a un gen de mantenimiento de acogida (por ejemplo, β-actina). </li><li> Para eliminar la contaminación de ADN genómico, el tratamiento con RNasa libre de DNasa es crítica para la preparación de ADNc con ARN total y oligo (dT) 11-19. Ver referencia 5 para más detalles sobre la extracción de ARN, incluyendo el tratamiento con RNasa libre de DNasa y RT-PCR. Realizar PCR en tiempo real utilizando cebadores y ADNc como anteriormente para determinar la cantidad relativa de transcritos virales en referencia a la del gen del huésped de limpieza. </li></ol> 4. Generación de recombinantes utilizando γHV68 cromosoma artificial bacteriano La metod describe aquí se usa para introducir mutaciones en un gen γHV68 que está implicado en la interacción huésped-virus. <ol><li> Preparar un fragmento de ADN (aproximadamente 1,5 kb) de secuencia de tipo salvaje o la secuencia que llevan mutaciones deseadas en la región central por PCR. </li><li> Preparar cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contiene un transposón inserción 7 alrededor del sitio de la mutación, que específicamente se inactiva el gen gen de interés, por midi escala purificación (OriGene). Tienda BAC ADN a 4 º C (evitar la congelación / descongelación del ADN de BAC). </li><li> Transfectar ADN de BAC y el producto de PCR que contenía las mutaciones deseadas del gen de interés en células (por ejemplo, NIH3T3 o BHK21), que son altamente permisiva para la replicación lítica γHV68, con Lipofectamine 2000 (Invitrogen). </li><li> Mantenga dividir celdas hasta que el efecto citopático (CPE) se muestra en la monocapa. Recoger sobrenadante que contenía virus y, si es necesario, amplificar virus en células NIH3T3 o BHK21. </li><li> Infect células NIH3T3 convirus recombinante por centrifugación a 1.800 rpm, 30 º C durante 30 min. </li><li> Cosecha γHV68 infectadas NIH3T3 células y preparar genoma viral mediante el protocolo circularized Hirt 8,9. </li><li> Electro-MAX transformar células DH10B competentes (Invitrogen) por electroporación y la pantalla de colonias que son la resistencia a cloranfenicol (Cm), pero sensibles a la kanamicina (Kan) (Cm gen resistente a la columna vertebral está en BAC, mientras que Kan gen resistente es en transposón inserción). </li><li> Crecer colonias Cm R S Kan en chlorophenicol medio que contiene y preparar BAC ADN con la purificación o mini-midi escala-(OriGene). </li><li> Verificar la mutación deseada en el gen diana mediante PCR, utilizando cebadores específicos para las regiones flanqueantes del sitio de la mutación, y la secuenciación. </li><li> Confirmar no reordenamiento cromosómico en BAC por digestión con enzimas de restricción seleccionados y de campo de pulsos electroforesis en gel. </li><li> Transfectar BAC recombinante en células NIH 3T3 o BHK21 con Lipofectamine2000 (Invitrogen) para preparar recombinante γHV68. </li><li> Mantenga pases células hasta CPE se muestra en la monocapa. Recoger sobrenadante que contenía virus y amplificar recombinante γHV68 en NIH3T3 o células BHK21. </li><li> Determinar el título del virus recombinante y caracterizar las propiedades de crecimiento viral ex vivo e in vivo como se describe en las secciones 1 y 2. </li></ol> 5. Determinar el título viral por un ensayo de placa <ol><li> Crecer las células NIH3T3 a sub-confluente (aproximadamente 80%) antes de densidad células en placas. </li><li> Dividir NIH3T3 en 24 y placas a 20.000 células / pocillo en el día antes de la infección. </li><li> Preparar 10-veces sobrenadantes de virus en serie diluidas con medio DMEM que contenía 8% de suero de ternero recién nacido (NCS). </li><li> Eliminar el medio y cubrir las células NIH3T3 con 0,5 ml de suspensión γHV68. </li><li> Incubar la placa de cultivo de tejidos incubadora, mueva cada 30 minutos, y permite la incubación de procederdurante 2 h. </li><li> Eliminar suspensión viral y células cubren con 0,5 ml de medio DMEM que contiene 2% NCS y 0,75% de metilcelulosa (Sigma). </li><li> Se incuba la placa en la incubadora de cultivo tisular. Contar las placas en el día 6 después de la infección. La tinción de la monocapa, por ejemplo, con violeta de cristal, puede facilitar el recuento de placa. </li><li> Calcular el título viral en los lisados ​​de tejidos sin diluir o lisados ​​celulares usando la siguiente fórmula: Título (UFP / ml) = D x N x 1000 l / ml ÷ l V. N, la media de número de la placa a una dilución apropiada; D, diluciones (por ejemplo, 5, 10, 100 .....) V (l), el volumen de sobrenadante diluido en serie por pocillo. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Tres figuras representativas se muestran aquí, incluyendo γHV68 replicación lítica en el pulmón de tipo salvaje y los Mavs - / - ratón 10, γHV68 fenotipos de replicación líticas en fibroblastos de embriones de ratón (MEF), y recombinhormiga γHV68 que llevan mutaciones en los sitios de fosforilación que son moduladas por la IKKβ MAVS-dependiente. Estos tres experimentos que corroboran constituir un esquema para definir las funciones de defensa innata en γHV68 replicación lítica in vivo y ex vivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig1.jpg" /> Figura 1 γHV68 cargas en los pulmones de los Mavs + / + y los Mavs -. / - Ratones. A) Dos vías de señalización innata principal aguas abajo de MAVS. Los Mavs relés adaptador de moléculas de señalización de citosólicas RIG-I-como los receptores para activar NF-kB y los factores reguladores del interferón (IRF) que, a su vez, hasta de regular la expresión génica de citocinas proinflamatorias y los interferones. B) Mavs + / + y - / - Mavs ratones fueron infectados con 40 PFU γHV68 intranasal y las cargas virales en el pulmón en los puntos de tiempo indicados se determinaron<html> minado por un ensayo en placa usando NIH3T3 monocapa. Cada símbolo representa un ratón. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3140/3140fig2.jpg" /> Figura 2. ΓHV68 cinética de replicación líticas en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). La replicación lítica de γHV68 en Mavs + / + y Mavs - / - MEFs se evaluó por las curvas de crecimiento de varios pasos (A) y cuantitativa en tiempo real PCR (B). Para ambos experimentos, igual número de MEFs y la cantidad de γHV68 se utilizaron para la infección viral a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. (A) Las células y los sobrenadantes se cosecharon a los puntos de tiempo indicados y sujeto a una placa de ensayo para determinar los títulos virales. (B) ARN total fue extraído a partir de γHV68-infectada MEFs y se analizaron por cuantitativa en tiempo real PCR con cebadores específicos para determinados transcripciones líticas (RTA, ORF57, ORF60 y). ig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. La cinética de replicación líticas de γHV68 recombinantes que llevan mutaciones en el dominio de transactivación RTA que suprimen la fosforilación por IKKγ. (A) de varios pasos curvas de crecimiento recombinante de virus de tipo salvaje (γHV68.wt) y el virus mutante (γHV68.mut) en Mavs + / + y Mavs - / - células MEFs (MOI = 0,01). MEFs fueron infectadas con γHV68 a una MOI de 0,01. Las células y los sobrenadantes se cosecharon a los puntos de tiempo indicados y los títulos virales se determinaron mediante un ensayo en placa usando monocapa NIH 3T3. (B) γHV68 RTA nivel de ARNm en γHV68 infectadas con células NIH3T3 (MOI = 0,01). En 30 h después de la infección, el ARN total fue extraído a partir de células infectadas con γHV68 NIH 3T3 y se analizaron por cuantitativa en tiempo real PCR.

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No hay conflictos de interés declarado.

En respuesta a la infección viral, los MAVS dependientes de las vías inmunológicas innatas de señalización se activan para promover la producción de citoquinas inflamatorias antivirales 10-14. Uso de murino γHV68 como un virus modelo para asociado al sarcoma de Kaposi humano oncogénico del virus del herpes y virus de Epstein-Barr 3,4, descubrimos que γHV68 usurpa la vía MAVS-IKKβ para promover la replicación lítico viral a través de la activación transcripcional 5. Emplean...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td></tr><tr><td> Electro-MAX DH10B células competentes </td><td> Invitrogen </td><td> 18290-015 </td></tr><tr><td> Metilcelulosa </td><td> Sigma </td><td> M0512 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP plásmido Sistema Miniprep </td><td> OriGene </td><td> NP100004 </td></tr><tr><td> POWERPREP HP plásmido Sistema Midiprep </td><td> OriGene </td><td> NP100006 </td></tr></tbody></table>

dissecting host-virus interaction in lytic replication of a model herpesvirus

En respuesta a la infección viral, un huésped desarrolla varias respuestas de defensa, tales como la activación de las vías inmunológicas innatas de señalización que conducen a la producción de citoquinas 1,2 antiviral. Con el fin de colonizar el huésped, los virus son obligado a evadir las respuestas del huésped antivirales y manipular las vías de señalización. Desentrañar la interacción huésped-virus arrojará luz sobre el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra la infección viral. Murine γHV68 está estrechamente relacionado con el sarcoma de Kaposi asociado a humano oncogénico del virus del herpes y Epsten-Barr 3,4. γHV68 infección en ratones de laboratorio proporciona un modelo de animal pequeño manejable para examinar todo el curso de las respuestas del huésped y la infección viral in vivo, que no están disponibles para los herpesvirus humanos. En este protocolo, se presenta un grupo de métodos para la caracterización fenotípica y molecular disección de componentes de sistema principal de señalización en γHV68 replic líticoación tanto in vivo como ex vivo. La disponibilidad de las cepas de ratón modificados genéticamente permite la interrogación de los papeles de las rutas de señalización de acogida durante γHV68 infección aguda in vivo. Además, fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) aisladas a partir de estas cepas de ratón deficientes se puede utilizar para diseccionar las funciones de estas moléculas durante γHV68 vivo ex lítico de replicación. El uso de ensayos de biología molecular y virológicos, podemos señalar el mecanismo molecular de la interacción virus-huésped y anfitrión identificar y genes virales esenciales para la replicación viral lítica. Finalmente, un cromosoma artificial bacteriano (BAC) sistema facilita la introducción de mutaciones en el factor viral (s) que específicamente interrumpir la interacción huésped-virus. Recombinante γHV68 llevar estas mutaciones se puede utilizar para recapitular los fenotipos de γHV68 replicación lítica en MEFs deficientes en la clave de host componentes de señalización.Este protocolo ofrece una excelente estrategia para interrogar interacción huésped-patógeno en múltiples niveles de intervención in vivo y ex vivo. Recientemente, se ha descubierto que γHV68 usurpa una vía de señalización inmune innata para promover la replicación viral lítico 5. Específicamente, γHV68 de novo infección activa la quinasa IKKβ inmune y IKKβ activada fosforila el factor de transcripción viral maestro, la replicación y transactivador (RTA), para promover la activación transcripcional viral. Al hacerlo, γHV68 eficientemente su pareja de activación transcripcional de acoger la activación inmune innata, facilitando de ese modo la transcripción y la replicación viral lítica. Este estudio proporciona un excelente ejemplo de que se puede aplicar a otros virus para interrogar a la interacción huésped-virus.

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Se describe un protocolo para identificar las principales funciones de las moléculas de señalización de acogida en la replicación lítica de un modelo herpesvirus, virus herpes gamma 68 (γHV68). La utilización de cepas de ratón modificados genéticamente y los fibroblastos embrionarios de γHV68 replicación lítica, el protocolo permite tanto la caracterización fenotípica y molecular de las interacciones interrogatorio virus-huésped durante la replicación viral lítico.

Disección de Host-virus Interacción en la replicación lítica de un Herpesvirus Modelo

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

dissecting-host-virus-interaction-lytic-replication-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.8K vistas.  UT Southwestern Medical Center. Se describe un protocolo para identificar las principales funciones de las moléculas de señalización de acogida en la replicación lítica de un modelo herpesvirus, virus herpes gamma 68 (γHV68). La utilización de cepas de ratón modificados genéticamente y los fibroblastos embrionarios de γHV68 replicación lítica, el protocolo permite tanto la caracterización fenotípica y molecular de las interacciones interrogatorio virus-huésped durante la replicación vira...

Video: Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi&#039;s Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

La identificación de genes inducida por la desregulación de Sarcoma de Kaposi asociado al virus del herpes (HVSK)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Investigación

Inmunología e Infección

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Ensayo de alto rendimiento para Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Asociación Typhimurium, Invasión y replicación en macrófagos

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis como organismo modelo para la evaluación de la interacción de bacterias anaerobias con células huésped

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis. 
Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories. 
This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para Equid herpesvirus-2 Diagnóstico en los flujos respiratorios

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.