Este trabajo está apoyado en parte por fondos proporcionados por la Universidad de Carolina del Norte en Charlotte, Wachovia fondo base para la excelencia docente, y una subvención de NIGMS (R15GM101571).

1. Preparación LSE <ol><li> Ranas hembra (Xenopus laevis) se inyecta dos veces para la recolección de huevos. La primera inyección (cebado) es 100 U PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) por rana. Las ranas se debe purgar por lo menos dos días antes de la inducción de huevo y por el que se ranas cebados son utilizables para un máximo de dos semanas. Para las ranas primos, inyectar PMSG por vía subcutánea en los sacos linfáticos dorsales usando una jeringa de 3 ml y aguja 27 G. </li><li> Para inducir la puesta de huevos, inyectar 500 U hCG (gonadotropina coriónica humana) por vía subcutánea rana preparado en los sacos linfáticos dorsales usando una aguja de 27 G. Incubar las ranas inyectados en cubos separados que contengan 2 litros de solución modificada 1x Marc Ringer (MMR). Permitir ranas 14-20 horas para poner sus huevos antes de la recolección. </li><li> Retire las ranas de los cubos y vierta la solución MMR hasta alrededor de 100 ml que queda. Obtener huevos de los cubos mediante la transferencia de huevos a un vaso de precipitados de 250 ml. </li><li> Dejelly huevos mediante la adición de 100 ml de 2% de cisteína (ajustarpH a 7,8 con 10 M KOH). Revuelva suavemente los huevos con un vaso invertido pipeta Pasteur (0,7 cm de diámetro) aproximadamente cada 30 segundos. Decantar y reemplazar con cisteína fresco dos veces durante la incubación. El proceso dejellying es completa en aproximadamente 5-15 min cuando los huevos formar una capa más condensada en la parte inferior del vaso de precipitados. </li><li> Deseche la solución de cisteína y lavar tres veces con huevos MMR 0.25x. Swirl los huevos en la solución con una pipeta de vidrio. &quot;Bad&quot; huevos se determinó por inspección visual simple y son &quot;hinchada&quot; blanca en apariencia. Los &quot;malos&quot; huevos se acumularán en el centro del vaso de precipitados después de remolino. Quite &quot;malos&quot; huevos con una pipeta Pasteur. </li><li> Lavar los huevos con Lysis Buffer huevo (ELB) tres veces. Retire todos los adicionales &quot;malos&quot; los huevos con una pipeta Pasteur. Vierta los huevos en un tubo de 14 ml Falcon. </li><li> Haga girar el tubo Falcon de 55 segundos a 188 xg (1.100 rpm) con el CL2 IEC clínica de sobremesa centrífuga con un rotor basculante para compactar los huevos. Eliminar el exceso de tampón de lala parte superior de la capa de huevo. Añada 0,5 l de aprotinina / stock leupeptina y 0,5 l de citocalasina B por ml de stock de huevos compactados. </li><li> Centrifugar los huevos a 16.500 xg (10.000 rpm) durante 15 min a 4 ° C utilizando el RC6 Sorvall más centrífuga superspeed HB6 con rotor basculante. Después de la centrifugación, los huevos son fraccionados en tres capas en el tubo: lípidos, extracto, y la yema / pigmento de arriba a abajo, respectivamente. Perforar la pared del tubo Falcon en la porción inferior de la capa de extracto de media con una aguja de 21 G. Retire con cuidado la aguja cuando la aguja de punción puede ser obstruida por el plástico. Inserte una aguja 21 G unida a una jeringa de 1 ml en el sitio de punción para recoger el extracto. Lentamente aspirar el extracto en la jeringa para evitar burbujas de aire y la contaminación con los lípidos y la yema / pigmento capas. </li><li> Coloque los extractos en un tubo de microcentrífuga refrigerada 1,5 ml. Para cada mililitro de extracto de huevo, añadir las soluciones químicas siguientes valores para el endicated concentración final (mostrado entre paréntesis): (1) 10 cicloheximida l (100 mg / ml); (2) 1 l aprotinina / leupeptina (10 mg / ml cada uno); (3) 1 l citocalasina B (5 mg / ml ); (4) 1 l de ditiotreitol (1 mM), y (5) 0,33 l Nocodazol (3 mg / ml). Invertir el huevo extraer al menos 10 veces suavemente. Este es el LSE, el cual debe ser fresca y utilizarse dentro de 4 hr. La calidad de la LSE está en peligro después de 4 horas o congelación-descongelación. </li></ol> 2. El tratamiento de la cromatina espermática con los criterios que dañan el ADN <ol><li> Preparar cromatina de esperma normal de acuerdo con el método descrito previamente 13. </li><li> Preparar MMS tratado con cromatina espermática <ol><li> Resuspender cromatina espermática normal en 0,5 ml de tampón X. </li><li> Añadir ~ 5,5 l de MMS (9,1 M en stock) a 500 l cromatina resuspendieron a una concentración final de 100 mM. </li><li> Incubar cromatina de los espermatozoides en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente durante 30 min con rotación. </li><li> Haga girar la microcentrifuge tubo a 686 xg (2.100 rpm) durante 10 min a temperatura ambiente usando la centrífuga IEC CL2 clínica con el rotor basculante y adaptadores de tubo. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 0,5 ml de tampón de X plus BSA (3%), DTT (0,1 mM) y aprotinina / leupeptina (10 mg / ml cada uno). </li><li> Repetir los pasos (4) y (5) dos veces para lavar la cromatina de los espermatozoides. </li><li> Determinar la concentración de la cromatina espermática con un hemocitómetro y se diluye hasta 100.000 espermatozoides / l. Ahorra 5 alícuotas a -80 ° C congelador para su uso posterior. </li></ol></li><li> Prepara con tratamiento UV cromatina espermática <ol><li> Añade la cantidad deseada (por ejemplo 10 l) de la cromatina de esperma normal en la superficie de un trozo de Parafilm. </li><li> Coloque el Parafilm en un reticulador UV. Ajuste el parámetro deseado energía, dependiendo de su experiencia, y comienzan a dañar la cromatina de los espermatozoides a través de la luz ultravioleta. Por ejemplo, se tarda aproximadamente 21 segundos para llegar a 1.000 J / m 2. </li><li> Después de UV irramediación, tratada con UV cromatina de los espermatozoides debe ser añadido a los extractos de huevo inmediatamente. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de un daño en el DNA que imita la estructura (AT70) <ol><li> Disolver dos oligonucleótidos sintéticos de poli-(dA) 70 (designada como A70) y poli-70 (dT) (designado como T70) en agua a una concentración de 2 mg / l, respectivamente. </li><li> Añadir 100 l de A70 y 100 l de T70 a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Hervir solución mixta sintético oligo durante 5 min a 95 ° C en un heatblock. </li><li> Tome el bloque baño seco, fuera (con el tubo que contiene el AT mezcla en ella), y deje que se enfríe a temperatura ambiente sobre una mesa de laboratorio. Este ajuste de temperatura tarda alrededor de 45-60 min. </li><li> La mezcla enfriada es AT70 con una concentración final de 2 mg / l. Tienda 10 l de alícuotas AT70 en congelador a -20 ° C para su uso posterior. </li></ol> 4. Activar el Checkpoint Daño del ADN en la cromatina espermática con LSE dañado o un daño del ADNQue imita la estructura <ol><li> Inducir el puesto de control de daños en el ADN en la cromatina LSE con espermatozoides dañados <ol><li> Añadir 50 l de LSE a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y complementarlo con 1 l de mezcla de energía y 2 l de cromatina de los espermatozoides dañados (concentración final ~ 4.000 espermatozoides / l de reacción). </li><li> Incubar el tubo de reacción a temperatura ambiente durante 90 min y la película del tubo cada 10 min. </li><li> Dispensar 1 l de mezcla de reacción en un portaobjetos de microscopio suplementado con 1 l de solución de tinte nuclear después de 30-min de incubación. Colocar un cubreobjetos sobre la mezcla de reacción y comprobar para la formación de núcleos a través de microscopio de fluorescencia. Típicamente, los núcleos redondos se forman después de 30 min de incubación, lo que indica la replicación del ADN se ha iniciado. </li><li> Tomar 10 l de la mezcla de reacción en 90 l de tampón de muestra. Las muestras se analizan mediante inmunotransferencia utilizando anti-Chk1 P-S344 o anticuerpos anti-Chk1. </li></ol></li><li> Inducir el punto de control de daños del ADN en LSE con laAT70 <ol><li> Añadir 50 l de LSE a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml suplementado con 1 l de mezcla de energía y un 1,6 l de acciones Tautomycin. </li><li> Añadir 1,25 l de pre-hechos AT70 (2 g / l) o agua (como control negativo) a cada reacción. Se incuban las reacciones a temperatura ambiente durante 90 min. Flick los tubos de reacción cada 10 min. </li><li> Añadir 10 l de la mezcla de reacción en 90 l de tampón de muestra. Las muestras se examinaron a través de inmunotransferencia utilizando anti-Chk1 P-S344 o anticuerpos anti-Chk1. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos La cromatina de los espermatozoides o estructura de daño en el DNA que imita puede desencadenar el puesto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated en el sistema de extracto de huevo Xenopus. Figura 2A muestra que el MMS Chk1 induce la fosforilación en Ser344 (Chk1 P-S344), que es un indicador de activación de la quinasa ATR. Figura 2B muestra que AT70, como un daño en el DNA que imita estrumagen, también provoca Chk1 fosforilación. Total de muestras de Chk1 se utilizan como controles de carga en ambos ejemplos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagrama de la señalización de punto de control de daño de ADN. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> Figura 2. Chk1 fosforilación es inducida por cualquiera de MMS o AT70 tratamientos en extractos de Xenopus huevo. (A) MMS dañada por el esperma cromatina (MMS) o cromatina de esperma normal (Con) se incuban en extractos de huevos de 90 min. Chk1 fosforilación en Ser344 (Chk1 P-S344) y Chk1 total en los extractos de huevo son examinados por inmunotransferencia. (B) AT70 o agua (Con) se añaden en los extractos de huevo, respectivamente. Las muestras también se analizaron mediante inmunotransferencia como en (A).

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	<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components.">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li><li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR:+an+essential+regulator+of+genome+integrity.">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li><li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts.">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li><li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint.">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li><li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li><li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate.">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li><li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage.">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li><li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts.">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li><li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity.">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li><li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claspin,+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts.">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li><li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling.">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li><li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks.">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li><li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs.">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts.">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hay varias ventajas en el estudio del punto de control de daño en el DNA utilizando extractos de Xenopus huevo. El uso de extractos de huevo proporciona una gran cantidad de extractos libres de células sincronizadas en la interfase del ciclo celular. Los extractos de huevo puede ser realizado fácilmente y económicamente. Es relativamente fácil de dañar el ADN o cromatina y para revelar un defecto en el punto de control de daño de ADN después de immunodepleting una proteína diana a partir de extracto de...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivos </td></tr><tr><td> Anti-P-S344 Chk1 anticuerpos </td><td> Señalización Celular </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Chk1 anticuerpos anti- </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> La aprotinina </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> La cicloheximida </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Citocalasina B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Metanosulfonato de metilo (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazol </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Muestra de tampón </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals EE.UU. </td><td> 209-12041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Cuchara para la puesta de huevos </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 IEC centrífuga con rotor basculante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 rotor basculante </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 más centrifugadora supervelocidad </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> Reticulador UV </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Soluciones </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM de HEPES, ajustar el pH a 7,8 con 10 M NaOH </td></tr><tr><td> La aprotinina / Leupeptina acciones </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml cada una en agua. Almacenar 20 alícuotas a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffer X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M de sacarosa, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, ajustar el pH a 7,5 con HCl </td></tr><tr><td> La cicloheximida acciones </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml en agua. Tienda de 1 ml alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Citocalasina B de stock </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml en DMSO. Almacenar 20 alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) acciones </td><td></td><td></td><td> 1 M en agua. Tienda de 1 ml alícuotas a -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M sacarosa, 1 mM DTT, 50 ug / ml de cicloheximida, 2,5 mM de MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,7 </td></tr><tr><td> Nocodazol acciones </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml en DMSO. Guarde 5 alícuotas a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Mezcla de Energía </td><td></td><td></td><td> 375 mM de fosfato de creatina, 50 mM de ATP, y 25 mM de MgCl 2. Las alícuotas se guardan a -80 ° C. </td></tr><tr><td> Solución de tinte nuclear </td><td></td><td></td><td> 0,4 g / ml Hoechst 33258, glicerol 25%(V / v), en 1x PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin acciones </td><td></td><td></td><td> 100 mM en DMSO. Almacenar 10 alícuotas a -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

study of the dna damage checkpoint using xenopus egg extracts

Sobre una base diaria, las células se someten a una variedad de lesiones endógenas y ambientales. Para combatir estas agresiones, las células han evolucionado checkpoint daño en el DNA de señalización como un mecanismo de vigilancia para detectar daños en el ADN y dirigir la respuesta celular al daño del ADN. Hay varios grupos de proteínas llamadas sensores, transductores y efectores implicados en la señalización de punto de control de daños en el ADN (Figura 1). En esta vía de señalización complejo, ATR (ATM y Rad3 relacionada-) es una de las principales quinasas que pueden responder al daño del ADN y la replicación del estrés. ATR activados pueden fosforilar sus sustratos tales como aguas abajo (quinasa Chk1 Checkpoint 1). En consecuencia, fosforila y activa Chk1 conduce a muchos efectos aguas abajo en el punto de control de daño del ADN incluyendo la detención del ciclo celular, activación de la transcripción, reparación de daños en el ADN, y la apoptosis o senescencia (Figura 1). Cuando el ADN está dañado, no activa los resultados de punto de control de daño del ADN en UNREPdaños al aire y, posteriormente, la inestabilidad genómica. El estudio del puesto de control el daño del ADN aclarará cómo las células mantener la integridad genómica y proporcionar un mejor entendimiento de cómo las enfermedades humanas, tales como el cáncer, desarrollar. Xenopus laevis extractos de huevo se están convirtiendo en un poderoso sistema libre de células modelo de extracto en la investigación puesto de control de daños en el ADN. Baja velocidad extracto (LSE) fue descrito inicialmente por el grupo Masui 1. La adición de cromatina de los espermatozoides demembranated a los resultados de LSE en la formación de núcleos cuando el ADN se replica de manera semiconservativa una vez por ciclo celular. El puesto de control vía de señalización ATR/Chk1-mediated es desencadenada por el estrés o daño en el ADN de replicación 2. Dos métodos se utilizan actualmente para inducir el punto de control de daño en el ADN: los enfoques que dañan el ADN y el ADN que imitan las estructuras de daños-3. Daño del ADN puede ser inducida por la radiación ultravioleta (UV), γ-irradiación, metilo metanonaesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitroquinolina-1-óxido (4-NQO), o afidicolina 3, 4. MMS es un agente alquilante que inhibe la replicación del ADN y activa el punto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated 4-7. Irradiación UV también provoca el daño del ADN 8 ATR/Chk1-dependent puesto de control. El daño en el ADN que imita la estructura AT70 es un complejo de recocido de dos oligonucleótidos poli-(dA) 70 y poli-70 (dT). El sistema AT70 fue desarrollado en el laboratorio Bill Dunphy y es ampliamente utilizada para inducir ATR/Chk1 señalización de punto de control 9-12. Aquí, se describen protocolos (1) para preparar extractos libres de células de huevo (LSE), (2) para el tratamiento de la cromatina de esperma de Xenopus con dos ADN diferentes enfoques dañar (MMS y UV), (3) para preparar el ADN daños que imita la estructura AT70, y (4) para activar el punto de control de daños del ADN ATR/Chk1-mediated en LSE con cromatina de esperma dañado o una estructura que imita a daño en el DNA.

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Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus huevo extracto es un sistema modelo útil para investigar el punto de control de daño en el DNA. Este protocolo es para la preparación de extractos de huevo de Xenopus y reactivos de punto de control de daño de ADN que inducen. Estas técnicas son adaptables a una variedad de enfoques que dañan el ADN en el estudio de la señalización de punto de control de daño de ADN.

Estudio del Checkpoint Daño del ADN utilizando<em&gt; Xenopus</em&gt; Extractos de huevo

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

16.5K vistas.  University of North Carolina at Charlotte. Xenopus huevo extracto es un sistema modelo útil para investigar el punto de control de daño en el DNA. Este protocolo es para la preparación de extractos de huevo de Xenopus y reactivos de punto de control de daño de ADN que inducen. Estas técnicas son adaptables a una variedad de enfoques que dañan el ADN en el estudio de la señalización de punto de control de daño de ADN.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Prueba de sensibilidad visual a la velocidad y dirección del movimiento en lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Investigación

Biología

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

En la Asamblea Vitro nucleares utilizando fraccionado extractos de huevo Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Producción de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Huevos Extrae para identificar los ARN asociada a los microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally scales with the size of the cell, notably during embryogenesis when dramatic reductions in both cell and nuclear sizes occur. Mechanisms of nuclear size regulation are largely unknown and may be relevant to cancer where altered nuclear size is a key diagnostic and prognostic parameter. In vivo approaches to identifying nuclear size regulators are complicated by the essential and complex nature of nuclear function. The in vitro approach described here to study nuclear size control takes advantage of the normal reductions in nuclear size that occur during Xenopus laevis development. First, nuclei are assembled in X. laevis egg extract. Then, these nuclei are isolated and resuspended in cytoplasm from late stage embryos. After a 30 - 90 min incubation period, nuclear surface area decreases by 20 - 60%, providing a useful assay to identify cytoplasmic components present in late stage embryos that contribute to developmental nuclear size scaling. A major advantage of this approach is the relative facility with which the egg and embryo extracts can be biochemically manipulated, allowing for the identification of novel proteins and activities that regulate nuclear size. As with any in vitro approach, validation of results in an in vivo system is important, and microinjection of X. laevis embryos is particularly appropriate for these studies.

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Un ensayo libre de células Utilizando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrión Extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic phenomena, such as cytokinesis, mitotic spindle formation and assembly of the nucleus. Building upon early methods that imaged fixed extracts sampled at sparse time points, recent approaches image live extracts using time-lapse microscopy, revealing more dynamical features with enhanced temporal resolution. These methods usually require sophisticated surface treatments of the imaging vessel. Here we introduce an alternative method for live imaging of egg extracts that require no chemical surface treatment. It is simple to implement and utilizes mass-produced laboratory consumables for imaging. We describe a system that can be used for both wide-field and confocal microscopy. It is designed for imaging extracts in a 2-dimensional (2D) field, but can be easily extended to imaging in 3D. It is well-suited for studying spatial pattern formation within the cytoplasm. With representative data, we demonstrate the typical dynamic organization of microtubules, nuclei and mitochondria in interphase extracts prepared using this method. These image data can provide quantitative information on cytoplasmic dynamics and spatial organization.

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

We describe a method for the preparation and live imaging of undiluted cytoplasmic extracts from Xenopus laevis eggs.

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and concentration of the nanomaterials, the time of exposure, and the exposed cell type. Several established methods have been used to elucidate how endogenous/exogenous agents impact global replication. However, replicon-level assays, such as the DNA fiber assay, are imperative to understand how these agents influence replication initiation, terminations, and replication fork progression. Knowing this allows one to understand better how nanomaterials increase the chances of mutation fixation and genomic instability. We used RAW 264.7 macrophages as model cells to study the replication dynamics under graphene oxide nanoparticle exposure. Here, we demonstrate the basic protocol for the DNA fiber assay, which includes pulse labeling with nucleotide analogs, cell lysis, spreading the pulse-labeled DNA fibers onto slides, fluorescent immunostaining of the nucleotide analogs within the DNA fibers, imaging of the replication intermediates within the DNA fibers using confocal microscopy, and replication intermediate analysis utilizing a computer-assisted scoring and analysis (CASA) software.

The methodology assists in the analysis of variation in DNA replication dynamics in the presence of nanoparticles. Different methodologies can be adopted based on the cytotoxicity level of the material of interest. In addition, a description of the image analysis is provided to help in DNA fiber analysis.

Demostración del ensayo de fibra de ADN para investigar el daño del ADN y la dinámica de reparación inducida por nanopartículas

Nanomaterial exposure can cause replication stress and genomic instability in cells. The degree of instability depends on the chemistry, size, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la interacción y localización de proteínas en el daño del ADN

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Combinación del ensayo de ligando de proximidad con la tinción Gamma-H2AX para caracterizar las interacciones de proteínas en la respuesta al daño

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...