El trabajo para este proyecto fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud R01-NR5339 y la Universidad de Servicios Uniformados de Ciencias de la Salud-R061LD.

1. Aislamiento y preparación de las arterias Pial <ol><li> Mientras que la rata es insertar anestesiados y seguro de un catéter en una arteria y una perfusión con Evans 1% de azul en 1X PBS. Vasos piales mancha bien con el colorante azul de Evans haciéndolos más fáciles de aislar. </li><li> Extraer el cerebro y se almacena a -70 ° C hasta que sea necesario. De manera óptima, el cerebro no se deben almacenar más de 2 meses. </li><li> Utilizando un microscopio de disección eliminar las arteriolas pial (35-50 micras de diámetro promedio) de la superficie del cerebro. Extraiga cuidadosamente todas las arteriolas teñidas de azul de dorsales y laterales de la superficie de la corteza usando pinzas de punta fina. Eliminar el exceso de tejido cortical adheridas antes de colocar en el fijador. </li><li> Fijar las arteriolas cosechado en el 2% de paraformaldehído frío en PBS 0,1 M durante 30 min. </li><li> Para preparar las arteriolas para seccionar vierta medio de inclusión en la congelación de disco / plato (fijada en -20 ° C). </li><li> Coloque la sección arteriola plana sobre el plato unaº esperar a que se congele. Firmemente a cabo el buque arriba a la derecha en el disco de la congelación sobre la incorporación de los medios de comunicación criostato con la punta de la arteria hacia usted. Sostenerlo con pinzas hasta que esté sólidamente congelado. </li><li> Coloque el disco de congelación con el vaso en la cabeza del criostato y cortar ocho anillos micras pial arteriola con el criostato. </li><li> Monte las secciones de las arteriolas de cromo y potasio de gelatina diapositivas subbed. </li><li> Tienda de las diapositivas preparadas en una caja de diapositivas en el refrigerador a 4 º C durante la noche. </li></ol> 2. ER-α tinción de inmunofluorescencia Día 1 <ol><li> Eliminar las diapositivas de la nevera, poner cada uno a temperatura ambiente. </li><li> Para este lavado verter 1-1,5 ml 0,1 M PBS (suficiente para cubrir todas las secciones) deje reposar durante 10 minutos, escurrir y repetir el procedimiento dos veces más. Cada borde de la diapositiva tiene un marcador hidrofóbicas. En consecuencia, el líquido permanece en la superficie de la diapositiva. Con cada lavado se vierte el líquidoy reemplazados con PBS 0,1 M. </li><li> Incubar los portaobjetos en 1 ml de cloruro de amonio 50 mM durante 30 min a temperatura ambiente para reducir la fluorescencia endógena. </li><li> Se lavan los portas en PBS 0,1 M 3x10 min. como se describe en el punto 2.2 </li><li> Diapositivas de bloque en el 0,1% Triton X-100, más 1% de suero normal de cabra (NGS) en PBS durante 30 min. para reducir la unión no específica. </li><li> Incubar las muestras con el anticuerpo primario (policlonal de conejo anti-ER-α, 1:500) en PBS + 0,1% Triton X-NGS + 1% de la noche a 4 ° C. </li></ol> Día 2 <ol start="7"><li> Eliminar las diapositivas de la nevera, poner cada uno a temperatura ambiente. </li><li> Se lavan los portas en PBS 0,1 M 3x10 min. como se describe en el punto 2.2 </li><li> Incubar con Oregon Green 488 secundario anti-conejo de NGS 1% 0,1% Triton-X100 + PBS durante 2 horas en la oscuridad a temperatura ambiente. A partir de este paso, los siguientes pasos deben hacerse en la oscuridad. </li><li> Se lavan los portas en PBS 0,1 M 3x10 min. como se describe en el punto 2.2 </li><li> En virtud de un vecampana ntilated, coloque 1 gota de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), además de medio de montaje en los vasos y colocar un cubreobjetos sobre la muestra. </li><li> Aplicar esmalte de uñas transparente para sellar los bordes de la hoja de cubierta. No mover las diapositivas hasta que esté completamente seca, que dura aproximadamente 24 horas. </li></ol> 3. Fluorescencia de imagen digital <ol><li> Para obtener imágenes de ER-α en el vaso pial corte se utiliza una Nikon Eclipse 80i microscopio digital fluorescente con filtros de tres colores (azul, verde y rojo), equipado con una cámara digital. </li><li> Inserte las diapositivas preparadas con los segmentos de buques manchada pial bajo el microscopio y ajuste para visualizar las áreas de interés marcados con fluorescencia. Iniciar con un aumento de x100 luego aumentar a x600 aumentos. </li><li> Utilice la cámara para capturar imágenes en DAPI (azul) y FITC (verde) para los canales de los núcleos celulares (DAPI) y ER-α (Oregon Green), utilizando el software Nikon extendido foco de profundidad para convertir ver múltipless de los segmentos de buques en imágenes 2-D. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Estamos localizados los receptores de estrógenos-α en el pial vasos arteriales mediante sondas fluorescentes y optimizado nuestra visualización del receptor mediante microscopía de fluorescencia digital. Para detectar la presencia del receptor, un conejo anticuerpo primario policlonal y un verde Oregon 488 anticuerpo secundario marcado se utilizó la imagen de los receptores en las arterias pial aislada de la superficie del cerebro. Además, una tinción nuclear (DAPI) se utilizó para identificar los núcleos de las células y determinar si se podría detectar receptores localizados en el núcleo desde el ER-α se ha informado que estará presente en el cyotosol célula y el núcleo. Además, se realizaron experimentos de confirmación para validar la especificidad del anticuerpo primario y para verificar la unión de la secundaria a la primaria de anticuerpos. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Figura 1"/><br/&gt; Figura 1. Tinción de inmunofluorescencia para la ER-α (verde) y contratinción con DAPI (azul) en un anillo arterial pial aislada de cerebro de rata hembra. Fig. 1A muestra las imágenes fusionadas lo que sugiere la presencia de cierta cantidad de estrógenos intranucleares receptor-a. (Flecha) Fig. 1B y 1C son la imagen enfocada de ER-α, que es una combinación de Z-stack imágenes. Las imágenes fueron tomadas en x600 magnificación y son del anillo de corte de la misma nave en diferentes planos. Las flechas indican los receptores de estrógenos-α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Tinción de inmunofluorescencia para los grupos de control en una red de arterias pial aislada de cerebro de rata hembra. Fig. 2D muestra el buque sin anticuerpo primario. Fig. 2E muestra el buque sin el anticuerpo secundario (autofluorescencia nota distinta al lado endotelial). Las imágenes fueron tomadas en x600 magnificación y son del anillo de corte de la misma nave en diferent aviones.

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	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

Las opiniones expresadas son las de los autores y no reflejan la política oficial ni la posición de la Universidad de Servicios Uniformados de Ciencias de la Salud, el Departamento de Defensa, o el gobierno de Estados Unidos.

Anteriormente, hemos demostrado que después de una lesión transitoria mundial cerebral isquémico de la arteria pial capacidad de cambio de diámetro en respuesta a los vasodilatadores 7, 8 y 9 vasoconstrictores es marcadamente deprimidos en los jóvenes ratas ovariectomizadas. Reposición de estrógeno crónica restaura las respuestas vasomotoras 7-9. Además, el reemplazo de estrógeno retraso revierte los efectos beneficiosos de los estrógenos sobre la arteria pial capacidad vasodilatadora 10 que nos lleva a la pregunta de si a largo plazo el agotamiento de los estrógenos afecta a ER-α densidad en el cerebrovasculature. Se planificó utilizar el etiquetado de inmunofluorescencia en combinación con el Western Blot para evaluar los cambios en la ER-α expresión en respuesta al agotamiento del estrógeno crónica. Porque hemos tenido algunas dificultades en la visualización de los grupos discretos de receptores se modificó el método que se demuestra aquí. Por lo tanto, nuestro objetivo principal en este estudio fue desarrollar primero un método relativamente sencillo para optimizar la visualzación de los receptores en las arteriolas pial. De acuerdo con varios informes 6,11,12 nos pareció que era necesario hacer ajustes para el tipo de tejido que estaban investigando, el espesor de la muestra, la distribución de ER-α en el buque, así como el grado de unión no específica . Nuestro método es muy eficaz para visualizar la presencia de ER-α en rodajas barco pial. Sin embargo, como ya se ha señalado anteriormente el uso exitoso de estos métodos depende en gran medida la especificidad y la concentración de los anticuerpos, la localización subcelular de las proteínas de interés, la fijación y protocolos de bloqueo y la manipulación de tejidos 12. Antes de la visualización de los preparativos nuestro barco pasamos tiempo para trabajar en todas estas variables. Hemos puesto de relieve la forma en que es necesario ajustar algunos de nuestro enfoque en este documento. Nos pusimos en marcha para visualizar de forma óptima ER-α en las arteriolas piales y esto presenta algunos desafíos.En primer lugar, el tamaño promedio de una arteria de rata pial es entre 35 a 50 micras haciendo aislamiento y la eliminación de la superficie del cerebro un poco complicado. Encontramos que la perfusión con colorante azul de Evans antes de su sacrificio hace la disección de las arterias más fácil. Azul de Evans pueden afectar a la fluorescencia, pero creemos que la ventaja de utilizar este medio son mayores que sus inconvenientes menores. En nuestro protocolo de los vasos se lavan varias veces. Esto minimiza el tinte residual en los vasos sanguíneos y reduce los posibles efectos del colorante en la fluorescencia. Otra dificultad que encontramos fue que el espesor de los segmentos de buques pial hizo una visualización clara de los receptores difícil. Además, no hemos podido obtener imágenes muy clara, probablemente debido al hecho de que la ER-α se dispersó a lo largo de varias capas de células. Hemos intentado trabajar con las rebanadas de vasos longitudinales (como otros han hecho), pero debido al tamaño pequeño pial era difícil de manejar las embarcaciones y evitar la tortuosidad de los vasos durante el montajeen las diapositivas, incluso con un microscopio. Por último, hemos modificado nuestra técnica con éxito mediante el uso de un criostato y cortar el buque en sentido cruzado a ocho anillos de micras de espesor. Los anillos son más fáciles de manejar y varios se puede montar en una diapositiva. Una vez que hemos adquirido los vasos creemos que es necesario poner a prueba la eficacia de la primer destello de la congelación de los tejidos a continuación se fijan los vasos según lo sugerido por Danseshatalb y asociados 11. A pesar de que encontró un poco menos de inmunofluorescencia de fondo, también señaló que los receptores manchada con menor intensidad lo que la visualización de los receptores más difícil. En consecuencia, preferimos primero en congelar todo el cerebro y la tienda hasta que sea necesario (generalmente entre 1-2 meses). A continuación, salga de los vasos como se describe y arreglar los barcos antes de cortar con el criostato. como se demuestra aquí. Un paso necesario es para ejecutar los controles tanto con la primaria y la secundaria de anticuerpos por separadopara determinar la especificidad y la inmunofluorescencia de fondo. El estrógeno α del receptor de anticuerpos pueden ser difíciles de trabajar. De hecho, hemos tratado tres diferentes anticuerpos primarios (1 monoclonales y policlonales 2) antes de que se mostraron satisfechos con el éxito de nuestra tinción de los receptores. Como parte de nuestros controles, primero verificar la especificidad del anticuerpo primario por omisión de la adición del anticuerpo primario. La figura 2D muestra el buque sin anticuerpo primario. No hay manchas y sólo una señal de poco fondo. Puesto que el anticuerpo primario es policlonal, hay una cierta difusa tinción no específica de fondo. En segundo lugar, añadió el anticuerpo primario, pero no el anticuerpo secundario (Fig. 2E). Se puede ver un buen margen en representación de la autofluoresence a lo largo de las fronteras del endotelio de los vasos. Esto es consistente con la obra de Dan y sus asociados 5. Sin embargo, ni los pequeños puntos de inmunofluorescencia que representan ER-α, ni el árbitro aspecto granularlecting la presencia de numerosos receptores pueden ser detectadas sin la combinación de los anticuerpos primarios y secundarios. Hemos observado un patrón distinto de autofluoresence a lo largo de los márgenes del endotelio de los vasos. Estas pruebas independientes de la especificidad de anticuerpos son importantes ya que confirman la especificidad de los anticuerpos de ER-α y el anticuerpo secundario se une a la primaria. En conclusión, como lo demuestran los otros 4, 5 vasos sanguíneos del cerebro contienen numerosos ER-α sub-tipo de receptores. En nuestras manos, preparando 8μm rebanadas de la sección transversal de las arterias aisladas pial mejora la coloración y la visualización de los receptores. Los métodos tradicionales de uso de la microscopía confocal para estudiar las muestras. Tener la capacidad para ver la serie de secciones ópticas a partir de muestras de espesor es un beneficio importante de la microscopía confocal. Sin embargo, la compra de un microscopio confocal bien puede ser muy costoso. Mediante el uso de gran profundidad (FED) de software, se encontró quepodría reducir nuestros costos de los equipos. Utilizando un microscopio de fluorescencia con EDF se obtuvieron imágenes claras y son capaces de visualizar pial arterial ER-α en varios niveles con Z-pilas. Una ventaja importante de los programas del FED es que permite la captura de imágenes de una manera efectiva para crear una imagen 3-D a partir de las imágenes. Para los laboratorios que no tienen acceso a un microscopio confocal o los fondos para una compra de un microscopio digital fluorescente con el software apropiado puede ser una opción práctica y menos costosa en función de los objetivos del investigador.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> EVANS BLUE </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> PBS 10 veces </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek octubre Compuesto </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Cloruro amónico </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Suero normal de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER-α anticuerpo policlonal de conejo </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon verde 488 cabra anti IgG de conejo </td><td> Invitrogen </td><td> O-11038 </td></tr><tr><td> Vectashield montajemedio para fluorescencia con DAPI </td><td> Vector Lab. </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

Muchos de los efectos del estrógeno sobre la reactividad vascular están mediados por la interacción con receptores de estrógenos 1, 2, 3. A pesar de dos sub-tipos existen (los receptores de estrógenos-α y β), los receptores de estrógenos-α ha sido identificado tanto en el músculo liso y células endoteliales de pial segmentos arteriales mediante la tinción fluorescente combinado con láser confocal de barrido microscopio 4. Por otra parte, ER-α se encuentra en el núcleo y en el citoplasma de las arterias basilar ratas 5. Los receptores son abundantes y fluorescentes brillantes, pero la visualización clara de los grupos discretos de receptores es difícil debido probablemente a los números situados en las capas de células que muchos de los segmentos de buques pial. Además, muchos informes mediante técnicas de inmunohistoquímica se combina con microscopía confocal mal detalle los requisitos críticos para la reproducción de los experimentos 6. Nuestro propósito en este artículo es describir una técnica sencilla para optimizar el tque las manchas y la visualización de ER-α utilizando secciones transversales de las arteriolas pial obtener de los cerebros de ratas hembras. En primer lugar, perfundir las ratas con colorante azul de Evans para identificar con facilidad las arterias superficie pial que se aísla en un microscopio de disección. El uso de un criostato para cortar secciones de 8 micras cruz de las arterias que nos permite obtener cortes finos vasos para que los aviones de diferentes vasos están más claramente visualizada. Atravesando el buque en lugar de utilizar un segmento de vaso pequeño tiene la ventaja de facilitar la visualización de las capas endoteliales y de músculo liso. Además, el uso de un microscopio de inmunofluorescencia digitales con el software de gran profundidad produce imágenes claras y de diez a doce aviones barco diferente y es menos costosa que el uso de un microscopio láser confocal de barrido.

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Imaging of Estrogen Receptor-&amp;#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

El objetivo de este artículo es mostrar un método para optimizar la detección de inmunofluorescencia de los receptores de estrógenos-α (ERα) en ratas pial rebanadas arterial usando un microscopio de inmunofluorescencia digital.

Imágenes de los receptores de estrógenos-α en ratas arteriolas Pial usando un microscopio de inmunofluorescencia Digital

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

12.3K vistas.  Uniformed Services University of the Health Sciences. El objetivo de este artículo es mostrar un método para optimizar la detección de inmunofluorescencia de los receptores de estrógenos-α (ERα) en ratas pial rebanadas arterial usando un microscopio de inmunofluorescencia digital.

Video: Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Limpieza y cuidado apropiado del microscopio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Investigación

Biología

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Los componentes principales del microscopio de luz

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Configuración de un microscopio de luz Hoja simple para<em&gt; En Toto</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desarrollo

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

La visualización y cuantificación de la Capa libre de células en las arteriolas del músculo cremáster Rata

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Detección de ligandos estrogénica en productos de Cuidado Personal con una pantalla de estrógeno levadura optimizado para el laboratorio de enseñanza de pregrado

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Técnicas de microescala Phenotyping de maíz haces vasculares basados en tomografía de rayos x Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Aislamiento de hepatocitos primarios de rata con control de perfusión multiparamétrico

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...