Este trabajo fue apoyado por la Junta de Regentes del Estado de Louisiana LEQSF (2009-12)-RD-A-19 (PI: WL Murfee) y la hipertensión de Tulane y del Centro Renal de Excelencia financiados por el NIH subvención P20RR017659-08 (PI : L. Gabriel Navar).

1. Set-Up procedimiento quirúrgico Notas <ol><li> Antes de la cirugía esterilizar material quirúrgico e instrumentos. Fuentes utilizadas para el procedimiento quirúrgico estéril para cada rata incluyen 1 drapeado que se tumbábamos como una superficie estéril para la colocación de instrumentos, una sábana con un agujero de pre-corte en aproximadamente 0,5 x 1,5 en el centro en que se coloca sobre la rata , y la gasa. El agujero de pre-corte en el paño se alinearán con la incisión hecha en la rata. Instrumentos necesarios para la cirugía incluyen 1 par de tijeras estándar que se usa para cortar material de sutura, pinzas dos y un soporte de aguja fina para la manipulación y la sujeción de la sutura, y un bisturí con una cuchilla. Hemos hecho una lista de las herramientas más comunes utilizadas por nuestro laboratorio en la tabla de determinados materiales y herramientas quirúrgicas. Sin embargo, la herramienta de selección final depende de las preferencias del experimentador. </li><li> Preparar el espacio cirugía. Colocar un 100 ml 0,9% bolsa de solución salina estéril bajo una almohadilla térmica para asegurar que la solución salina que entra en contacto won el tejido mesenterio es pre-calentado a aproximadamente 37 ° C. Como una alternativa a la solución salina, se puede utilizar la solución de Ringer o otro tampón fisiológico. Coloque los instrumentos quirúrgicos esterilizados y suministros en un campo estéril para facilitar el acceso durante el procedimiento de exteriorización. Además, tendrá estériles aplicadores de punta de algodón y los correspondientes 3 tipos de suturas (4-0, 5-0 y 7-0). Hace paquetes estén previamente abierto de modo que los materiales se puede acceder a la manipulación estéril. Finalmente, la desinfección de la etapa de plástico pre-modificado por inmersión en etanol al 100% durante al menos 5 minutos. La etapa es una placa de Petri de 100 mm con un agujero elíptico cortado en el centro (Figura 1). Una herramienta de Dremel se puede utilizar para hacer inicialmente y, si es necesario, ensanchar el agujero. Después de que el agujero se hace, los bordes de la corte se hacen de plástico liso usando papel de lija de diferentes granos. La etapa se lava a continuación y, finalmente, ya sea arcilla inerte (comprado en una tienda de artesanía local) o silícicoen cola se añade al borde del agujero con el fin de proporcionar una elevada, superficie lisa. Antes de ponerse en contacto con el tejido, la etapa tendrá que ser adecuadamente enjuaga con solución salina estéril. </li><li> Para este modelo de la angiogénesis, que normalmente utilizan ratas Wistar macho adultas (350 ± 25 g). Otras cepas de ratas y edades puede ser utilizado. En nuestro laboratorio, las ratas son anestesiadas por vía intramuscular con ketamina (80 mg / kg de peso corporal), xilacina (8 mg / kg de peso corporal), y la atropina (0,08 mg / kg de peso corporal). Después de aproximadamente 5 minutos, el efecto de la anestesia y se confirma la piel abdominal de la rata se afeitó. </li></ol> 2. Mesenterio Rata Exteriorización Modelo <ol><li> Coloque la rata anestesiada en su espalda en un cojín de calefacción para mantener la temperatura corporal. Técnicas asépticas se utilizan durante el procedimiento quirúrgico. Use guantes estériles y no permitir que los instrumentos y suministros para ponerse en contacto con superficies no estériles que no sean los tejidos de rata. </li><li> Limpie la zona abdominal con la alternancia de paños using la gasa estéril empapada en isopropílico al 70% y el yodo. </li><li> Uso de la hoja de bisturí, hacer una pequeña (aproximadamente 0,75 pulgadas) incisión longitudinal a lo largo de la piel y luego la línea alba aproximadamente 1 pulgada por debajo del esternón. </li><li> Coloque el paño de pre-corte sobre la parte abdominal de modo que la abertura se alinea con la incisión. </li><li> Aplique suavemente la presión alrededor de la incisión. Esto suele resultar en una exposición del intestino delgado, lo suficiente para que pueda ser fácilmente identificado. </li><li> Uso de los aplicadores de punta de algodón, tire suavemente de una sección del intestino delgado y localizar el íleon. Como el mesenterio se sacó, se debe suavemente tumbábamos en la etapa de plástico (Figura 2). </li><li> Identificar 6-8 ventanas mesentéricas vascularizados. Una ventana mesentérica se define como la fina membrana translúcida entre los pares en la arteria / vena de alimentación del intestino delgado (Figura 2). </li><li> Anote la hora de inicio de exteriorización. Deje el mesenteRy sección exteriorizada durante 20 minutos. Durante el período de exteriorización, utilice una jeringa estéril (5 ml) para reponer la solución salina de forma intermitente en la placa de Petri para asegurar que el tejido permanece sumergido y no se seca. </li><li> Durante el tiempo de exposición de 20 minutos, marcar los 2 céntricos ventanas mesentéricas con estériles de sutura 7-0. Las marcas deben hacerse en la zona cerca de la grasa en el intestino. </li><li> Volver la región exteriorizada del mesenterio a la cavidad abdominal. </li><li> Cierre el músculo abdominal con sutura monofilamento 5-0 en el patrón de interrupción. </li><li> Cierre la piel con sutura monofilamento 4-0 en el patrón de interrupción. </li><li> Limpie el área suturada con la alternancia de paños con la gasa estéril empapada en el 70% isopropoyl y yodo. </li><li> Corre de gel lubricante ocular en ambos ojos de la rata. El propósito de lubricar el ojo es para evitar la desecación de la córnea durante el procedimiento quirúrgico y la recuperación. La aplicación de lubricante del ojo debe ser aplicadoantes del comienzo de la intervención quirúrgica. Si es necesario, volver a aplicar lubricante ocular antes de devolver la rata a su jaula para su recuperación. </li></ol> 3. La recolección y fijación de tejidos <ol><li> En el día de estimulación interés puesto, anestesiar y la eutanasia a la rata. En nuestro laboratorio, las ratas son anestesiadas por vía intramuscular con ketamina (80 mg / kg de peso corporal), xilacina (8 mg / kg de peso corporal), y la atropina (0,8 mg / kg de peso corporal) y luego sacrificados mediante inyección intracardíaca de beuthanasia. Beuthanasia es una pentobarbital sódico / fenitoína solución que puede ser utilizado para la eutanasia rápida y sin dolor. Por rata nuestro laboratorio por lo general se inyecta 0,1 a 0,2 ml. </li><li> Vuelva a abrir la cavidad abdominal y retire con cuidado el intestino delgado y ubicar las ventanas de dos marcadas. </li><li> Recorta cada una de las ventanas mesentéricas exteriorizadas con pinzas y tijeras micro. La inclusión de una frontera de la ventana por la grasa es ventajosa para el tejido más adelante la difusión en portaobjetos de microscopio. Inmediatamente, Sumerja cada ventana en PBS. Al cortar, tratar de evitar que se corte a través de pares de la arteria / vena en el territorio de grasa de las ventanas para minimizar el potencial de la sangre de llenado de las ventanas. Además, minimizar el corte a través del intestino que resulta en contenido intestinal contactando las ventanas. </li><li> Use unas pinzas para extender los tejidos en el microscopio cargados positivamente. Dos tejidos se puede montar en cada diapositiva. </li><li> Permita que los tejidos se seque parcialmente y el uso de una hoja de bisturí quitar el exceso de grasa. </li><li> Los tejidos son ahora listo para ser reparado. Los métodos típicos de fijación puede ser utilizado. En nuestro laboratorio, que comúnmente se fijan los portaobjetos en metanol (-20 ° C) durante 30 min. El éxito de etiquetado También se ha realizado con tejidos no fijadas. Métodos de fijación podría depender de su anticuerpo preferido. </li></ol> 4. Tejido inmunomarcación <ol><li> Los tejidos en general, pueden ahora ser etiquetados de acuerdo a las instrucciones por anticuerpos de inmunohistoquímica. Dado nuestro interés en la identificación de los rolesde pericitos vasculares durante la angiogénesis, nuestro laboratorio comúnmente etiquetas para las células endoteliales y perivasculares 10, 12, 13. Etiquetas útiles para identificar las células endoteliales a lo largo de la jerarquía de las redes microvasculares son un anticuerpo anti-PECAM o BSI-lectina. Marcadores perivasculares de células utilizadas en este tejido incluyen NG2, desmina, actina SM-α, PDFGRβ, y clase III β-tubulina. A continuación, en la sección 3.3, ofrecemos una lista de protocolos para los protocolos de inmunomarcación colorimétricas y fluorescentes PECAM. </li><li> Antes de la incubación del anticuerpo primario inicial, los portaobjetos son secó a vacío para eliminar el exceso de solución tampón. Además, los tejidos se describe inicialmente con un lápiz de cera para evitar el flujo incontrolado de soluciones de anticuerpos lejos del tejido. Finalmente, todos los pasos de etiquetado son seguidos por los pasos de lavado. Para la limpieza de los pasos, las diapositivas se colocan dentro de recipientes de tinción. La solución tampón se intercambia 3 veces durante la duración de lavado. </li><li> Los procedimientos de las células endoteliales de anticuerpos de etiquetado: &lt;p class = &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM colorimétrico Lableing <ol><li> Incubación del anticuerpo primario: goteo aproximadamente 100-200 ml de solución de anticuerpo primario (1:200 anticuerpo monoclonal de ratón biotinilado CD31 anticuerpo diluido en tampón de anticuerpo (0,1% de saponina en PBS + 2% de BSA)) en la parte superior de cada tejido; asegurarse de que el tejido completo es cubierto con una solución de anticuerpo. La incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar tejidos con saponina PBS 0,1% durante 30 minutos. </li><li> Incubación del anticuerpo secundario: solución por goteo anticuerpo secundario (Vectastain ABC Elite solución de Vector Laboratories; una solución peroxidasa estreptavidina anticuerpo secundario) en la parte superior de los tejidos. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Lavar tejidos con saponina PBS 0,1% durante 30 minutos. </li><li> Incubar los tejidos con el vector de Nova Roja durante 15 minutos. A continuación, aumentar los tejidos con agua. </li><li> Diapositivas de montaje: Dip diapositivas en el 95% de etanol 10 veces. Sumergir desliza en etanol al 100% durante 2 minutos. Sumerja los portaobjetos en etanol al 100% otra maneralución durante 2 minutos. Luego Sumerja los portaobjetos en xileno consecutivos soluciones 100% durante 2 minutos cada uno. Dejar secar y cubrir los tejidos con una capa delgada de VectaMount y un cubreobjetos. </li></ol> PECAM fluorescente de etiquetado <ol><li> Incubación del anticuerpo primario: goteo aproximadamente 100-200 ml de solución de anticuerpo primario (1:200 anticuerpo monoclonal de ratón biotinilado CD31 anticuerpo diluido en tampón de anticuerpo (0,1% de saponina en PBS + 2% de BSA)) en la parte superior de cada tejido; asegurarse de que el tejido completo es cubierto con una solución de anticuerpo. La incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar tejidos con saponina PBS 0,1% durante 30 minutos. </li><li> Incubación del anticuerpo secundario:. Solución por goteo anticuerpo secundario ((1:100 estreptavidina-CY3 diluyó en tampón de anticuerpo (0,1% de saponina en PBS + 2% de BSA)) en la parte superior de los tejidos Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Lavar tejidos con saponina PBS 0,1% durante 30 minutos. </li><li> Diapositivas de montaje: goteo 50:50 PBS con glicerol en la parte superior de los tejidos. Cubrircon cubreobjetos. A continuación, utilice el esmalte de uñas para sellar la brecha entre cubreobjetos y portaobjetos. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos Imágenes representativas de los tejidos de rata mesenterio inmunohistoquímicamente etiquetados para PECAM se muestran en la Figura 3. PECAM etiquetado identifica todos los tipos de buques a lo largo de la jerarquía de la remodelación de redes microvasculares y se puede utilizar para cuantificar parámetros angiogénicos en el después de la estimulación específica de puntos de tiempo. PECAM etiquetado también permite la determinación de las arteriolas versus vénulas. Arteriolas alimentación exhiben típicamente diámetros más pequeños y la morfología alargada de células endoteliales en comparación con las vénulas apareados (Figura 4). Los capilares y los brotes capilares pueden ser identificados en función de su diámetro de los vasos y la posición relativa dentro de una red. Las características típicas de las redes de remodelación incluyen el aumento de brotes capilares, densidad de los vasos, zona vascularizada y tortuos venularesdad. La cuantificación de diversos parámetros angiogénicos identifica el curso del tiempo de crecimiento de la red (Figura 5). Capilar que brota de vasos preexistentes, picos entre los días 3 y 5 y regresa al nivel estimulada por el día 10. Este aumento transitorio de la germinación es seguido por un aumento en la densidad vascular y área vascularizada. Como prueba de la remodelación de los buques más grandes en este modelo, el número de segmentos de arteriolas y vénulas también aumenta en el transcurso del tiempo. En nuestro laboratorio, este modelo ha sido utilizado para identificar cambios celulares fenotípicos en el punto de tiempo específico durante el proceso de remodelación 10, 11. Por ejemplo, la clase III β-tubulina identifica pericitos a lo largo de los vasos angiogénicos (Figura 6). En los tejidos no estimulados, la clase III β-tubulina expresión es específica de los nervios. En contraste, durante el pico de brotes capilares, clase III β-tubulina se expresa en las células perivasculares. Este tipodel resultado pone de manifiesto la utilización de este modelo angiogénico simple y robusto para identificar nuevos tipos de células que intervienen en el proceso angiogénico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> Figura 1. Imágenes de la etapa de plástico pre-y post-modificación. La etapa de pre-modificado es un 100 mm de placa de Petri. Las modificaciones incluyen un corte agujero elíptico en el centro y la posterior adición de arcilla o pegamento de silicona al borde del agujero para la creación de una superficie elevada y lisa. Esta superficie ofrece una frontera interior que facilita la superfusión de las ventanas mesentéricas exteriorizarse. Barra de escala es de 1 cm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> Figura 2. Imagen de la región mesentérica exteriorizado. Ventanas mesentéricos se definen como las membranas delgadas translúcidas entre los pares de la arteria / vena que alimentan el intestino delgado. Durante la exteriorizaciónduración, la región mesentérica se presenta y se sumerge en una solución salina dentro de un plato de Petri modificada. Arcilla inerte modelado amarillo proporciona una superficie lisa para el mesenterio a pasar a través del agujero de pre-corte. Barra de escala es de 1 cm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes representativas de las redes microvasculares mesentéricos de los tejidos y los tejidos sin estimular a las 3 y 10 días después de la exteriorización del mesenterio. PECAM etiquetado identificado la jerarquía de redes microvasculares incluyendo, arteriolas (A), vénulas (V) y capilares (C). Después de la estimulación, las redes microvasculares muestran un aumento de brotes capilares (puntas de flecha) y la densidad de los vasos. Barra de escala es de 100 m. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> Figura 4. Imágenes representativas de las arteriolas / vénula pares dentro de la red microvascular rata adulta mesentéricas. En ambas imágenes, arteriolas (A) puede ser diferenciada de las vénulas (V) en base a un diámetro menor relativa y morfología alargada de células endoteliales. Las barras de escala son de 20 micras. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> Figura 5. Representante de cuantificación de las métricas de angiogénicos en el transcurso el tiempo de exteriorización mesenterio microvascular crecimiento posterior. A) Área por área vascular del tejido. B) El número de brotes de capilares por área vascular. C) La longitud total por unidad de superficie vascular vascular. * Representa una diferencia significativa en comparación con el grupo no estimulado. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante un ANOVA de un factor seguido de la prueba de Dunn. (P &lt;0,05). De las Naciones Unidas representa sin estimular. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> Figura 6. Representante imágenes fluorescentes de redes microvasculares mesentéricos de los tejidos y los tejidos sin estimular a los 3 y 10días posteriores exteriorización del mesenterio. Inmunofluorescencia PECAM etiquetado (rojo) identifica las células endoteliales, y la clase III β-tubulina etiquetado (verde) identifica los nervios (puntas de flecha) y las células perivasculares (flechas). Las células perivasculares transitoriamente upregulate clase III β-tubulina durante la brotación capilar. En estimulados redes microvasculares, clase III β-tubulina es nervio específico y no identifica a las células perivasculares. 3 días después de la estimulación, la clase III β-tubulina positivamente a lo largo de las etiquetas de las células perivasculares microvasos. Durante el día 10, la clase III β-tubulina patrón de expresión comienza a volver a la situación no estimulada. Barra de escala es de 50 micras. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> Figura 7. Imágenes que apoyan la viabilidad de seguimiento pre-etiquetados células aplicadas a nivel local durante el crecimiento de la red microvascular estimulado por la exteriorización mesenterio. Las células fueron superfused sobre mesenterIC ventanas durante el periodo de exteriorización de 20 minutos. Un día después de la cirugía, las células marcadas DII (rojo) se observaron en el plano focal con Dame PECAM positivo microvasos (verde). A, B) Ejemplos de DII etiquetados células de médula ósea exhibiendo redondeado y alargado morfologías. En algunos casos (flechas) las células fueron alargados a lo largo de los microvasos. C) Ejemplo de un grupo de Dil marcado las células madre mesenquimales, cerca de la punta de un brote capilar (flecha). Las barras de escala son de 50 micras (A), y 20 micras (B, C).

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No tenemos nada que revelar.

El modelo de exteriorización fue reportado en 2006 y es una adaptación de los modelos anteriores de lesiones mecánicas mesenterio de rata de la angiogénesis 4-7 y produce resultados similares a los bien establecidos modelos de inyección de propiedad intelectual que se aprovechan de la rata mesenterio 9. El tiempo de exteriorización 20 minutos se determinó experimentalmente para producir una respuesta angiogénica robusto. Si bien este período de tiempo podría variar, sí permite la aplicación local de los inhibidores angiogénicos 4 para estudios sobre el mecanismo y la aplicación directa de las células exógenas para los estudios de linaje celular. Viabilidad de la incorporación de células en la remodelación de los tejidos mesentéricos se apoya en estudios preliminares en nuestro laboratorio utilizando pre-etiquetados células de médula ósea y células madre mesenquimales (Figura 7), y por el éxito de la investigación del destino de los humanos adiposo derivado del estroma ip inyección de las células 14 . En nuestro laboratorio, hemos utilizado este modelo para identificar phen pericitosotypic cambios en el curso temporal de la respuesta angiogénica 10 y para evaluar el potencial angiogénico en condiciones patológicas, como la hipertensión 12. La respuesta angiogénica y cambios en las células fenotipo asociado con este modelo también se puede observar en otros modelos de ratas mesentéricos angiogénicos, incluyendo la exposición crónica hipoxia 10, 11. Una limitación del modelo de exteriorización es que los mecanismos exactos que desencadenan de la angiogénesis son desconocidos. Exteriorización del mesenterio se ha relacionado con la degranulación de los mastocitos y aumento de los niveles de histamina 6, pero se necesita más investigación para obtener una visión más clara. El estímulo angiogénico es, sin duda, multifactorial, que produce una respuesta robusta a través de la remodelación de la jerarquía de la red microvascular. Si bien los mecanismos desconocidos siguen siendo una gran crítica de este modelo, su reproducibilidad y sencillez lo hacen atractivo para la identificación de la dinámica celular INVOLca en el proceso de por sí complejo capilar germinación. La reproducibilidad del modelo se apoya en indicadores comparables angiogénicos en el transcurso el tiempo de crecimiento de la red microvascular a través de múltiples cepas de ratas (Wistar macho y hembra Sprague-Dawley) en los estudios previamente publicados de nuestro laboratorio 10, 12. Puesto que, la mayoría de los tejidos de rata adulta mesentéricos son vascularizado, el modelo también permite múltiples tejidos para ser examinados por animal. Desafortunadamente, este modelo no es, obviamente, aplicable a los modelos de ratón genéticos como las ventanas de ratón tienen vascularización mesentérica inferior nativa y, en nuestra experiencia, normalmente carecen de observables redes ramificadas. Las aplicaciones futuras incluyen la investigación de la funcionalidad de buques durante la angiogénesis mediante microscopía de vital importancia dentro de en los puntos de tiempo específicos y relacionados con la investigación de la dinámica de celulares implicados en linfangiogénesis y la neurogénesis. Aunque el grado de vascularización nativa por ventana mesentérica parece ser rutinaghly proporcional con la edad, hemos observado la ramificación de redes microvasculares en ratas Wistar macho de tan sólo 4-5 semanas de edad. Estas observaciones sugieren que el modelo exteriorización podría aplicarse también para comparar las diferencias angiogénicos a través de las edades.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios adicionales </td></tr><tr><td> Cubrir </td><td> Cardinal Health </td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;x12&quot; Bio-Shield esterilización regular Wraps </td></tr><tr><td> Noyes Micro tijera </td><td> Roboz Instrumental Quirúrgico </td><td> RS-5677 </td><td> Noyes Micro Tijeras de disección de primavera; Recta, aguda-Blunt puntos, Cutting Edge de 13 mm, 0.25 mm, anchura Consejo 4 1/2 &quot;Longitud total </td></tr><tr><td> Pinza Graefe </td><td> Roboz Instrumental Quirúrgico </td><td> RS-5135 </td><td> Micro pinza de disección; dentado; ligera curva; Ancho Consejo 0,8 mm, 4 &quot;de longitud </td></tr><tr><td> Pinza Graefe </td><td> Roboz Instrumental Quirúrgico </td><td> RS-5130 </td><td> Micro Pinzas de disección con dientes serrados, es recto, con anchura de 0,8 mm; Consejo de 4 &quot;de longitud </td></tr&gt; <tr><td> Sutura 4-0 </td><td> ETHICON </td><td> 699G </td><td> (1,5 métrico) Nylon ETHILON * sutura monofilamento Negro </td></tr><tr><td> 5-0 de sutura </td><td> ETHICON </td><td> 8556 </td><td> (1,0 métrico) PROLENE polyprolene sutura monofilamento azul </td></tr><tr><td> 7-0 de sutura </td><td> ETHICON </td><td> 1647G </td><td> (0,5 métrico) Nylon ETHILON * sutura monofilamento Negro </td></tr><tr><td> Castroviejo Micro Porta Agujas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 12060-02 </td><td> Ancho Sugerencia: 0,6 mm Sujeción Duración: 5 mm Longitud: 9 cm Punta recta </td></tr><tr><td> Castroviejo Porta Agujas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 12565-14 </td><td> Forma de la punta: Heterosexual Ancho Sugerencia: 1,5 mm Longitud de sujeción: 10 mm Tijeras: No hay Bloqueo: Sí Longitud: 14 cm Dentado: Sí </td></tr><tr><td> Mango de bisturí </td><td> Roboz Instrumental Quirúrgico </td><td> RS-9843 </td><td> Mango bisturí, # 3, sólido, 4 &quot;de longitud </td></tr><tr><td> Hoja de bisturí estéril </td><td> Cincinnati quirúrgica </td><td> 0110 </td><td> De acero inoxidable, tamaño 10 </td></tr><tr><td> Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-13 </td><td> Canto biselado, Slippable </td></tr></tbody></table> Tabla de materiales específicos y herramientas quirúrgicas. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios adicionales </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td> Schering-Plough Animal Health Corp. Unión (Pedido de Suministro MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 011168 </td><td> Ingrediente activo: por 100 ml, 390 mg de sodio pentobarbital, 50 mg de fenitoína sódica </td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Fort Dodge Animal Health (Pedido de Suministro MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 000680 </td><td> Kateset 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Xilacina </td><td> LLOYD. Inc. (Pedido de Suministro MWI Veterinaria) </td><td> MWI #: 009307 </td><td> Anased 100 mg / ml </td></tr><tr><td> Salina </td><td> Hospira Inc. </td><td> 94-217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma </td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM (CD31) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td> Vectastain Elite ABC </td><td> Vector Laboratories </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Vector Nova Roja </td><td> Vector Laboratories </td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla de reactivos específicos

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

Crecimiento de la red Microvacular y remodelación son aspectos críticos de la curación de heridas, la inflamación, retinopatía diabética, el crecimiento del tumor y otras condiciones de enfermedad 1, 2. Crecimiento de la red se atribuye comúnmente a la angiogénesis, que se define como el crecimiento de nuevos vasos a partir de vasos preexistentes. El proceso angiogénico está también directamente relacionada con arteriogénesis, definida como la adquisición capilar de un revestimiento de células perivasculares y ampliación del vaso. Huelga decir que, la angiogénesis es complejo e involucra a varios jugadores en el nivel celular y molecular 3. La comprensión de cómo una red microvascular crece es necesario identificar la dinámica espacial y temporal a lo largo de la jerarquía de una red a través de la evolución temporal de la angiogénesis. Esta información es crítica para el desarrollo de terapias dirigidas a manipular el crecimiento de vasos. El modelo de exteriorización se describe en este artículo representa un modelo simple y reproducible para estimularlando la angiogénesis en el mesenterio de rata. Se adaptó a partir de modelos de cicatrización de heridas en la rata mesenterio 4-7, y es una alternativa para estimular la angiogénesis en el mesenterio mediante inyecciones ip de agentes pro-angiogénicos 8, 9. El modelo de exteriorización es atractiva debido a que requiere una intervención quirúrgica mínima y produce un aumento espectacular y reproducibles en los brotes capilares, área vascular y la densidad vascular durante un transcurso de tiempo relativamente corto en un tejido que permite la visualización en dos dimensiones de las redes microvasculares entero a un solo a nivel de célula. El crecimiento estimulado refleja naturales respuestas angiogénicas en un entorno fisiológico sin interferencia de extranjeros moléculas angiogénicas. El uso de métodos de etiquetado de inmunohistoquímica, este modelo se ha demostrado ser extremadamente útil en la identificación de nuevos eventos celulares implicados en la angiogénesis. Los investigadores pueden fácilmente relacionar las métricas angiogénicos durante el curso temporal de la remodelación con el tiempo specific dinámicas, tales como cambios fenotípicos celulares o interacciones celulares 4, 5, 7, 10, 11.

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Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Este artículo describe un modelo simple para estimular la angiogénesis en el mesenterio de rata. El modelo produce aumentos dramáticos en el brote capilar, área vascular y la densidad vascular durante un transcurso de tiempo relativamente corto en un tejido que permite la visualización en la cara de la totalidad de las redes microvasculares hasta el nivel de células individuales.

Rata Exteriorización Mesenterio: un modelo para investigar la dinámica celulares implicados en la angiogénesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K vistas.  Tulane University. Este artículo describe un modelo simple para estimular la angiogénesis en el mesenterio de rata. El modelo produce aumentos dramáticos en el brote capilar, área vascular y la densidad vascular durante un transcurso de tiempo relativamente corto en un tejido que permite la visualización en la cara de la totalidad de las redes microvasculares hasta el nivel de células individuales.

Video: Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes: un modelo in vitro para el estudio de la angiogénesis (Entrevista)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Investigación

Biología

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rata mesenterio ensayo angiogénesis

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un ensayo de explante para evaluar el comportamiento celular del mesénquima craneal

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

Un ensayo biológico simple para la Evaluación de Factores de Crecimiento Endotelial Vascular

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

La Asamblea y la Aplicación de &#39;Shear Anillos&#39;: A Novel endotelial Modelo de Orbital, unidireccional y periódica flujo de fluido y la tensión de cizallamiento

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...