La investigación en el laboratorio de Bragonzi ha sido financiado por la Fundación de Fibrosis Quística italiana (CFaCore) y UE-F7-2009-223670. Parte de este trabajo se llevó a cabo en ALAMBIQUE, un laboratorio de microscopía avanzada, y la histopatología del ratón se llevó a cabo en la Unidad de Anatomía Patológica (Instituto Científico San Raffaele).

1. Las bacterias Preparación para la infección crónica (de tres y dos días antes de Ratón Challenge) <ol><li> Seleccione el P. apropiada cepa aeruginosa a probar. </li><li> Inocular un asa de siembra de P. aeruginosa de un -80 ° C cultivo madre a una placa de agar de soja Trypticase (TSA) y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Elige una sola colonia e inocular en 5 ml de caldo de soja Trypticase (TSB) en un complemento capsulado tubo de 15 ml y se incuba a 37 ° C durante la noche en una incubadora de agitación a 200 rpm. </li></ol> 2. Incorporación de bacterias en perlas de agar para la infección crónica (un día antes de la infección) <ol><li> Tomar una pequeña alícuota de cultivo de una noche de bacterias, diluidas 1:50 en tampón fosfato salino (PBS) y medir la densidad óptica (DO) a 600 nm. </li><li> Diluir el cultivo bacteriano durante la noche mediante la adición de 2 OD en un nuevo tubo a presión con tapa que contenga 20 ml de TSB fresco. </li><li> Incubar a 37 ° C durante aproximadamente 3 -4 h hasta la fase logarítmica en una incubadora de agitación a 200 rpm, hasta que se alcanza un total de 10-15 OD. </li><li> Mientras tanto, preparar el TSA, hecha de TSB con 1,5% de agar, autoclave y equilibrar a 50 ° C en un baño de agua. Equilibre 150 ml de aceite mineral pesado preautoclaved en un matraz Erlenmeyer a 50 ° C en un baño de agua. </li><li> Una vez que P. aeruginosa llega a la fase de registro, recoger las células bacterianas por centrifugación a 2700 xg durante 15 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento bacteriano en 1 ml de PBS estéril y mezclar bien para resuspender completamente el sedimento. </li><li> Mezclar 1 ml de suspensión bacteriana con 9 ml de TSA líquido pre-equilibradas a 50 º C. </li><li> Añadir los 10 ml TSA-p mezcla aeruginosa a aceite mineral pesado (precalentado a 50 ° C) e inmediatamente se agita durante 6 min a temperatura ambiente. La agitación debe producir un vórtice visible en el aceite. </li><li> Enfriar la mezcla a 4 ° C, agitando a la mínima speed durante 35 min (Figura 1). </li><li> Coloque la mezcla de agar-cuentas-petróleo en hielo durante 20 min. </li><li> Transfiera las agar-cuentas en 50 ml tubos Falcon y centrifugar a 2700 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar con precisión el aceite mineral y lavar con PBS estéril seis veces, tal como se describe en el paso 2.11. Después de tres lavados, las perlas pueden ser sedimentan por gravedad en lugar de utilizar la centrífuga. Después del último lavado, volver a suspender las agar-cuentas en ml PBS 20-30. </li><li> Tomar una alícuota de las perlas (aproximadamente 0,5 ml) y asépticamente homogeneizar. </li><li> Tomar 100 l de las perlas homogeneizadas y se diluye en 900 l de PBS estéril. En serie diluir 1:10 a 10 -6. </li><li> Placa de dilución en serie en placas de TSA, incluyendo la muestra sin diluir hasta 10 -6 e incubar las placas a 37 ° C. </li><li> Mida el diámetro del grano usando un microscopio de luz invertido en varios campos. El diámetro del grano debe estar entre 100-200 micras ( <strong&gt; Figura 1). </li><li> Guarde las perlas de la noche a 4 ° C. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig1.jpg" width="500px" /> Figura 1. Descripción general de la preparación y el ratón cuentas infección agar. P. aeruginosa células se resuspenden en 1 ml de PBS y se añadieron a 9 ml de TSA líquido (50 ° C). Esta mezcla se añade a 150 ml de aceite mineral pesado a 50 ° C en un matraz y se agitó a alta velocidad durante 6 min a temperatura ambiente. Cuando el matraz se enfrió a 4 ° C con una agitación lenta durante 35 min, el agar se solidifica la creación de cuentas, y las bacterias presentes en la mezcla están incrustados en las perlas de agar. Se muestra Detalle de una perla de agar que contiene células bacterianas (A). Después de retirar el aceite mineral con varios lavados con PBS estéril, la suspensión de agar-perlas está listo fo la inoculación en los pulmones de los ratones mediante una inyección intratraqueal (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . 3. Ratones Challenge con Agar-cuentas Declaración de Ética: Este protocolo y experimentación siguen las directrices del comité de cuidado de los animales y la ética del Instituto Científico San Raffaele. <ol><li> Contar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en las placas de TSA para determinar el número de CFU / ml en la suspensión de agar-perlas. Diluir el agar-perlas con PBS estéril a 2-4 x 10 7 UFC / ml para llegar a un inóculo óptimo de 1-2 x 10 6 en 50 l. </li><li> Anestesie C57Bl/6NCr (20-22 g, 6-8 semanas de edad) ratones macho con ketamina (50 mg / ml) y xilazina (5 mg / ml) en NaCl al 0,9% administrado en un volumen de 0,002 ml / g de peso corporal por inyección intraperitoneal. NOTA: La anestesia se considera adeqluar cuando el animal se queda quieto en silencio, no responde a los estímulos externos, y tiene corazón constante y la frecuencia respiratoria. </li><li> Coloque el ratón en la posición supina. Desinfectar el pelaje del ratón con etanol al 70%. </li><li> Exponer la tráquea por un corte vertical de la piel y intubar la tráquea con un catéter flexible mm IV estéril, 22 G 0,9 mm x 25, mantener la atención para retirar el estilete mientras se mueve hacia abajo dentro de la tráquea. Inserte el catéter no demasiado profundamente en la tráquea. Pare antes de llegar a la carina (bifurcación). </li><li> Inmediatamente tomar un volumen de 50 l de agar suspensión de cuentas por una jeringa de 1 ml y adjuntarlo al catéter. Empuje suavemente el émbolo de la jeringa, permitiendo que las perlas se pueden implantar en el pulmón. Cerrar la incisión con clips de sutura. </li><li> Colocar el animal sobre una almohadilla caliente hasta que esté completamente despierto. </li></ol> 4. Evaluación Ratones <ol><li> Observar los ratones diariamente para detectar signos clínicos que incluyen la calidad del pelaje, la postura,deambulación, y el estado de hidratación. Vigilar el peso corporal al día. Los ratones que pierden ≥ 20% del peso corporal deben ser sacrificados. </li><li> Siga el punto 5 para la recogida del líquido de lavado broncoalveolar (BAL) y Puntos de 6 o 7 para la recogida de los pulmones y el análisis de UFC totales, el análisis histológico, la respuesta inflamatoria en términos de recuento total y diferencial de células en el BAL, el análisis de citoquinas, y actividad de mieloperoxidasa (MPO). </li></ol> 5. BAL fluido de recogida y análisis <ol><li> La eutanasia a los ratones por inhalación de CO2. </li><li> Coloque el ratón en la posición supina. Desinfectar el pelaje del ratón con etanol al 70%. </li><li> Exponer la tráquea y la caja torácica por un corte vertical de la piel. Exponer los pulmones cortando el diafragma. </li><li> Inserte un hilo de sutura debajo de la tráquea con unas pinzas y intubar la traquea con un flexible 22 g 0,9 mm x 25 mm sonda estéril, IV. Tire de los dos extremos del hilo de sutura para unir el catheter a la tráquea y anudar el hilo alrededor de la tráquea. </li><li> Tome un volumen de 1 ml de RPMI 1640 utilizando una jeringa de 1 ml y adjuntarlo al catéter. Empuje el émbolo de la jeringa para lavar los pulmones e inmediatamente recuperar el líquido, almacenándolo en un tubo de 15 ml. NOTA: Si citoquinas se van a analizar, agregar inhibidores de la proteasa de RPMI 1640. </li><li> Repita este paso tres veces con un total de 3 ml de RPMI. A partir de ahora, almacenar el líquido de BAL en hielo. Ve a paso 6 de la recolección y analizar pulmones. NOTA: Tenga en cuenta que no todo el líquido se va a recibir (2,8 ml máximo). </li><li> Para la cuantificación de las bacterias presentes en el líquido de BAL, muestrear una pequeña alícuota (300 l), en serie diluir 1:10 en PBS estéril, placa en placas de TSA y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Cuente el total de células usando un microscopio óptico de luz invertida diluyendo una alícuota de la BAL fluido 1:2 con solución Tuerk en una cámara de recuento de células Burker. </li><li> Centrifugar la remaining BAL líquido a 330 xg durante 8 minutos a 4 ° C. Tome el sobrenadante para el análisis de citoquinas ELISA, almacenándolo a -80 ° C. Siga los pasos del 5.10 a 5.13 para el recuento celular diferencial por cytospin. </li><li> Si el sedimento es rojo, lisar los eritrocitos resuspendiendo el sedimento en 250-300 l de tampón de lisis de RBC se diluyeron 1:10 en agua destilada ultra pura durante 3 min. Neutralizar con 2 ml de PBS y centrifugar a 330 xg durante 8 min a 4 ° C. </li><li> Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en medio RPMI 10% de suero bovino fetal (FBS). Utilice un volumen que proporcionará 1 x 10 6 células / ml, basado en el recuento total de células. </li><li> Colocar los portaobjetos de microscopio y filtros en las ranuras apropiadas en el citocentrifugado con los filtros de cartón que se enfrenta el centro de la citospina. Pipetear 150 l de cada muestra en los pocillos apropiados de la cytospin y centrifugar en una citocentrífuga a 300 xg durante 5 min. </li><li> Teñir diapositivas por la tinción de Romanowsky utilizando un kit comercial, de acuerdo con la maciones del fabricante y las instrucciones de como se ha descrito anteriormente 12. Siga los pasos del 05.14 a 05.17 para el análisis de la actividad de MPO. </li><li> Centrifugar el volumen restante de BAL a 380 xg durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 250 l de cloruro de hexadeciltrimetilamonio 0,5% en agua destilada ultra pura para lisar las células. La suspensión puede ser congelada a -20 ° C durante varios días antes de realizar el ensayo. </li><li> Centrifugar a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C y utilizar el sobrenadante para realizar el ensayo de MPO en placas de 96 pocillos, la adición de la muestra por duplicado a cada pocillo y si es necesario, también diluciones adecuadas de la muestra. </li><li> Añadir a cada muestra en los pocillos un volumen igual de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) como sustrato para la peroxidasa. Deje que la reacción se lleve a cabo en la oscuridad durante al menos 5 minutos y hasta que no haya un mayor desarrollo en el color. </li><li> Detener la reacción añadiendo 2 MH 2 SO 4 unND medir la DO a 450 nm. El valor de DO será directamente proporcional a la actividad de peroxidasa. </li></ol> 6. La medición de la carga bacteriana en el Análisis de pulmón y de citoquinas <ol><li> Inmediatamente después de la recolección de fluidos BAL, pulmones especiales del ratón, se enjuagan con PBS estéril, lóbulos separados, los pusieron en un tubo de fondo redondo con 2 ml de PBS estéril y se almacenan en hielo. NOTA: Si citoquinas se van a analizar, añadir inhibidores de la proteasa de PBS a los tubos. </li><li> Asépticamente homogeneizar pulmones, tomar una pequeña alícuota (300 l) del homogeneizado, en serie se diluye 1:10 en PBS, placa en placas de TSA y se incuba a 37 ° C durante la noche. Tenga en cuenta que la carga total de bacterias de las vías respiratorias será la suma de las UFC se encuentran en el líquido de BAL y pulmón. </li><li> Centrifugar el homogeneizado restante a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Tome el sobrenadante para el análisis de citoquinas ELISA, y se almacena a -80 ° C. </li></ol> 7. El examen histológico &lt;ol&gt; <li> Realizar el análisis histológico sólo en los pulmones en la que no ha sido cobrado el LBA, para preservar los aspectos y propiedades de pulmón. </li><li> La eutanasia a los ratones por inhalación de CO2. </li><li> Exponer la caja torácica por un corte vertical de la piel, exponer a los pulmones por el corte de la membrana. </li><li> Pulmones Impuestos Especiales, se enjuagan con PBS, se separan los lóbulos, los pusieron en un tubo que contiene formol 5-10 ml 10% tamponada neutra (4% de formaldehído) y se almacena a 4 ° C protegido de la luz. </li><li> Pulmones Insertar en parafina, utilizando procedimientos estándar. </li><li> Cortar 5 micras de espesor secciones usando un microtomo. </li><li> Diapositivas mancha con hematoxilina y eosina y cubren los portaobjetos con un cubreobjetos, de acuerdo con procedimientos estándar. </li><li> Examinar los portaobjetos usando un microscopio de campo claro invertida y adquirir imágenes conectando el microscopio a una cámara. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los pasos críticos en la P. preparación aeruginosa-cuentas y el desafío del ratón se presentan a continuación. La cepa de P. aeruginosa se ​​utiliza para el desafío ratones es crítico. La mortalidad, la infección crónica o aclaramiento pueden diferir significativamente dependiendo de la cepa bacteriana utilizada para el desafío. El P. Se prefirió aeruginosa RP73 cepa clínica sobre la cepa de laboratorio de referencia PAO1 ya que resultó en una mortalidad relativamente baja, las lesiones más graves y mayor infección crónica. Las pruebas de drogas en los estudios preclínicos se debe realizar con P. aeruginosa cepas seleccionadas por su alta eficiencia en el establecimiento de la infección crónica a largo plazo. Esto minimiza el número de ratones que son consistentes con los requisitos de validación científica y el análisis estadístico 10,11. El P. individuo preparaciones de agar-talón aeruginosa varían en tamaño y en UFC / ml. Un undiámetro de 150 micras verage con 2 x 10 7 UFC / ml se considera óptimo. Tamaño del grano se ve afectada por la velocidad de agitación durante la fase de enfriamiento (paso 2.9). Perlas se agitó a la velocidad máxima son pequeñas y esféricas (&lt;50 micras) mientras que los agitada muy lentamente son grandes y amorfa (&gt; 1 mm). Además, cuando la dilución final para el desafío está preparado, cuentas con una baja carga bacteriana puede ser pegajosa mientras que aquellos con alta carga bacteriana se puede diluir en exceso. La inoculación de ratones con perlas pegajosas se asocia con una alta mortalidad debido a los ratones de asfixia pronto después de la exposición, mientras que los granos excesivamente diluidas pueden dar lugar a una ausencia de la infección crónica. El volumen óptimo de la inyección intratraqueal es 50 l pero mayores volúmenes de hasta 100 l puede ser inoculado. Las diferencias en la mortalidad o la infección crónica de los ratones son raramente observadas cuando la dosis inoculada oscila entre 5 x 10 5 y 5 x 10 6 UFC / ratón. CRÉDITOSe medio de crecimiento bacteriano debe ser utilizado para la formación de perlas de agar. En este ejemplo, P. aeruginosa se ​​ha incrustado en TSA; otros periódicos informaron que, Burkholderia cenocepacia se incluyó en agar caldo nutritivo 14,15. Perlas de agar debe proporcionar un ambiente microanaerobic con nutrientes esenciales para la proliferación bacteriana a partir de células individuales de microcolonias 9. Esfuerzo respiratorio difiere dependiendo de la anestesia y de la dosis utilizada, y afecta a la mortalidad después de la cirugía. La ketamina a una dosis de 0,1 mg / g de peso corporal andxylazine a una dosis de 0,01 mg / g de peso corporal son las opciones óptimas. La respiración es normal cuando los ratones están intubados con el catéter y visiblemente menos profunda cuando los ratones se inocularon por P. aeruginosa agar-cuentas. Idealmente, la inyección de P. aeruginosa de agar-perlas deben realizarse lentamente con un volumen óptimo de 50 l. Los mayores volúmenes de hasta 100 l podría dar lugar a una mayor mortalidady mayores dificultades en la recuperación de los ratones. Todos los ratones se infectaron de manera adecuada cuando se enfrentan a la cirugía intratraqueal. El P. agar neumonía crónica inducida talón aeruginosa RP73 indica que en este modelo la infección es pluri-focal y generalmente implica uno o más lóbulos pulmonares sin comprometer todo el pulmón. En consecuencia, la evaluación de la carga bacteriana y la respuesta inflamatoria debe llevarse a cabo en pulmonar total. El análisis de los lóbulos selectivos no produce resultados válidos. Un grupo no infectado de ratones se debe agregar como un control y se compara con ratones infectados para detectar cualquier anormalidad potencial en el reclutamiento de células en el fluido BAL o en la histología del pulmón debido a contaminaciones o error en el procedimiento. Este modelo fue creado en un laboratorio BSL-2 con todo el personal de laboratorio debe estar capacitado en las técnicas apropiadas para la observación del ratón. Los ratones se controlaron dos veces al día para los siguientes parámetros: piloerección, actitud, La locomoción, la respiración, la curiosidad, la secreción nasal, el aseo y la deshidratación. Los ratones que perdieron ≥ 20% del peso corporal y mostraron evidencia de enfermedad clínica severa, como abrigo desaliñado, la inactividad, la pérdida de apetito, falta de locomoción, o la postura dolorosa, fueron sacrificados antes de la finalización del experimento. Los ratones infectados con P. aeruginosa RP73 agar-cuentas mostraron signos más bajos de malestar dentro de los tres días a partir de la infección en comparación con ratones PAO1 infectadas. Después de este punto en el tiempo algunos ratones eliminan las bacterias y otros desarrollaron una infección crónica estable, con una duración de hasta 28 días. Hemos demostrado que el modelo de la infección crónica que proponemos en este trabajo es capaz de inducir una P. estable aeruginosa infección crónica en ratones. Este método ha sido optimizado para estudiar los mecanismos moleculares que subyacen a la virulencia del patógeno y la defensa del huésped 8,9,16 o para pruebas de drogas de moléculas antibacterianas y antiinflamatorias 10,11. Tque la validación preclínica de estos compuestos en modelos animales apropiados es esencial para las intervenciones terapéuticas futuras para las infecciones pulmonares en pacientes con FQ.

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética causada por mutaciones en el quística regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis gen (CFTR). Este gen codifica para un canal de cloruro expresado en la membrana de la mayoría de las células epiteliales. Bronquiectasia, tapones mucosos y parénquima destrucción causada principalmente por infecciones por Pseudomonas aeruginosa conducen progresivamente a la enfermedad pulmonar grave y la mortalidad en la mayoría de los pacientes con FQ 1. Patogénesis CF entendimiento y el desarrollo de nuevas terapias se basan en el modelo animal con rasgos característicos de la CF. Varios ratones, genéticamente modificados para el gen CFTR, se han generado, pero las limitaciones en la capacidad de estas especies de recapitular la enfermedad de pulmón con FQ como-y varias otras anomalías de órganos observados en los pacientes con FQ han sido ampliamente documentado 2. Desarrollo de la infección es uno de los principales retos en modelo animal CF. Las cl literaturatemprano sugiere que una infección crónica que dura más de un mes sólo puede lograrse si los ratones se inocularon con bacterias incrustadas en un agente de inmovilización tales como agar, agarosa, alginato o algas 3-5. Estos agentes de inmovilización proporcionan las condiciones microaeróbica / anaerobias que permiten que las bacterias crezcan en forma de microcolonias, al igual que el crecimiento de la mucosa de los pacientes con FQ 6. Este modelo de la infección crónica conduce a la persistencia de la bacteria en los pulmones y causar inflamación de las vías respiratorias y daños 7. Sin embargo, dependiendo del método utilizado, la cepa bacteriana y la dosis inoculada en los pulmones, el porcentaje de los ratones infectados crónicos y la carga bacteriana recuperado en los pulmones en diferentes puntos de tiempo pueden diferir considerablemente. En particular, el principal desafío para la infección crónica a largo plazo sigue siendo la baja carga bacteriana de P. aeruginosa y el bajo porcentaje de semana ratones infectados después de la exposición, lo que indica thacélulas bacterianas camisetas se borran progresivamente por el anfitrión. Mediante la selección de la P. aeruginosa RP73 cepa clínica de una colección de cepas CF 8 recabamos baja mortalidad, las lesiones más graves, y un alto porcentaje de infección crónica con una carga bacteriana estable hasta un mes en ratones C57Bl/6NCrl. En este trabajo se detalla la metodología para incluir P. aeruginosa en las perlas de agar; hemos ratones infectados por instilación intratraqueal, se mide la carga bacteriana y citoquinas en los pulmones, se recogió el líquido de BAL y realizado el examen histológico. En general, este protocolo ayudará a los investigadores para abordar cuestiones de importancia fundamental en la patogénesis de 8,9 y probando nuevas terapias contra P. aeruginosa infección crónica 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Bacto Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">211823</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Difco Agar, granulated</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">214510</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Heavy mineral oil</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">330760-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">S-(+)-Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">K1884</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine hydrochloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">X1251</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">1 ml syringe 25 G 5/8&#39;&#39;&#160;0.5 x 16 mm</td>
			<td style="width:191px;">PIC</td>
			<td style="width:143px;">3071250300350</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Catheter 22GA 0.9 x 25 mm</td>
			<td style="width:191px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:143px;">381223</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">11152-10</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Scissors, Iris, 11 cm, straight</td>
			<td style="width:191px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:143px;">501758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture clips</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">12040-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Suture thread</td>
			<td style="width:191px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:143px;">18020-40</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Complete protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:191px;">Roche</td>
			<td style="width:143px;">11836145001</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:272px;">Fast-Read 102 Burker disposable chamber</td>
			<td style="width:191px;">Biosigma</td>
			<td style="width:143px;">390497</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Tuerk solution</td>
			<td style="width:191px;">Fluka</td>
			<td style="width:143px;">93770</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:191px;">Biolegend</td>
			<td style="width:143px;">420301</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:143px;">DE14-801F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">EZ cytofunnel</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78710021</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Superfrost ultra plus microscope slides</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">J3800AMNZ</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Diff-Quik Romanowsky staining set</td>
			<td style="width:191px;">Medion Diagnostics</td>
			<td style="width:143px;">130832</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:272px;">Hexadecyltrimethylammonium chloride</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">52366-10G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">96-well EIA/RIA plate</td>
			<td style="width:191px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">3590</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;- tetramethylbenzidine</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T8665-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">320501-1L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">10% neutral buffered formalin</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-01005Q</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Harris haematoxylin non Papanicolau</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M06004</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Eosin plus alcoholic solution</td>
			<td style="width:191px;">Bio-optica</td>
			<td style="width:143px;">05-M11007</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Shaking incubator</td>
			<td style="width:191px;">Amerex Instruments</td>
			<td style="width:143px;">Steady Shake 757</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Water bath</td>
			<td style="width:191px;">Grant</td>
			<td style="width:143px;">SUB14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Precision balance</td>
			<td style="width:191px;">KERN</td>
			<td style="width:143px;">440-47N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:143px;">A78300003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Low Cost Heating Pad</td>
			<td style="width:191px;">2biol</td>
			<td style="width:143px;">LCHP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:272px;">Homogenization probe</td>
			<td rowspan="2" style="width:191px;">Ystral</td>
			<td style="width:143px;">2366931(great)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:143px;">2366925(small)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Inverted optical microscope</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axioplan2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Camera (microscope)</td>
			<td style="width:191px;">Zeiss</td>
			<td style="width:143px;">Axiocam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:272px;">Rotary microtome</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">RM2255</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long term chronic pseudomonas aeruginosa airway infection in mice

Un modelo de ratón de la infección crónica de la vía aérea es un activo clave en la fibrosis quística (FQ) de investigación, aunque hay una serie de preocupaciones con respecto al modelo en sí. Fases tempranas de la inflamación y la infección han sido ampliamente estudiados utilizando el modelo de agar-perlas de ratón Pseudomonas aeruginosa, mientras que sólo pocos informes se han centrado en la infección crónica a largo plazo in vivo. El reto principal para la infección crónica a largo plazo sigue siendo la baja carga bacteriana de P. aeruginosa y el bajo porcentaje de semana ratones infectados después de la exposición, lo que indica que las células bacterianas se borran progresivamente por el anfitrión. En este trabajo se presenta un método para la obtención de la infección crónica eficiente a largo plazo en ratones. Este método se basa en la incorporación de la P. cepas clínicas aeruginosa en el agar-perlas in vitro, seguido de la instilación intratraqueal en ratones C57Bl/6NCrl. Infección pulmonar bilateral se asocia a sevrales medibles de lectura-outs, incluyendo la pérdida de peso, la mortalidad, la infección crónica, y la respuesta inflamatoria. El P. Se prefirió aeruginosa RP73 cepa clínica sobre la cepa de laboratorio de referencia PAO1 ya que resultó en una mortalidad relativamente baja, las lesiones más graves y mayor infección crónica. P. aeruginosa colonización puede persistir en el pulmón durante más de tres meses. Patología pulmonar murino se asemeja a la de los pacientes con FQ con enfermedad pulmonar crónica avanzada. Este modelo murino imita más estrechamente el curso de la enfermedad humana y puede ser utilizado tanto para los estudios sobre la patogénesis y para la evaluación de nuevas terapias.

Cuando el protocolo se hace correctamente, el P. aeruginosa agar-cuentas medirán entre 100-200 micras y pueden ser observados con un microscopio de luz invertida con la pipeta un pequeño volumen de la suspensión de agar-cuentas en una diapositiva. Células bacterianas individuales son visibles en las perlas de agar, como se muestra en detalle en la figura 1. La elección de P. aeruginosa cepa utilizada en la preparación de agar-perlas es crítica. Figura 2 y la Tabla 1 muestran los datos obtenidos después de la infección de ratones con P. cepa de laboratorio de referencia aeruginosa PAO1 comparación con RP73 aislado clínico. La mortalidad, observada en los primeros 3 días de la infección, es baja para ambas cepas, pero mayor para PAO1 (Figuras 2A y 2B). Diferencias considerables en cuanto al porcentaje de infección crónica en los ratones supervivientes se pueden observar entre PAO1 y RP73 ratones expuestos. Whilcorreo a los 3 días después de la infección, los ratones fueron infectados todavía tanto por P. aeruginosa cepas, después de este tiempo-punto algunos ratones eliminan las bacterias y otros desarrollaron una infección crónica estable. A partir de 7 días en adelante el porcentaje de ratones infectados crónicamente se mantuvo estable hasta por 28 días, tanto para las cepas. PAO1 conduce a una infección crónica en un porcentaje de ratones que osciló entre 20 a 27,8% (Figura 2A), mientras que para RP73 el porcentaje era 75 a 87,1% (Figura 2B), lo que indica que el P. aeruginosa cepa clínica fue más eficiente en el establecimiento de una infección crónica en comparación con la cepa de laboratorio PAO1. El número de bacterias en 3 días después de la infección fueron más altos para PAO1 (5 x 10 7 UFC / pulmón) (Figura 2C y la Tabla 1) en comparación con RP73 (1,3 x 10 6 UFC / pulmón) (Figura 2D), a continuación, a partir de 7 días en adelante, cuando se estableció la infección crónica, la carga bacteriana se estabiliza a entre 10 &lt;sup&gt; 4 y 10 5 UFC / pulmón para ambas cepas. Una vez establecida la infección crónica, el número de UFC / pulmón no cambia significativamente a lo largo de un mes. Por otra parte, la carga bacteriana en las vías respiratorias es similar entre los ratones expuestos a diferentes cepas bacterianas 9,13. Otras leer-outs, incluida la respuesta inflamatoria del huésped y la histopatología, se pueden medir en diferentes puntos de tiempo de desafío. Figura 3 muestra la respuesta inflamatoria en términos de reclutamiento de leucocitos en el fluido BAL ratón 7 días a partir del desafío con P. aeruginosa RP73 cepa clínica embebido en agar-cuentas. Ratones infectados-RP73 se compararon con ratones no infectados. Recuento de células diferencial incluido neutrófilos, macrófagos y linfocitos. El número total de células es considerablemente mayor en los ratones infectados por RP73 comparación con los ratones no infectados. Los neutrófilos, en particular, casi completamente ausente en el líquido de BAL de ratones no infectados, fueron los más reprtipo celular esented en ratones infectados-RP73, lo que indica una respuesta considerable por el sistema inmune innata a la infección crónica. El análisis histopatológico de los pulmones de los ratones, con infección crónica por P. aeruginosa RP73, muestra que la infección es pluri-focal. Figuras 4C y 4F muestran un lóbulo que es más complicado que otros lóbulos que no son afectados o marginalmente involucrados (Figuras 4B y 4E). Los granos se pueden observar en luz bronquial y microcolonias de células bacterianas son visibles en los granos (Figuras 4C y 4F). Histopatología de pulmón en las áreas involucradas en la infección mostró lesiones inflamatorias en los bronquios y en el parénquima pulmonar. Los bronquios se llenaron por una inflamación masiva de neutrófilos que rodea las perlas, mientras que el parénquima fue infiltrada por macrófagos, linfocitos y algunos neutrófilos. Histología deun ratón no infectado se usó como un control; tanto parénquima y bronquios estaban claros a partir de células inflamatorias (figuras 4A y 4D). <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Evolución temporal de P. aeruginosa infección crónica con cepa de referencia PAO1 y RP73 cepa clínica. C57BL/6NCrl (20-22 g) ratones machos fueron infectados mediante inyección intratraqueal con 1 a 5 x 10 6 UFC de P. aeruginosa cepa PAO1 (A y C) o RP73 (B y D) incrustados en agar-perlas. Para cada punto de tiempo, histogramas representan el porcentaje de mortalidad inducida por bacteriemia (rojo) y la supervivencia (gris) o el porcentaje de animales que se aclaró la infección (blanco) y aquellos capaces de establecer una infección crónica (verde) (A y B). Los ratones supervivientes fueron sacrificados en los puntos de tiempo indicados, y los pulmones se recogieron, se homogeneizaron y se cultivaron en placas de TSA para determinar la carga bacteriana. Las curvas de crecimiento de cepas PAO1 y RP73 en los pulmones murinos se muestran (C y D). Los puntos representan las mediciones individuales y las líneas horizontales representan los valores medios. La significación estadística mediante la prueba de Fisher se indica: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Tabla 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019table1.jpg" width="500px" /> Tabla 1. Evolución temporal de P. aeruginosala infección crónica por cepa de referencia PAO1 y RP73 cepa clínica. Se muestran los porcentajes de mortalidad y de la infección crónica de ratones y número de UFC por pulmón (mediana) infectados PAO1 y RP73. Los valores se seleccionan a partir de 2-4 experimentos diferentes. II, n. de los ratones agrupados se analizaron para cada condición. La significación estadística mediante la prueba de Fisher se indica: * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019table1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Evaluación de la inflamación en el fluido BAL después de 7 días de la infección crónica con RP73 cepa clínica. (A) El gráfico muestra el contenido del totalleucocitos, neutrófilos y monocitos / macrófagos recuperados en el fluido BAL de ratones RP73 crónicamente infectada después de 7 días de desafío en comparación con ratones no infectados (control). Se representan los valores medios y SEM. (B) En el cuadro de abajo flechas indican los neutrófilos y un macrófago como se ve en un lugar en una diapositiva después cytospin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51019/51019fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51019/51019fig4.jpg" width="500px" /> Figura 4. Tinción con hematoxilina y eosina en cortes histológicos de los pulmones después de 7 días de la infección crónica con RP73 cepa clínica. El panel muestra hematoxilina y eosina tinción de secciones de pulmón de ratones no infectados (A y D) y de los ratones RETOSed con agar-cuentas que contienen RP73 (B, C, E, F). La infección es pluri-focal y generalmente involucra uno o más lóbulos pulmonares (C y F), mientras que los demás no se ven afectados o marginalmente involucrados (B y E). Las flechas indican perlas de agar depositados en la luz bronquial (b). Las líneas (A, B, C) ​​de 250 micras;. Líneas (D, E, F) 100 micras <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51019/51019fig4highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande</a> .

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Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

Se describe el método de agar-perlas para establecer la infección de las vías respiratorias persistente a largo plazo crónica de Pseudomonas aeruginosa en el modelo de ratón.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

long-term-chronic-pseudomonas-aeruginosa-airway-infection-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

22.4K vistas.  San Raffaele Scientific Institute.  Se describe el método de agar-perlas para establecer la infección de las vías respiratorias persistente a largo plazo crónica de Pseudomonas aeruginosa en el modelo de ratón. 

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Los modelos de co-cultivo de Pseudomonas aeruginosa Biofilms Cultivado en las células vivas las vías respiratorias humanas

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Investigación

Inmunología e Infección

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa y Biofilm Saccharomyces cerevisiae en las celdas de flujo

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Cultivo de la Pequeña Colonia Variante de Pseudomonas aeruginosa y Cantidad de su Alginato

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of chronic wound infections in diabetic and hospitalized patients. There is an urgent need for chronic infection models to aid in the investigation of wound pathogenesis and the development of new therapies against this pathogen. Here, we describe a protocol that uses delayed inoculation 24 hours after full-thickness excisional wounding. The infection of the provisional wound matrix present at this time forestalls either rapid clearance or dissemination of infection and instead establishes chronic infection lasting 7&#8211;10 days without the need for implantation of foreign materials or immune suppression. This protocol mimics a typical temporal course of post-operative infection in humans. The use of a luminescent P. aeruginosa strain (PAO1:lux) allows for quantitative daily assessment of bacterial burden for P. aeruginosa wound infections. This novel model may be a useful tool in the investigation of bacterial pathogenesis and the development of new therapies for chronic P. aeruginosa wound infections.

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

We describe a delayed inoculation protocol for generating chronic wound infections in immunocompetent mice.

Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...