我々は彼らのEMのスキルのために有用な議論のためのパトリックヘイデン（マテック）、そしてロバートスミスとジョージア健康科学大学のリビーペリーに感謝の意を表します。この研究は、DADにNIDCD助成金DC010187によって賄われていた

1。 EpiAirway組織のために生物学的安全キャビネットの準備<ol><li>にバックと手袋縛ら毛で、専用の白衣を着て、層流を開始します。 5分後、片側に（ピペット、チップ、遠心チューブなど）キャビネット内の任意のツールを移動、70％エタノールで生物学的安全キャビネットの内部とサッシをスプレーし、きれいなペーパータオルで拭いてください。 70％エタノールでもう一度洗浄インテリアをスプレーし、乾燥するために残す。クリーン側にツールを移動し、エタノールの手順を繰り返します。 </li><li>キャビネット内のエアロゾルのバリアピペットチップと専用のピペッターを使用してください。個別に包装された滅菌血清学的ピペットを使用するには、廃棄包装の外側を、層流を介して接続されての最後を渡すオープン分割し、キャビネット内にピペットをスライドさせます。 </li><li> EpiAirwayインサートは、滅菌ピンセットで処理する必要があります。場所6インチ精密チップ湾曲した自己シール滅菌袋とオートクレーブに鉗子を解剖。使用可能な状態に少なくとも6一日持つのに十分な準備をします。 </li></ol> 2。 EpiAirway組織の開梱<ol><li> 70％エタノールでバイオセーフティキャビネット内の作業面をスプレーし、きれいなペーパータオルで拭いてください。再びスプレーし、表面が使用前に乾燥させます。 EpiAirwayボックスを開き、発泡スチロールや梱包材を破棄する。 </li><li> EpiAirway抗生物質フリーの保守メディア、AIR - 100 - MM ABF（MM）は、マテック独自のものですとインサート付きキットで送信されます。バイオセーフティキャビネット内で、ラベルメディアのタイプと日付で6滅菌50 mlの遠心チューブ、およびキャップを緩めます。 70％エタノールでメディアのボトルをスプレーし、キャビネット内部に開きます。各チューブに新しい滅菌血清ピペットを用いて各チューブに分注しMM 25mlのは、4℃でキャップ、および店舗を締めます毎日MMの新鮮なアリコートを使用してください。 </li><li>カルシウムとマグネシウムと1の新鮮なボトルXダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D - PBS）を使用して、上記2.2を繰り返します。カルシウムとマグネシウムを含まないD - PBSを用いて再び繰り返す。 4ですべてのアリコート℃にて保存してください。 </li><li> EpiAirwayインサートAIR - 100℃の固体培地含有アガロースの上で4℃、24ウェルプレートに到着、および使用のための6ウェルプレートに配置する必要があります。エタノール耐性マーカーを使用して、日付と説明をそれぞれのプレートにラベルを付けます。各ウェルに4℃EpiAirwayのMMの代わりに1ミリリットル。その包装、70％エタノールでスプレー、およびバイオセーフティキャビネット内の場所から輸送プレートを取り外します。テープを外し、プレートを開きます。オートクレーブ鉗子を使用して、EpiAirwayインサート上の湿ったガーゼを取り除く。 </li><li> 6ウェルプレートのウェルにアガロースからそれを解放を支援するためにねじる運動を用いてオートクレーブピンセットで挿入、および場所をピックアップ。いくつかのアガロースは、トランスポートプレートの温度が周囲に増加し、特にとして、インサートに付着する場合があります。注意深くインサートからアガロースを削除するには、滅菌綿棒を使用してください。メンブレンに触れないようにしてください、と空気の泡が挿入下にトラップされていないことを確認してください。 5％CO 2で加湿37℃のインキュベーター内にプレートを置きます。 </li><li>共培養を開始する前に、インキュベーターで平衡化する組織のための少なくとも24時間を許可する。 </li></ol> 3。 EpiAirway組織のメンテナンス<ol><li>オートクレーブ鉗子を使用して、挿入をピックアップし、優しく組織にカルシウムとマグネシウムを予め温めておいたD - PBSを200マイクロリットルをピペッティングし、挿入を揺らし。角度で挿入を傾けて、挿入物の下部にある膜を保持するプラスチック製のリングと照らし合わせて滅菌P1000のピペットチップを置きます。組織には手を触れないでください。 D - PBSで洗浄し、標識滅菌クライオバイアルに配置吸引除去する。サンプルは-20℃で凍結し、後日ムチンおよび/またはサイトカイン発現についてアッセイされ得る。 </li><li>吸引し、新鮮なMMの1ミリリットルで置き換えることにより、毎日の基礎MMを変更します。各ウェルの新たな障壁のピペットチップを使用してください。一晩10％の漂白剤と使用されているメディアを扱い、廃棄する。 </li></ol> 4。 EpiAirway組織の接種<ol><li>チョコレート寒天培地上に凍結グリセロールストックから分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）の新鮮な培養からストリーク。加湿した5％CO 2インキュベーターで一晩成長する。 </li><li>翌日、約0.7のOD（600 nm）のカルシウムとマグネシウムで予め温めておいたD - PBSでNTHiの単一コロニーを懸濁します。積極的に前に光学密度を測定する渦。 NTHiのmlあたり光学密度の関係は、コロニー形成するユニット（CFU / ml）を0.2のODは、（600 nm）を約1.0 × 10 8 CFU / mlを等しいということです。したがって、0.7のOD（600 nm）は約3.5 × 10 8 CFU / mlである。このアルゴリズムは、接種する前に、各NTHi株に対して検証する必要があります。 </li><li> EpiAirway組織は、AIR - 100は0.6 cm 2および0.4ミクロンの膜の表面積とインサート上で成長されています。組織は、〜1.0 × 10 6〜8.0 × 10 5で構成されている&lt;/&gt;のセルのSup。 12 -このため、1.0 × 10 7 CFUの接種は、約10の感染の多重度に対応しています。接種するために、3.1のように各EpiAirwayインサートを洗い流した後、バイオセーフティキャビネット内の各EpiAirwayインサートの先端面に4.2で調製した細菌懸濁液28マイクロリットルを追加。基礎MMを接種しないでください。インキュベーターに各プレートを返します。 </li></ol> 5。 NTHi接種の定量化<ol><li>消毒に0.1％ゼラチン（PBS - G）、オートクレーブでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を調製します。各チューブに滅菌PBS - Gの接種、アリコート900マイクロリットルのOD（600nmで）に基づいて、目的の1:10希釈液とラベル滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチュー​​ブ。 </li><li>接種NTHiを列挙するために必要なチョコレート寒天プレートの数を決定します。一時間のために上半分で休んでプレートの底に逆さまに空気のインキュベーター内でこれらのプレートを置きます。これは、NTHiのドロップメッキを容易に、37〜暖かい両方にプレート℃、表面が乾燥することができます。 </li><li> 4.2から最初の試験管に細菌懸濁液100マイクロリットルを添加することにより接種のシリアル1:10希釈を開始します。前に次を作る〜5秒間激しくボルテックス各希釈を。各希釈液の半分プレートを使用して、予め温めておいたと表面乾燥チョコレート寒天プレート上に10マイクロリットルのアリコートをドロップします。 5〜6個の10マイクロリットルのアリコートは、一緒に実行せずに各100mmプレートの半分に収まることができます。ときは加湿37の上下を逆に乾燥し、場所℃でCO 2インキュベーターで一晩。 </li><li>翌日、各ドロップ15〜30の別個の植民地を持っている希釈液をカウントし、NTHiの実際の実行可能な接種に戻って計算することによって、CFU / mlを決定する。 </li></ol> 6。 NTHiとの長期共培養<ol><li> 24時間ごとに、3.1のようにインサートを洗う、その後は-20細菌や凍結の同じ系統·今後の分析のための標識クライオバイアルにCを接種されている各組織の洗浄液をプール。これらのサンプルは、ドットブロットまたはELISA法によるサイトカインの発現のためのムチンの存在を検定することができる。また、mRNAおよび定量PCRのために伐採することができる組織は、目的の遺伝子に行うことができます。 3.2のように毎日の基礎MMを変更します。共培養の期間中継続する。 </li></ol> 7。 EpiAirway組織の収穫<ol><li>カルシウムとマグネシウムを含まないD - PBSでサポニンの新鮮な1％の溶液を調製、ろ過滅菌し、37℃に温めて</li><li> 37℃にカルシウムとマグネシウムなしで、MMとD - PBSの別の50 mlチューブを温める</li><li> 5.1のように希釈チューブを準備するだけでなく、インサート番号とNTHi株で標識インサートごとに空の滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチュー​​ブ、。 </li><li> EpiAirwaysが付着し、内面化の両方の生物を含むトータル細胞関連細菌、いずれかの、または唯一の内部化細菌のために収穫することができる。 </li><li>ドロッププレート細胞関連または5.2のように空気インキュベーターで一時間NTHi、ラベルや乾燥を侵略するために必要なチョコレート寒天プレートの数を決定します。 </li><li>総細胞関連細菌を回収するために、カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBSの200マイクロリットルで三回EpiAirwaysの頂端表面を洗い流した後、インサートを傾けて、基底膜から残りのMMをすすぐ。最初の洗浄は、後で分析するために凍結することができます。以下の洗浄を捨てる。 </li><li>新鮮な6ウェルMMなしプレート、および各組織の頂端表面上に7.1から滅菌1％サポニン溶液のピペット250マイクロリットルで洗浄したインサートを配置。 10分間インキュベーターに戻す。 </li><li>インキュベーターから削除、および滅菌P1000ピペットチップを使用して、使用して往復運動、インサートの端から組織を除去するために円を描くように続いて膜から組織をスクラブ。大口径の滅菌P1000のピペットチップを使用して、7.3で作成した空のラベルが付いたチューブにサスペンションを配置。インサートの頂端表面上にカルシウムやマグネシウムを含まないD - PBS 250マイクロリットルを追加。 </li><li>収穫する、残りの組織があるかどうかを判断する倒立位相差顕微鏡を用いてインサートを調べる。必要に応じて、大口径の滅菌P1000のピペットチップを使用して7.8からチューブに、この懸濁液を追加し、別の滅菌P1000ピペットの先端で再びスクラブ。カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBSを用いて1ミリリットルにチューブの合計量をもたらす。 </li><li> 1分間トップスピードで激しくボルテックス細胞懸濁液。 26ゲージの針を備えた滅菌1 mlシリンジを使用して、針を通して注射器に、懸濁液を吸引除去する。ゆっくりと泡を作成しないように注意しながら、針を3回通過サスペンションを渡します。精力的に再び1分間ボルテックス。 </li><li> 7で調製した最初の希釈チューブに大口径のピペットチップ、場所懸濁液100マイクロリットルを使用する。3。 5秒間激しくボルテックスして、シリアル1:10希釈を行います。ドロッププレート表面乾燥チョコレート寒天プレート上に所望の希釈液。 </li><li>のみ内部化された細菌を回収するために、カルシウムまたはマグネシウムなしで、D - PBSを200マイクロリットルを各インサートを3回洗浄。最初の洗浄を保持して凍結する。 100マイクログラム/ mlの最終濃度に予め温めておいたMMに硫酸ゲンタマイシンを追加。収穫されるインサートごとにメディアの1.5 mlを調製。ゲンタマイシン含有MMと基底MMを交換し、頂端表面にゲンタマイシン含有MMの300マイクロリットルを追加。一時間に戻って、CO 2インキュベーターにプレートを置きます。 </li><li>頂端表面からゲンタマイシン含有MMを削除して、カルシウムとマグネシウムなしで予め温めておいたD - PBSでインサートの先端面と基底膜を洗浄。 7.7から7.11のように進んでください。 </li></ol> 8。代表的な結果： NTHiによる5日間共培養した後、（A.）感染していないEpiAirway組織と（B.）組織の走査電子顕微鏡写真を図1に示されています。NTHiによる長期共培養は根尖に重大な損傷が発生しない組織、EpiAirwayモデルの有用性を強調。組織内部の時間の経過とともに定量化内部化された細菌の数を示すグラフを図2に示されています。両方の結果は非常に再現性がある、NTHi宿主-病原体を研究するための人間の上気道のin vitroモデルにおける EpiAirway組織に一貫性と生物学的に関連すること相互作用。 <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。EpiAirway組織の走査型電子顕微鏡。 A.非感染制御の組織。 NTHiと共培養の五日後にB.組織。頂端表面に有意な損傷は、感染した組織で観察されていません。 <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。NTHiの数はEpiAirwayの共培養中に経時的に内面化。株をR2866は、各指定された時点で内部化された細菌のために伐採約1.0 × 10 7 CFU /インサート（0日）、で接種した。バーは、n = 3が、少なくとも二重に複製表します。エラーバーはSDです。

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	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このメソッドは、空気 - 液体界面における原発性ヒト呼吸器組織の生物学的に関連する背景に長期的な宿主 - 病原体相互作用の調査が可能になります。ここでは、感染微生物としてNTHiを使用しましたが、時間をかけて許容細胞毒性を導入しない任意の細菌の相互作用は、この方法で定量することができる。 EpiAirwayモデルはまた、ウイルス、薬物、または化学物質に影響を与える人間の上気?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td>サポニン</td><td>カルビオケム</td><td> 558255 - 25GM </td><td>カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBS中の1％は、滅菌フィルタ</td></tr><tr><td> 1 Xダルベッコのカルシウムとマグネシウムとリン酸緩衝食塩水</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 Xダルベッコのカルシウムまたはマグネシウムなしでリン酸緩衝食塩水</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway抗生物質フリーの組織</td><td>マテック</td><td> AIR - 100 - ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway抗生物質フリーのメンテナンスのメディア</td><td>マテック</td><td> AIR - 100 - MM - ABF </td><td>キットに同梱</td></tr><tr><td> 10Xリン酸緩衝食塩水</td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> 1Xに希釈して使用前に</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td> JTベイカー</td><td> 2124〜01 </td><td> 1 X PBSおよびオートクレーブで0.1％の最終濃度に追加</td></tr><tr><td> Difco社製GCミディアムベース（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> 500ミリリットルのddH 2 O、60℃まで冷却のオートクレーブ36グラム</td></tr><tr><td> BBLヘモグロビン（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> 60〜クールな500ミリリットルのddH 2 Oでオートクレーブ10グラム、° Cと上記のGC培地のベースとミックス</td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleXの濃縮（チョコレート寒天培地） </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> ° Cおよび再水和IsoVitaleX 10mlを追加し、チョコレート寒天プレートに注ぐ55のGC培地のベースとヘモグロビンの混合物を冷却する</td></tr><tr><td>解剖鉗子、先端の細い、湾曲した</td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td>セルフシール滅菌袋</td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン、10 mg / mlの</td><td>ロンザ</td><td> 17 - 519Z </td><td>殺すゲンタマイシン用EpiAirwayのMMに10マイクロリットル/ mlを追加</td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

2、分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）は呼吸器粘膜1の再発や慢性感染症を引き起こす可能性が人間に適応したグラム陰性細菌である。これらの生物が呼吸組織上および内部に生存するメカニズムを研究するために、細菌やヒトの細胞の成功を長期的な共培養を行うことができるモデルが必要となります。我々は、気液界面、EpiAirwayモデル（マテック、アッシュランド、マサチューセッツ州）に上げ、一次ヒト呼吸器上皮組織を使用してください。これらは、タイトジャンクショ​​ン、繊毛とnonciliated細胞、ムチンを産生、および感染症に反応してサイトカインを産生する能力を保持する杯細胞を含む非不死化、高分化型、3次元の組織です。 人間の上気道の in vitroモデルで 、この生物学的に関連は多くの方法で使用することができ、この方法の全体的な目標は、時間をかけてNTHiと定量細胞に関連すると内面化細菌とEpiAirway組織の長期的な共培養を行うことです。 。同様に、共培養感染のムチン産生とサイトカインプロファイルを決定することができます。このアプローチは、多くの現在のプロトコルで、既存の方法を改良したものを長時間3を介して細菌感染をサポートすることができるではないヒト細胞の水中単層またはトランスウェル培養を、使用してください。生物が覆っている媒体に複製することができるたとえば、、これは実験を逮捕、細胞毒性と宿主細胞の損失の許容できないレベルになることがあります。 EpiAirwayモデルは長期的な宿主 - 病原体相互作用の特性評価が可能になります。さらに、EpiAirwayのソースではなく不死のラインよりも、正常なヒト気管気管支細胞であるため、それぞれの構造でと機能4の両方に実際の人間の上気道組織の優れた表現です。 この方法の場合は、EpiAirway組織は、配信前に2日間の抗微生物及び抗真菌化合物の離乳オフ、およびすべてのプロシージャは抗生物質フリーの条件下で行われています。細菌および初代ヒト組織の両方が同一の生物学的安全キャビネット内で使用されている、と長時間共培養しているので、これは、特別な考慮が必要となる。

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

このメソッドは、EpiAirways、気液界面で成長させた初代ヒト呼吸器上皮組織、生物学的に関連するとの共培養の拡張細菌の特性評価を可能に<em&gt; in vitroで</em&gt;モデル。アプローチは、長期の共培養に従順であるすべての微生物を使用することができます。

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K ビュー.  Mercer University School of Medicine. このメソッドは、EpiAirways、気液界面で成長させた初代ヒト呼吸器上皮組織、生物学的に関連するとの共培養の拡張細菌の特性評価を可能に in vitroでモデル。アプローチは、長期の共培養に従順であるすべての微生物を使用することができます。

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A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

免疫・感染学

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. アフルギノーサ 抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Contact-Free Co-Culture Model for the Study of Innate Immune Cell Activation During Respiratory Virus Infection

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The significance of innate immunity signaling in viral infections has increased substantially as patients with respiratory infections who exhibit high innate T cell activation show a better disease outcome. Hence, dissecting these early innate immune interactions allows the elucidation of the processes that govern them and may facilitate the development of potential therapeutic targets and strategies for dampening or even preventing early progression of viral infections. This protocol details a versatile model that can be used to study early crosstalk, interactions, and activation of innate immune cells from factors secreted by virally infected airway epithelial cells. Using an H3N2 influenza virus (A/Aichi/2/1968) as the representative virus model, innate cell activation of co-cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) has been analyzed using flow cytometry to investigate the subsets of cells that are activated by the soluble factors released from the epithelium in response to the viral infection. The results demonstrate the gating strategy for differentiating the subsets of cells and reveal the clear differences between the activated populations of PBMCs and their crosstalk with the control and infected epithelium. The activated subsets can then be further analyzed to determine their functions as well as molecular changes specific to the cells. Findings from such a crosstalk investigation may uncover factors that are important for the activation of vital innate cell populations, which are beneficial in controlling and suppressing the progression of viral infection. Furthermore, these factors can be universally applied to different viral diseases, especially to newly emerging viruses, to dampen the impact of such viruses when they first circulate in na&#239;ve human populations.

This protocol details an investigation of the early interactions between virally infected nasal epithelial cells and innate cell activation. Individual subsets of immune cells can be distinguished based on their activation in response to viral infections. They can then be further investigated to determine their effects on early antiviral responses.

呼吸器ウイルス感染時の自然免疫細胞活性化研究のための非接触共培養モデル

The early interactions between the nasal epithelial layer and the innate immune cells during viral infections remains an under-explored area. The ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic pathogen upon influenza A virus (IAV) infection. Advanced age enhances host susceptibility to secondary pneumococcal pneumonia and is associated with worsened disease outcomes. The host factors driving those processes are not well defined, in part due to a lack of animal models that reproduce the transition from asymptomatic colonization to severe clinical disease. 
This paper describes a novel mouse model that recreates the transition of pneumococci from asymptomatic carriage to disease upon viral infection. In this model, mice are first intranasally inoculated with biofilm-grown pneumococci to establish asymptomatic carriage, followed by IAV infection of both the nasopharynx and lungs. This results in bacterial dissemination to the lungs, pulmonary inflammation, and obvious signs of illness that can progress to lethality. The degree of disease is dependent on the bacterial strain and host factors. 
Importantly, this model reproduces the susceptibility of aging, because compared to young mice, old mice display more severe clinical illness and succumb to disease more frequently. By separating carriage and disease into distinct steps and providing the opportunity to analyze the genetic variants of both the pathogen and the host, this S. pneumoniae/IAV co-infection model permits the detailed examination of the interactions of an important pathobiont with the host at different phases of disease progression. This model can also serve as an important tool for identifying potential therapeutic targets against secondary pneumococcal pneumonia in susceptible hosts.

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

This paper describes a novel mouse model for the transition of pneumococcus from an asymptomatic colonizer to a disease-causing pathogen during viral infection. This model can be readily adapted to study polymicrobial and host-pathogen interactions during the different phases of disease progression and across various hosts.

肺炎 連鎖 球菌のウイルス重感染によるコロニー形成者から病原体への移行に関するマウスモデルが加齢増悪疾患を再現

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

3Dウシ回腸エンテロイド培養からの2D単分子膜の確立

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

著者スポットライト:宿主と病原体の相互作用を研究するための高度なエンテロイドモデル 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

要約

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ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

長期的な慢性

微生物群集を学びます

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

P. アフルギノーサ抗感染性の前臨床評価のための空気・液体界面における気管支上皮細胞とマクロファージの感染3Dコカルチャー

呼吸器ウイルス感染時の自然免疫細胞活性化研究のための非接触共培養モデル

宿主と病原体の相互作用を調するためのハイスループットトランスクリプトーム解析

肺炎連鎖球菌のウイルス重感染によるコロニー形成者から病原体への移行に関するマウスモデルが加齢増悪疾患を再現

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

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ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

長期的な慢性

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肺炎 連鎖 球菌のウイルス重感染によるコロニー形成者から病原体への移行に関するマウスモデルが加齢増悪疾患を再現

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

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