ברצוננו להודות פטריק היידן (MatTek) לדיונים מועיל, ורוברט סמית ליבי פרי של גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטת מיומנויות EM שלהם. מחקר זה מומן על ידי מענק NIDCD DC010187 לאבא

1. הכנת ארון biosafety עבור הרקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבוש בחלוק מעבדה ייעודי, עם שיער אסוף וכפפות על, להתחיל את הזרימה למינרית. אחרי 5 דקות, להעביר כל הכלים בארון (pipettors, טיפים, מבחנות צנטריפוגה וכו &#39;) לצד אחד, לרסס את פנים ארון biosafety ואת האבנט עם 70% אתנול ו - לנגב עם נייר סופג נקי. תרסיס לניקוי הפנים שוב עם אתנול 70% ולהשאיר לייבוש. הזזת כלים לצד נקי לחזור על התהליך אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו בתרסיס פיפטה מחסום טיפים pipettors ייעודי בממשלה. כדי להשתמש בנפרד עטופה pipettes סרולוגיות סטרילי, להעביר את סוף מחובר דרך הזרימה למינרית, לפרוץ, והחלק את פיפטה לתוך ארון, משיל מחוץ לאריזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף EpiAirway חייבים להיות מטופלים עם מלקחיים סטרילית. מקום 6 אינץ&#39; קצה עדין מעוקל לנתח מלקחיים לתוך עצמית איטום שקיות העיקור החיטוי. הכינו מספיק כדי לקבל לפחות שישה ליום מוכן לשימוש. </li></ol> 2. לפרוק את הרקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס משטח עבודה הקבינט biosafety עם 70% אתנול ו - לנגב עם נייר סופג נקי. תרסיס שוב לאפשר למשטח להתייבש לפני השימוש. פתח את תיבת EpiAirway ולהיפטר קלקר וחומרי אריזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטיביוטיקה ללא EpiAirway תחזוקה התקשורת, AIR-100-MM ABF (MM), היא קניינית MatTek ונשלח בערכה עם מוסיף את. בשנת הקבינט biosafety, תווית six סטרילי 50 צנטריפוגות צינורות מ&quot;ל עם סוג התקשורת התאריך, לשחרר את כובעי. תרסיס בבקבוק התקשורת עם 70% אתנול ו פתוח בתוך הממשלה. Aliquot 25 מ&quot;ל של MM לתוך צינור אחד בעזרת פיפטה חדש סרולוגיות סטרילי עבור כל צינור, להדק את כובעי, ולאחסן ב 4 ° C. השתמש aliquot טריים של MM בכל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 2.2 לעיל באמצעות בקבוק חדש של 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים (D-PBS) עם סידן ומגנזיום. חזור שוב באמצעות D-PBS ללא סידן ומגנזיום. אחסן את כל aliquots ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף EpiAirway AIR-100 מגיעה צלחת 24 גם בבית 4 ° C על התקשורת המכילים מוצק agarose, ויש להציב לתוך 6 צלחות טוב לשימוש. לייבל כל צלחת עם התאריך ותיאור באמצעות סמן אתנול עמידים. מקום 1 למיליליטר של MM 4 מעלות צלזיוס EpiAirway לבאר כל אחד. הסר את צלחת תחבורה מאריזתו, תרסיס עם אתנול 70%, ואת המקום בממשלה biosafety. הסר את הסרט ולפתוח את הצלחת. בעזרת מלקחיים autoclaved, להסיר את גזה לח במשך מוסיף EpiAirway. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי להכניס עם מלקחיים autoclaved בתנועות פיתול לסייע בשחרור זה מן agarose, ואת המקום לבאר צלחת 6 באר. Agarose חלקם עשויים לדבוק להכניס את, במיוחד את הטמפרטורה של צלחת התחבורה מגביר את הסביבה. השתמש צמר גפן סטרילי עד בזהירות להסיר את agarose מ להכניס את. הימנע מנגיעה הממברנה, ולבדוק שאין בועות אוויר לכודות מתחת מוסיף את. מניחים את הצלחת לתוך humidified 37 ° C חממה עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לפחות 24 שעות הרקמות לאזן בחממה לפני תחילת שיתוף תרבויות. </li></ol> 3. תחזוקה של רקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים autoclaved, להרים בעדינות להכניס פיפטה 200 מיקרוליטר של טרום חימם D-PBS עם סידן ומגנזיום על רקמות ועל הסלע להוסיף. הטה את הכנס בזווית ומקום קצה פיפטה סטרילית שלך P1000 נגד טבעת הפלסטיק שמחזיק את קרום בתחתית להכניס את. אל תיגע רקמות. לשאוב D-PBS לשטוף את המקום cryovial סטרילית שכותרתו. דוגמאות אפשר להקפיא ב -20 ° C ו assayed עבור mucin ו / או ביטוי ציטוקינים במועד מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי יומי על ידי MM הבסיס aspirating והחלפת עם למיליליטר 1 של MM צח. השתמש טיפ חדש פיפטה מכשול גם עבור כל אחד. פנקו את התקשורת בשימוש עם אקונומיקה 10% לילה וזורקים. </li></ol> 4. הרכבה של רקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את תרבות חדשה של nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) ממלאי גליצרול קפוא על אגר שוקולד. לגדול לילה humidified 5% CO 2 באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, resuspend מושבות אחת NTHi מראש חימם D-PBS עם סידן ומגנזיום כדי OD (600 ננומטר) של כ 0.7. וורטקס במרץ לפני מדידת צפיפות אופטית. מערכת היחסים של צפיפות אופטית למושבה יוצרי יחידות מ&quot;ל (CFU / ml) של NTHi היא OD (600 ננומטר) של כ 0.2 שווה 1.0 x 10 8 CFU / ml. לכן, OD (600 ננומטר) של 0.7 כ 3.5 x 10 8 CFU / ml. אלגוריתם זה אמור להיות מאומת עבור כל זן NTHi לפני חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות EpiAirway AIR-100 מגדלים על מוסיף עם פני שטח של 0.6 ס&quot;מ 2 ו קרום 0.4 מיקרון. רקמות מורכבות ~ 8.0 x 10 -5 ~ 1.0 x 10 6 &lt;/ Sup התאים&gt;. לכן, הרכבה של 1.0 x 10 7 CFU מתאים ריבוי של זיהום של כ - 10-12. כדי לחסן, ולשטוף כל להכניס EpiAirway כמו 3.1, ולאחר מכן להוסיף 28 מיקרוליטר של ההשעיה חיידקי שהוכנו 4.2 אל פני השטח של apical להכניס כל EpiAirway בממשלה biosafety. אין לחסן MM הבסיס. חזור לכל צלחת אל האינקובטור. </li></ol> 5. כימות של inoculum NTHi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בופר פוספט (PBS) פתרון עם 0.1% החיטוי ג&#39;לטין, (PBS-G) לעקר. סטרילי לייבל 1.5 מ&quot;ל Eppendorf צינורות עם דילולים 1:10 הרצויה על בסיס OD (600 ננומטר) של inoculum ו aliquot 900 מיקרוליטר של סטרילית PBS-G לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר צלחות אגר שוקולד נדרש למנות את NTHi מחוסן. מקום אלו הצלחות באינקובטור באוויר במהופך עם בתחתית הצלחת מונחת על חצי העליון במשך שעה אחת. זה יאפשר את הצלחת לשני חמים 37 ° C ו משטח יבש, להקל את הירידה-ציפוי של NTHi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את דילולים 1:10 הסידורי של inoculum על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של ההשעיה חיידקי מ -4.2 ל הצינור הראשון. וורטקס דילול כל נמרצות במשך 5 שניות לפני ביצוע הבא. Drop 10 aliquots microliter על גבי צלחות אגר מראש חימם משטח יבש שוקולד, תוך שימוש במחצית צלחת עבור כל דילול. חמישה עד שישה 10 aliquots microliter יכול להתאים על חצי אחד של כל צלחת 100 מ&quot;מ בלי לרוץ יחד. כאשר המקום יבש, במהופך humidified 37 ° C-CO 2 באינקובטור במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לקבוע את CFU / ml על ידי ספירת דילולים כי יש 15-30 מושבות נפרדות טיפה כל חישוב חזרה inoculum קיימא בפועל של NTHi. </li></ol> 6. לטווח ארוך ושיתוף תרבות עם NTHi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל 24 שעות, לשטוף את מוסיף כמו 3.1, אז הבריכה כביסות של כל רקמות כי כבר מחוסן עם זן זהה של חיידקים להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס cryovial שכותרתה לצורך ניתוח עתידי. דגימות אלה יכולים להיות assayed נוכחות של mucin ידי כתמים נקודה או ביטוי של ציטוקינים על ידי ELISA. לחלופין, רקמות ניתן לקצור את ה-mRNA ו qPCR יכול להתבצע על הגנים של עניין. שינוי יומי MM הבסיס כמו 3.2. המשך למשך התרבות המשותפת. </li></ol> 7. קציר של רקמות EpiAirway <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1% טרי saponin ב D-PBS ללא סידן ומגנזיום, מסנן לעקר וחם עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם שפופרת 50 מ&quot;ל של MM ועוד של D-PBS ללא סידן ומגנזיום עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות דילול כמו 5.1, כמו גם אחד ריק סטרילי 1.5 מ&quot;ל צינור Eppendorf לכל הכנס, שכותרתו עם מספר להוסיף מתח NTHi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EpiAirways ניתן לקצור גם עבור תאים הקשורים חיידקים הכולל, הכולל הן אורגניזמים חסיד והפנימו, או חיידקים הפנימו בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר צלחות אגר שוקולד צריך טיפה צלחת התא הקשורים או פלשו NTHi, תווית ויבש למשך שעה אחת באינקובטור אוויר כמו 5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור הכולל תאים הקשורים חיידקים, לשטוף את פני השטח של apical EpiAirways שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום, ואז להטות את הכנס ולשטוף MM כל שנותר קרום הבסיס. לרחוץ את הראשון אפשר להקפיא לניתוח מאוחר יותר; להשליך שוטף הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנס לרחוץ צלחת 6-היטב טריים ללא מ&quot;מ, פיפטה 250 מיקרוליטר של פתרון סטרילי saponin 1% לעומת 7.1 apical על פני השטח של כל רקמות. חזור אל בחממה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מן האינקובטור, ושימוש טיפ סטרילי P1000 פיפטה, לשפשף את הרקמות של הממברנה באמצעות גב ו-תנועה קדימה, ואחריו בתנועה מעגלית כדי להסיר את הרקמות מקצות להכניס את. שימוש גדול נשא קצה פיפטה סטרילית P1000, המקום ההשעיה לתוך הצינור שכותרתו ריק שהוכנו 7.3. הוסף 250 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום על פני השטח של apical להכניס את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הכנס באמצעות מיקרוסקופ הפוכה שלב בניגוד לקבוע אם יש רקמה הנותרים להיות שנקטפו. במידת הצורך, לשפשף שוב עם טיפ נוסף P1000 פיפטה סטרילית, ולאחר מכן להוסיף את ההשעיה על הצינור של 7.8 שימוש גדול נשא קצה פיפטה סטרילית P1000. תביאו את הנפח הכולל של הצינור אל למיליליטר 1 באמצעות D-PBS ללא סידן או מגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת במרץ ההשעיה התא במהירות שיא במשך דקה אחת. באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל סטרילי מצויד במחט 26 מד, לשאוב את ההשעיה לתוך המזרק דרך המחט. לאט לאט להעביר את ההשעיה דרך 3 פעמים מחט, נזהרת שלא ליצור בועות. וורטקס במרץ שוב למשך דקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טיפ גדול נשא פיפטה, במקום 100 מיקרוליטר של ההשעיה לתוך הצינור דילול הראשון הכין ב -7.3. וורטקס בתוקף למשך חמש שניות, ולאחר מכן לבצע דילולים 1:10 סדרתי. Drop-הצלחת דילולים הרצוי על גבי משטח יבש צלחות אגר שוקולד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור חיידקים הפנימו בלבד, לשטוף את כל להכניס 3 פעמים עם 200 מיקרוליטר של D-PBS ללא סידן או מגנזיום. לשמר להקפיא את לשטוף הראשון. הוסף סולפט גנטמיצין מ&quot;מ מראש חימם לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הכן 1.5 מ&quot;ל של התקשורת לכל להכניס להיות שנקטפו. החלף את הבסיס עם MM MM גנטמיצין המכילים, ולהוסיף 300 מיקרוליטר של MM גנטמיצין המכילים על פני השטח apical. מניחים את הצלחת בחזרה CO 2 באינקובטור במשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את MM גנטמיצין המכילים מפני השטח apical לשטוף את פני השטח apical ואת קרום הבסיס של להכניס את נרחב עם טרום חימם D-PBS ללא סידן ומגנזיום. המשך כמו 7.7-7.11. </li></ol> 8. נציג התוצאות: סריקה micrographs אלקטרונים של רקמות (א &#39;) EpiAirway נגוע ו (ב) רקמות אחרי תרבות משותפת של 5 ימים עם NTHi מוצגים באיור 1. לטווח ארוך ושיתוף תרבות עם NTHi לא לגרום נזק משמעותי apical ברקמות, דבר המלמד על התועלת של המודל EpiAirway. גרף המתאר את מספר החיידקים הפנימו לכמת לאורך זמן בתוך רקמות מוצג באיור 2. התוצאות שניהם לשחזור למדי, מה שהופך את הרקמות EpiAirway עקבי ורלוונטי ביולוגית במודל חוץ גופית של דרכי האוויר העליונות האנושית שבה ללמוד NTHi מארח הפתוגן אינטראקציות. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים של רקמות EpiAirway. א בקרה רקמות נגוע. ב רקמות לאחר חמישה ימים של תרבות משותפת עם NTHi. נזק לא משמעותי על פני השטח apical הוא ציין ברקמות נגועות. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. מספר NTHi הפנימו לאורך זמן במהלך התרבות שיתוף EpiAirway. מסננים R2866 היה מחוסן על כ 1.0 x 10 7 CFU / להוסיף (יום 0), שנקטפו ואז לחיידקים הפנימו בכל נקודת זמן המצוין. ברים לייצג n = 3 משכפל לפחות כפולים. ברים שגיאה הם SD.

<ol>
	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטה זו מאפשרת את חקירת לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות רקע רלוונטי מבחינה ביולוגית העיקרי של רקמות הנשימה האנושית ממשק אוויר הנוזל. כאן השתמשנו NTHi כמו הדבקה של האורגניזם, אבל האינטראקציה של חיידק כלשהו שאינו מקובל להציג cytotoxicity לאורך זמן ניתן לכמת בשיטה זו. המודל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> קטלוג # </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Saponin </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25GM </td><td> 1% ב D-PBS ללא סידן או מגנזיום, מסנן לעקר </td></tr><tr><td> 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים או בלי סידן ומגנזיום </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway אנטיביוטי ללא רקמות </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway אנטיביוטי ללא תחזוקה התקשורת </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> מסופק עם ערכת </td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו 10X תמיסת מלח </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> מדולל ל 1X לפני השימוש </td></tr><tr><td> לטין </td><td> JT בייקר </td><td> 2124-01 </td><td> הוסף בריכוז סופי של 0.1% ב 1 X PBS ו החיטוי </td></tr><tr><td> Difco GC מאגר בינוני (אגר שוקולד) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> החיטוי 36 גרם ב 500 מ&quot;ל DDH 2 O קריר עד 60 ° צלזיוס </td></tr><tr><td> BBL המוגלובין (אגר שוקולד) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> החיטוי 10 גרם ב 500 מ&quot;ל DDH 2 O, קריר עד 60 ° צלזיוס ומערבבים עם בסיס בינוני GC לעיל </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX העשרה (אגר שוקולד) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> מצננים את התערובת על בסיס בינוני GC ו המוגלובין עד 55 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 מ&quot;ל של IsoVitaleX rehydrated, יוצקים שוקולד צלחות אגר </td></tr><tr><td> מלקחיים הביתור, עצה טובה, מעוקל </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> עצמית איטום עיקור שקיות </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> סולפט גנטמיצין, 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> הוסף 10 מיקרוליטר / ml כדי MM EpiAirway עבור להרוג גנטמיצין </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) הם המדביקה בני אדם, חיידקים גראם שליליים, שעלולים לגרום לזיהומים חוזרים כרונית של רירית דרכי הנשימה 1, 2. כדי לחקור את המנגנונים שבאמצעותם אורגניזמים אלה לשרוד על ובתוך הרקמות בדרכי הנשימה, מודל שבו מוצלח לטווח ארוך שיתוף התרבות של חיידקים ותאי אדם יכול להתבצע נדרשת. אנו משתמשים העיקרי ברקמות אנושיות אפיתל הנשימה העלה לממשק אוויר נוזלי, מודל EpiAirway (MatTek, אשלנד, MA). אלה שאינם מונצחים היטב הבדיל, 3 מימדי רקמות שמכילות צמתים הדוקים, תאים ריסי ו nonciliated, תאים המייצרים הגביע mucin, ולשמר את היכולת לייצר ציטוקינים בתגובה לזיהום. זה רלוונטי מבחינה ביולוגית במודל חוץ גופית של דרכי האוויר העליונות האנושית ניתן להשתמש במספר דרכים: המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לבצע לטווח ארוך ושיתוף תרבות של רקמות EpiAirway עם NTHi ו לכמת תא הקשורים חיידקים הפנימו לאורך זמן . כמו כן, הייצור mucin את הפרופיל של ציטוקינים הנגוע שיתוף תרבויות ניתן לקבוע. גישה זו משפר עם השיטות הקיימות כי פרוטוקולים רבים כיום להשתמש שקוע monolayer או Transwell תרבויות של תאים אנושיים, אשר אינם מסוגלים לתמוך זיהומים חיידקיים לאורך תקופות ממושכות 3. לדוגמה, אם אורגניזם יכול לשכפל בתקשורת שמעליה, זה יכול לגרום לרמות מקובלות של cytotoxicity ואובדן של תאים המארח, לעצור את הניסוי. המודל EpiAirway מאפשר אפיון של לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות. יתר על כן, מאז המקור EpiAirway הוא אדם נורמלי tracheo-הסימפונות תאים ולא קו הנציח, כל אחד הוא ייצוג מעולה של רקמה אנושית בפועל בדרכי הנשימה העליונות, הן במבנה והן פונקציה 4. בשיטה זו, הרקמות EpiAirway הם להיגמל של תרכובות אנטי מיקרוביאליים ואנטי פטרייתי עבור 2 ימים לפני הלידה, וכל ההליכים מתבצעים תחת אנטיביוטיקה ללא תנאים. זה מחייב שיקולים מיוחדים, שכן הן חיידקים ברקמות אנושיות העיקרי משמשים בממשלה biosafety אותו דבר, הם שיתוף תרבותי במשך תקופות ממושכות.

Watch this Scientific Journal Video about Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions at JoVE.com

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

שיטה זו מאפשרת אפיון של חיידקי המורחבת שיתוף תרבות עם EpiAirways, רקמות אפיתל הנשימה העיקרי האדם גדל ב ממשק אוויר הנוזל, רלוונטית מבחינה ביולוגית<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל. הגישה ניתן להשתמש עם חיידק כלשהו ניתנת לטווח ארוך ושיתוף תרבות.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

use-epiairway-model-for-characterizing-long-term-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Views.  Mercer University School of Medicine. שיטה זו מאפשרת אפיון של חיידקי המורחבת שיתוף תרבות עם EpiAirways, רקמות אפיתל הנשימה העיקרי האדם גדל ב ממשק אוויר הנוזל, רלוונטית מבחינה ביולוגית במבחנה מודל. הגישה ניתן להשתמש עם חיידק כלשהו ניתנת לטווח ארוך ושיתוף תרבות.

Video: Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...