1) Preparación de Drosophila melanogaster muscular unión neuronal (UNM) <ol><li> Prepare estándar Drosophila salina (130 mM NaCl, 36 mM de sacarosa, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM de MgCl 2, 5 mM Hepes, pH 7,3 4. </li><li> Diseccionar la preparación en solución salina (1,1). Las larvas de Drosophila se consumía dorsal de lado en un plato Sylgard; la cara dorsal es seccionado longitudinal, y los órganos internos son removidos. La preparación se estira y se consumía. Varios músculos ventrales pueden ser entonces utilizados. </li></ol> 2) La estimulación y la tinción de FM <ol><li> Es aconsejable hacer todos los pasos siguientes en condiciones de poca luz, con el fin de proteger a los colorantes FM de blanqueo. </li><li> Para la estimulación química de los nervios, el tampón de potasio se utiliza. Prepare Drosophila salina (ver 1.1), que contiene 90 mM de KCl y 10 mM de FM1-43 tinte. Mantener la solución de la luz. </li><li> Baño de la preparación con el buffer preparado previamente durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Lavar con solución salina normal Drosophila (1,1) para eliminar extracelular FM1-43 tinte. Proceder rápidamente a la fijación. </li></ol> 3) fijación <ol><li> Baño de la preparación con el 2,5% de glutaraldehído en tampón fosfato salino (PBS) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Para una buena conservación de las características morfológicas, el glutaraldehído es preferible a paraformaldehído. </li><li> Lavar una vez con PBS y luego dejar la preparación sumergidas durante 15 minutos en 100 mM de NH 4 Cl. Este paso se realiza con el fin de calmar los grupos aldehído libre de fijador de glutaraldehído restantes. </li><li> Lavar la solución de NH 4 Cl con normalidad PBS. </li></ol> 4) fotoconversión <ol><li> Incubar la preparación NMJ durante 30 minutos a 4 ° C en PBS que contiene 1,5 mg ml-1 de diaminobencidina (DAB). </li><li> Coloque la muestra bajo el microscopio de fluorescencia. Encontrar y enfocar la señal fluorescente con un agua relativamente bajo aumento del objetivo de inmersión (20x 0,5 NA). </li><li> Iluminar la muestra con la intensidad máxima de la lámpara hasta que el colorante FM es totalmente blanqueada (fig. 1C). Para controlar si fotoconversión ha ocurrido, es recomendable comprobar en la muestra objeto de transmisión de la luz antes y después de colorante blanqueo de la FM paso. Si fotoconversión se lleva a cabo, un precipitado de color pardo oscuro que se espera (fig. 1C). El tiempo de iluminación es variable, dependiendo de la fuerza de iluminación y también en la penetración de DAB en la preparación. Para la mayoría de las preparaciones, encontramos momentos de iluminación de ~ 30 a 45 minutos para ser óptimo cuando se utiliza un objetivo de 20x. Períodos más cortos de iluminación se utilizan para los objetivos de mayor aumento (60x). </li><li> Para la iluminación se prefiere usar una lámpara de mercurio, con una lámpara que contiene un espejo de nuevo, que recoge los rayos de luz difundida de vuelta, y por lo tanto aumenta la intensidad total. </li></ol> 5) Procesamiento de la muestra para la EM <ol><li> Osmication <ol class="lalpha"><li> Prepare una solución con un volumen de tetróxido de osmio en el volumen de árboles de agua (aprox. 300 l por ejemplo). Trabajo con tetróxido de osmio se debe hacer bajo el capó, el uso de guantes y equipo de protección aye. </li><li> Incubar la preparación en la solución de tetróxido de osmio durante 1 hora a temperatura ambiente (Bajo el capó). </li><li> Lavar exhaustivamente con PBS (4-5 veces 5 minutos) y la transferencia de cada muestra a un frasco de vidrio limpio. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol class="lalpha"><li> Preparar las soluciones independientes que contienen 30, 50, 70 90, 95 y 100% de etanol. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 30% para cada muestra durante 5 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 50% para cada muestra durante 5 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 70% para cada muestra durante 5 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 90% para cada muestra durante 5 minutos. </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 95% para cada muestra por 5 minutos (repita 3 veces). </li><li> Añadir 1 ml de etanol al 100% a cada muestra por 5 minutos (repita 3 veces). </li></ol></li><li> Incorporación y posterior procesamiento <ol class="lalpha"><li> Mezclar 1 volumen de Epon resina con un volumen de etanol. Agregar a la preparación en rotación continua (2-4 horas). </li><li> Colocar la preparación en Epon 100% en los frascos abiertos, permiten que el etanol restante se evapore (4-6 horas). </li><li> Colocar la preparación en moldes a 60 ° C durante 36 horas. </li><li> Procesamiento electrónico de microscopía. Proceso de la preparación de las secciones 50 a 80 nm fina, utilizando procedimientos estándar ultramicrotomía. </li></ol></li><li> Imágenes de microscopía electrónica de <ol class="lalpha"><li> La preparación es fotografiado usando los procedimientos convencionales de EM. </li></ol></li></ol> 6) Los resultados representativos Los resultados esperados se resumen en las Figuras 1C y 2. El procedimiento da como resultado la iluminación en la formación de brown precipitar DAB, que será visible tanto en la fluorescencia y las imágenes de la transmisión. La primera aparición durante la iluminación es la desaparición de la fluorescencia asociada con la coloración tintes FM. La fluorescencia de fondo inducida por el fijador aldehído, por el contrario, será visible durante todo el experimento. El blanqueo se realiza normalmente en ~ 10-20 minutos después del comienzo de la iluminación. Por lo general no fotoconversión producto se puede observar en este punto del tiempo. La iluminación debe ser continua, y después de unos 10 minutos los preparativos se convertirá en una sombra marrón debido a la acumulación de DAB (Fig. 1C iv) No está claro por qué la precipitación de DAB y FM tinte de blanqueo no tienen lugar al mismo tiempo, es posible que una proporción relativamente grande cantidad de DAB oxidado necesita acumular antes de la agregación y la precipitación, y que por lo tanto, esta reacción es más lenta que el proceso de blanqueo. En esta etapa, sin embargo, la preparación no está listo para el procesamiento de la microscopía electrónica, como la precipitación de DAB es probable incompleta. Preferimos esperar 5-10 minutos más, durante el cual la preparación (terminal nerviosa presináptica) supone una de color marrón oscuro (o negro) de color, indicativo de una conversión completa. Una conversión ligera de la superficie general de la preparación (por ejemplo, de las fibras musculares en la unión neuromuscular) se puede observar en esta etapa. Es más probable en relación a la conversión de DAB inducida por autofluorescencia (y / o fluorescencia fijador), y no es perjudicial para el procedimiento. La preparación es procesada para microscopía electrónica, y debe ser inspeccionado para detectar la presencia de la oscuridad (etiquetado) de las vesículas. Como hemos demostrado antes de 5,6, estas vesículas son mucho más denso que los no etiquetados, y por lo tanto fáciles de distinguir (Figura 2B). Para aumentar la posibilidad de distinguir bien los diferentes tipos de vesículas, no por contraste, las manchas después de las secciones se deben realizar (sin acetato de uranilo o manchas citrato de plomo), la tinción de osmio es suficiente para observar los elementos más móviles, y no es tan oscuro como precipitar DAB. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: colorantes FM y lo utilizan para fotoconversión. (A) representan los pasos de un experimento clásico para la carga y distaining vesículas utilizando colorante FM en la estimulación. (I) incubar la muestra en FM tinte que contiene tampón. (Ii) Estimular (eléctrica o químicamente) para inducir la fusión de vesículas en presencia de FM tinte. (Iii) La endocitosis subsecuencia después de la estimulación a cargar algunos vesículas con tinte FM sigue presente en la memoria intermedia extracelular. (Iv) sustituir el tinte FM extracelular mediante el lavado con tampón. (V) Un nuevo estímulo induce vesículas cargadas de lanzar su tinte de FM en la exocitosis. (B) Esquema que muestra la cabeza, el puente y la cola del colorante FM1-43. (C) Ejemplo de un experimento fotoconversión en Drosophila NMJ. (I) Después de cargar la UNM con FM1-43, el lavado de las moléculas de colorante y la fijación externa, la fluorescencia de una terminación nerviosa se ​​pueden observar con un microscopio convencional de epifluorescencia (63x). (II-III) bajo iluminación continua el tinte es totalmente blanqueada. (Iv) Cuando la iluminación continua, de color negro aparece debido a la precipitación diaminobencidina. Barra de escala representa 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/1790/1790fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: EM ejemplos de las muestras photoconverted (A) La imagen muestra una terminación nerviosa que contiene las vesículas sinápticas, pero no de ellos son photoconverted, lo que podría ser causado por no tener suficiente iluminación o la penetración diaminobencidina pobres en el tejido.. (B) bouton Synaptic con varios oscura (lleno) vesículas que pasó por fotoconversión FM. (C) El exceso de los resultados de la iluminación en una terminal general oscuro, donde no hay vesículas o orgánulos son distinguibles. Las barras de escala representan a 200 nm.

<ol>
	<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li><li>Henkel, A. W., L&#252;bke, J., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM1-43+dye+ultrastructural+localization+in+and+release+from+frog+motor+nerve+terminals.">FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 93, 1918-1923 (1996).</li><li>Sandell, J. H., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+some+fluorescent+markers+to+a+diaminobenzidine+product.">Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product.</a> J Histochem Cytochem. 36, 555-559 (1988).</li><li>Kuromi, H., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+optically+determined+size+of+exo/endo+cycling+vesicle+pool+correlates+with+the+quantal+content+at+the+neuromuscular+junction+of+Drosophila+larvae.">The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 19, 1557-1565 (1999).</li><li>Denker, A., Kr&#246;hnert, K., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+synaptic+vesicle+pool+localization+in+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction.</a> J Physiol (Lond). 587, 2919-2926 (2009).</li><li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+organization+of+the+readily+releasable+pool+of+synaptic+vesicles.">The structural organization of the readily releasable pool of synaptic vesicles.</a> Science. 303, 2037-2039 (2004).</li><li>Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+sharing+of+recycling+synaptic+vesicles+between+presynaptic+boutons.">Constitutive sharing of recycling synaptic vesicles between presynaptic boutons.</a> Nat Neurosci. 9, 315-321 (2006).</li><li>Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+recycling+synaptic+vesicles+in+hippocampal+neurons+by+FM1-43+photoconversion.">Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM1-43 photoconversion.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98, 12748-12753 (2001).</li><li>Lange, R. P. J. d. e., de Roos, A. D. G., Borst, J. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+vesicle+recycling+in+the+rat+calyx+of+Held.">Two modes of vesicle recycling in the rat calyx of Held.</a> J Neurosci. 23, 10164-10173 (2003).</li><li>Richards, D. A., Guatimosim, C., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Synaptic vesicle pools at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 39, 529-541 (2003).</li></ol>

A pocos pasos críticos deben ser tomados en cuenta: <ul><li> La incubación DAB debe realizarse sólo después de un lavado profundo y enfriamiento de los preparativos. De lo contrario el glutaraldehído no reaccionado va a interactuar con DAB y provocar su precipitación (por lo general en forma de cristales planos, que no son densos a los electrones). Preparados en los casos esta precipitación se lleva a cabo en abundancia rara vez son útiles para microscopía electrónica. </li><li> Veces la iluminación debe ...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FM 1-43</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>F10317</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epon resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Plano</td>
<td>R1030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>di-aminobenzidine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50% Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AppliChem</td>
<td>A3166</td>
<td>EM grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>104186298</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axioskop 2 FS plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Objective 20x 0.5 NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dry objective</td>
</tr>
<tr>
<td>100W Hg Lamp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lamp housing with back mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>1007-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MRm camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>0445-554</td>
<td>Image acquisition</td>
</tr>
<tr>
<td>Ex. Filter (HQ 470/40)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F49-671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic (495 DCLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F33-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Em. Filter (HQ 500 LP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AHF</td>
<td>F42-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proscan CCD HSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proscan Electronic Sys.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1024 x 1024</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes

La fusión de las vesículas sinápticas con la membrana plasmática (exocitosis) es un paso necesario en la liberación de neurotransmisores y la comunicación neuronal. Las vesículas se recuperan de la membrana plasmática (endocitosis) y se agruparon junto con el grupo general de vesículas dentro de la terminal nerviosa, hasta que se someten a un nuevo exo-y el ciclo de endocitosis (reciclaje de vesículas). Estos procesos han sido estudiados usando una variedad de técnicas como la microscopía electrónica, las grabaciones de electrofisiología, amperometría y medidas de capacitancia. Es importante destacar que, durante las últimas dos décadas una serie de marcadores marcados con fluorescencia surgido, lo que las técnicas ópticas para rastrear las vesículas en la dinámica de su reciclaje. Uno de los marcadores más comúnmente utilizado es el estirilo o FM tinte 1; estructuralmente, todos los tintes FM contiene una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático y uno o más dobles enlaces (Fig. 1B). Un experimento clásico tinte FM para etiquetar un grupo de vesículas consiste en bañar la preparación (Fig. 1AI) con el colorante durante la estimulación del nervio (eléctrica o con alto contenido de K +). Esto induce reciclaje de vesículas y la posterior carga del medio de contraste en las vesículas recientemente endocitosis (Fig. 1A I-III). Después de cargar las vesículas con el tinte, una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte sin que desencadenan la liberación de FM a través de exocitosis (Fig. 1A IV-V), proceso que puede ser seguido por el control de la disminución de la intensidad de fluorescencia (decoloración). A pesar de los tintes FM han contribuido en gran medida en el campo de reciclaje de vesículas, que no es posible determinar la localización exacta o la morfología de las vesículas individuales mediante microscopía de fluorescencia convencional. Por esa razón, se explica aquí cómo colorantes FM también se puede utilizar como marcadores endocítica mediante microscopía electrónica, a través de fotoconversión. La técnica fotoconversión explota la propiedad de los tintes fluorescentes para generar especies reactivas de oxígeno en condiciones de iluminación intensa. Preparativos marcados con fluorescencia se sumergen en una solución que contiene diaminobencidina (DAB) y se ilumina. Las especies reactivas generadas por las moléculas de colorante oxidar el DAB, que forma un precipitado estable, insoluble que tiene un aspecto oscuro y se pueden distinguir fácilmente en el microscopio electrónico de 2,3. Como DAB sólo es oxidado en las inmediaciones de las moléculas fluorescentes (como las especies reactivas de oxígeno son de corta duración), la técnica se asegura de que las estructuras sólo la etiqueta fluorescente va a contener la precipitación de electrones de alta densidad. La técnica permite así que el estudio de la ubicación exacta y la morfología de la forma activa de reciclaje orgánulos.

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

Colorantes FM han sido de inestimable ayuda en la comprensión de la dinámica sináptica. FM son normalmente seguidos bajo el microscopio de fluorescencia en condiciones de estimulación diferente. Sin embargo, fotoconversión de tintes FM combinada con el microscopio electrónico permite la visualización de los distintos grupos de vesículas sinápticas, entre los componentes de la ultraestructura otra parte, en botones sinápticos.

El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K vistas.  European Neuroscience Institute Göttingen. Colorantes FM han sido de inestimable ayuda en la comprensión de la dinámica sináptica. FM son normalmente seguidos bajo el microscopio de fluorescencia en condiciones de estimulación diferente. Sin embargo, fotoconversión de tintes FM combinada con el microscopio electrónico permite la visualización de los distintos grupos de vesículas sinápticas, entre los componentes de la ultraestructura otra parte, en botones sinápticos.

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Investigación

Neurociencias

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

El examen de la vesícula sináptica Reciclaje utilizando tintes FM Durante Evocados, espontánea, y actividades sinápticas miniatura

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Medición de endocitosis vesícula sináptica en neuronas Hippocampal cultivadas

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Modelo murino de inflamación inducida por Pentylenetetrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Evaluación de multiplicidad sináptica mediante electrofisiología Patch-clamp de celulares

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...