Nous tenons à remercier Patrick Hayden (MatTek) pour des discussions utiles, et Robert Smith et Perry Libby de Géorgie Health Sciences University pour leurs compétences EM. Cette étude a été financée par subventions NIDCD DC010187 à la BDCP

1. Préparer le cabinet de biosécurité pour les tissus EpiAirway <ol><li> Le port d&#39;un sarrau de laboratoire dédié, avec des cheveux attachés en arrière et de gants, démarrer le flux laminaire. Après 5 minutes, déplacez tous les outils dans l&#39;armoire (pipettes, des astuces, des tubes de centrifugation, etc) d&#39;un côté, par pulvérisation à l&#39;intérieur du cabinet de biosécurité et l&#39;écharpe à l&#39;éthanol 70% et essuyer avec des serviettes en papier propre. Vaporiser l&#39;intérieur nettoyé à nouveau avec 70% d&#39;éthanol et laisser sécher. Déplacer les outils pour le côté propre et répétez la procédure d&#39;éthanol. </li><li> Utilisez des aérosols embouts de pipette barrière et pipeteurs dédié dans l&#39;armoire. Pour utiliser emballées individuellement stériles Pipettes sérologiques, passer l&#39;extrémité est obstruée par le biais du flux laminaire, casser, et faites glisser la pipette dans l&#39;armoire, en écartant l&#39;extérieur de l&#39;emballage. </li><li> Les inserts EpiAirway doivent être manipulés avec des pinces stériles. Placer 6 pouces fine pointe courbée dissection forceps dans des sachets de stérilisation auto-obturant et autoclave. Préparer suffit pas d&#39;avoir au moins six par jour prêt à l&#39;emploi. </li></ol> 2. Déballage des tissus EpiAirway <ol><li> Pulvériser la surface de travail dans l&#39;armoire de la biosécurité à l&#39;éthanol 70% et essuyer avec des serviettes en papier propre. Vaporiser à nouveau et laissez sécher la surface avant de l&#39;utiliser. Ouvrez la boîte de EpiAirway et jeter le styromousse et le matériel d&#39;emballage. </li><li> Les médias EpiAirway d&#39;entretien sans antibiotique, AIR-100-MM ABF (MM), est la propriété de MatTek et est envoyé dans le kit avec les inserts. Dans le cabinet de biosécurité, l&#39;étiquette six stérile de 50 ml avec des tubes à centrifuger le type de média et la date, et desserrer les bouchons. Vaporiser la bouteille médias avec 70% d&#39;éthanol et d&#39;ouvrir l&#39;intérieur de l&#39;armoire. Aliquote de 25 ml de MM dans chaque tube en utilisant une nouvelle pipette stérile sérologiques pour chaque tube, serrez les bouchons, et conserver à 4 ° C. Utilisez une autre partie aliquote de MM chaque jour. </li><li> Répétez 2.2 ci-dessus en utilisant une nouvelle bouteille de 1 X Dulbecco tampon phosphate salin (D-PBS) avec le calcium et le magnésium. Répétez à nouveau l&#39;aide du D-PBS sans calcium et le magnésium. Stockez tous aliquotes à 4 ° C. </li><li> Les inserts EpiAirway AIR-100 arrivent dans une plaque de 24 puits à 4 ° C sur des supports solides contenant d&#39;agarose, et doivent être placés dans des plaques 6 puits à l&#39;emploi. Étiquetez chaque assiette avec la date et la description à l&#39;aide d&#39;un marqueur résistant à l&#39;éthanol. Placer 1 millilitre de 4 ° C MM EpiAirway dans chaque puits. Retirer la plaque de transport de son emballage, de pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 70%, et les placer dans l&#39;enceinte de biosécurité. Retirez la bande et ouvrez la plaque. En utilisant des pinces autoclavés, enlever la gaze humide sur les inserts EpiAirway. </li><li> Ramassez un insert avec une pince autoclave utilisant un mouvement de torsion afin d&#39;aider à le libérer de l&#39;agarose, et le placer dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits. Certains d&#39;agarose peuvent adhérer à l&#39;insert, d&#39;autant que la température de la plaque de transport augmente la température ambiante. Utilisez un coton-tige stérile pour retirer soigneusement l&#39;agarose de l&#39;insert. Évitez de toucher la membrane, et vérifier qu&#39;aucune bulle d&#39;air sont piégées sous les inserts. Placer la plaque dans un incubateur humidifié 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Attendre au moins 24 heures pour les tissus de s&#39;équilibrer dans l&#39;incubateur avant de commencer les co-cultures. </li></ol> 3. Entretien des tissus EpiAirway <ol><li> En utilisant des pinces autoclavés, ramasser un insert et délicatement la pipette 200 microlitres de pré-chauffé D-PBS avec du calcium et de magnésium sur le tissu et le rock de l&#39;insert. Inclinez l&#39;insert à un angle et placez votre astuce pipette stérile P1000 contre l&#39;anneau en plastique qui maintient la membrane au fond de l&#39;insert. Ne pas toucher le tissu. Aspirer le D-PBS rincer et placer dans un cryovial étiqueté stérile. Les échantillons peuvent être congelés à -20 ° C et analysés pour la mucine et / ou l&#39;expression des cytokines à une date ultérieure. </li><li> Changer le MM basale quotidiennement par aspiration et le remplacer par 1 millilitre de MM frais. Utiliser un embout de pipette nouvelle barrière pour chaque puits. Traiter les médias utilisés avec l&#39;eau de Javel à 10% durant la nuit et le jeter. </li></ol> 4. L&#39;inoculation de tissus EpiAirway <ol><li> Streak une culture fraîche de Haemophilus influenzae non typables (NTHi) du stock de glycérol gelé sur gélose chocolat. Cultivez la nuit dans un incubateur humidifié à 5% de CO 2. </li><li> Le lendemain, resuspendre colonies isolées de NTHi en pré-chauffée D-PBS avec du calcium et de magnésium pour une DO (600 nm) d&#39;environ 0,7. Vortex vigoureusement avant de mesurer la densité optique. La relation de la densité optique d&#39;unités formant colonie par ml (UFC / ml) de NTHi est que une DO (600 nm) de 0,2 équivaut à environ 1,0 x 10 8 UFC / ml. Par conséquent, une DO (600 nm) de 0,7 est d&#39;environ 3,5 x 10 8 UFC / ml. Cet algorithme doit être validée pour chaque souche NTHi avant l&#39;inoculation. </li><li> Les tissus EpiAirway AIR-100 sont cultivées sur des inserts d&#39;une surface de 0,6 cm 2 et une membrane 0,4 micron. Les tissus sont composés de ~ 8,0 x 10 ~ 5 à 1,0 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; Les cellules. Par conséquent, une inoculation de 1,0 x 10 7 UFC correspond à une multiplicité d&#39;infection d&#39;environ 10 - 12. Pour inoculer, rincer chaque insert EpiAirway comme dans 3.1, puis ajouter 28 microlitres de la suspension bactérienne préparée en 4.2 à la surface apicale de chaque insert EpiAirway dans l&#39;armoire de la biosécurité. Ne pas inoculer le MM basale. Retour chaque plaque à l&#39;incubateur. </li></ol> 5. La quantification de l&#39;inoculum NTHi <ol><li> Préparer un tampon phosphate salin (PBS) avec 0,1% de gélatine (PBS-G), autoclave pour stériliser. Étiquette stérile de 1,5 ml tubes Eppendorf avec les dilutions 1:10 désiré sur la base des DO (600 nm) de l&#39;inoculum et 900 microlitres de l&#39;aliquote de PBS stérile-G dans chaque tube. </li><li> Déterminer le nombre de gélose chocolat nécessaire d&#39;énumérer les NTHi inoculés. Placez ces plaques dans un incubateur à air à l&#39;envers avec la partie inférieure de la plaque posée sur la moitié de la partie supérieure pendant une heure. Cela permettra à la fois à la plaque chaude à 37 ° C et la surface à sécher, ce qui facilite la chute de placage de NTHi. </li><li> Démarrez le dilutions 1:10 de l&#39;inoculum en ajoutant 100 microlitres de la suspension bactérienne de 4,2 au premier tube. Vortex chaque dilution vigoureusement pendant 5 secondes avant de prendre la suivante. Baisse de 10 aliquotes microlitre sur les plaques pré-chauffé et asséchée en surface de gélose chocolat, en utilisant la moitié de la plaque pour chaque dilution. Cinq à six portions de 10 microlitre peuvent tenir sur une moitié de chaque plaque de 100 mm, sans courir ensemble. Une fois sec, placez à l&#39;envers dans une humidifié 37 ° C incubateur à CO 2 pendant la nuit. </li><li> Le lendemain, de déterminer les UFC / ml en comptant les dilutions qui ont de 15 à 30 colonies distinctes dans chaque goutte et en calculant de nouveau à votre inoculum viable réelle de NTHi. </li></ol> 6. À long terme de co-culture avec NTHi <ol><li> Toutes les 24 heures, se laver les inserts comme dans 3.1, la piscine du lavage de chaque tissu qui a été inoculé avec la même souche de bactéries et de les congeler à -20 ° C dans un cryovial étiquetés pour analyse future. Ces échantillons peuvent être analysés pour la présence de mucine par dot blots ou pour l&#39;expression de cytokines par ELISA. Alternativement, les tissus peuvent être récoltées pour l&#39;ARNm et qPCR peut être effectuée sur des gènes d&#39;intérêt. Changer le MM basale quotidienne comme dans 3.2. Continuez pour la durée de la co-culture. </li></ol> 7. La récolte des tissus EpiAirway <ol><li> Préparer une solution fraîche à 1% de saponine dans D-PBS sans calcium et de magnésium, filtre-stériliser et chaude à 37 ° C. </li><li> Chauffer un tube de 50 ml de MM et un autre de la D-PBS sans calcium et de magnésium à 37 ° C. </li><li> Préparer les tubes de dilution en 5.1, ainsi que d&#39;un vide stérile de 1,5 ml par tube Eppendorf insérer, étiqueté avec le numéro d&#39;insérer et de la souche NTHi. </li><li> Le EpiAirways peuvent être récoltées pour soit totale associée aux cellules des bactéries, qui comprend à la fois les organismes adhérents et intériorisé, ou pour les bactéries intériorisées seulement. </li><li> Déterminer le nombre de gélose chocolat nécessaires pour déposer la plaque associée aux cellules ou envahi NTHi, l&#39;étiquette et sec pendant une heure dans un incubateur à air comme dans 5.2. </li><li> Pour la récolte totale associée aux cellules des bactéries, rincer la surface apicale de la EpiAirways trois fois avec 200 microlitres de D-PBS sans calcium ni magnésium, puis inclinez l&#39;insert et rincer toute MM restant de la membrane basale. Le premier lavage peut être congelé pour une analyse ultérieure; jetez les lavages suivants. </li><li> Placer l&#39;insert lavés dans une nouvelle 6-même plaque sans MM, et la pipette 250 microlitres de la solution stérile saponine à 1%, passant de 7,1 sur la surface apicale de chaque tissu. Retour à l&#39;incubateur pendant 10 minutes. </li><li> Retirer de l&#39;incubateur, et en utilisant une pipette stérile, P1000, frottez les tissus de la membrane en utilisant un back-et-vient, suivie par un mouvement circulaire pour enlever le tissu sur les bords de l&#39;insert. L&#39;utilisation d&#39;un gros calibre pointe de pipette stérile P1000, place de la suspension dans le tube vide intitulée préparées en 7.3. Ajouter 250 microlitres de D-PBS sans calcium ni magnésium sur la surface apicale de l&#39;insert. </li><li> Examiner l&#39;insert en utilisant une inversé à contraste de phase microscope afin de déterminer s&#39;il ya un tissu restant à être récoltés. Si nécessaire, frotter à nouveau avec une autre pointe de la pipette stérile, P1000, puis ajoutez cette suspension dans le tube de 7,8 en utilisant une pointe de gros calibre pipette stérile P1000. Porter le volume total du tube à l&#39;aide de 1 millilitre de D-PBS sans calcium ni magnésium. </li><li> Vigoureusement tourbillon de la suspension cellulaire à grande vitesse pendant une minute. En utilisant une seringue de 1 ml stérile munie d&#39;une aiguille de calibre 26, aspirer la suspension dans la seringue dans l&#39;aiguille. Lentement passent la suspension à travers l&#39;aiguille 3 fois, en prenant soin de ne pas créer des bulles. Vortex à nouveau vigoureusement pendant une minute. </li><li> En utilisant une pointe de gros calibre pipette, placer 100 microlitres de la suspension dans le tube de dilution d&#39;abord préparé en 7.3. Vortex vigueur pendant cinq secondes, puis faire dilutions 1:10. Drop-plaques les dilutions désiré sur les plaques de surface séchées gélose chocolat. </li><li> Pour récolter les bactéries ne intériorisé, se laver chaque insert 3 fois avec 200 microlitres de D-PBS sans calcium ni magnésium. Retenir et congeler le premier lavage. Ajouter au sulfate de gentamicine préchauffé MM à une concentration finale de 100 microgrammes / ml. Préparer 1,5 ml de milieu par insert à être récoltés. Remplacer le MM basale avec la gentamicine MM contenant, et ajouter 300 microlitres de la gentamicine contenant mm sur la surface apicale. Placer la plaque arrière dans l&#39;incubateur à CO 2 pendant une heure. </li><li> Retirez la gentamicine MM contenant de la surface apicale et laver la surface apicale et la membrane basale de l&#39;insert intensivement avec préchauffé D-PBS sans calcium et magnésium. Procéder comme dans 7.7 à 7.11. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: Microscopie électronique à balayage de (A.) EpiAirway tissus infectés et (B.) des tissus après 5 jours de co-culture avec NTHi sont présentés dans la figure 1. Long terme de co-culture avec NTHi n&#39;entraîne pas de dommages significatifs à l&#39;apex tissus, en soulignant l&#39;utilité du modèle EpiAirway. Un graphique illustrant le nombre de bactéries intériorisées quantifiés au fil du temps l&#39;intérieur des tissus est montré dans la figure 2. Les deux résultats sont très reproductibles, ce qui rend les tissus EpiAirway une approche cohérente et biologiquement pertinent modèle in vitro de la voie aérienne supérieure humaine dans laquelle l&#39;étude NTHi hôte-pathogène interactions. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Microscopie électronique à balayage des tissus EpiAirway. A. tissus témoins non infectés. Tissu B. après cinq jours de co-culture avec NTHi. Aucun dommage significatif à la surface apicale est observée dans les tissus infectés. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Nombre de NTHi intériorisés au fil du temps au cours EpiAirway co-culture. Strain R2866 a été inoculé à environ 1,0 x 10 7 UFC / insert (jour 0), puis récoltés pour les bactéries intériorisées à chaque point indiqué. Les barres représentent n = 3 répétitions dans au moins double. Les barres d&#39;erreur sont SD.

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	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette méthode permet l&#39;étude de long terme interactions hôte-pathogène dans un contexte biologiquement pertinentes de primaires humains tissus respiratoires à l&#39;interface air-liquide. Ici nous avons utilisé NTHi que l&#39;organisme infectant, mais l&#39;interaction de toute bactérie qui n&#39;introduit pas de cytotoxicité inacceptable au fil du temps peuvent être quantifiés avec cette méthode. Le modèle EpiAirway peut également être utilisé pour l&#39;étude des virus, des drogues ou des produits ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Catalogue # </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> La saponine </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25g </td><td> 1% en D-PBS sans calcium ni magnésium, stériliser par filtration </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco tampon phosphate salin avec du calcium et de magnésium </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco tampon phosphate salin sans calcium ni magnésium </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway sans antibiotique tissus </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> Les médias EpiAirway entretien sans antibiotique </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> Livré avec un kit </td></tr><tr><td> Tampon phosphate 10X solution saline </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> Diluer jusqu&#39;à 1X avant utilisation </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> Ajouter à une concentration finale de 0,1% en 1 x PBS et autoclave </td></tr><tr><td> Base de Difco milieu GC (gélose chocolat) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Autoclaver 36 g dans 500 ml ddH O 2 et refroidir à 60 ° C </td></tr><tr><td> Hémoglobine BBL (gélose chocolat) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> Autoclaver 10 g dans 500 ml ddH O 2, refroidir à 60 ° C et mélanger avec la base de milieu GC-dessus </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX enrichissement (gélose chocolat) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> Refroidir le mélange de la base de milieu GC et de l&#39;hémoglobine à 55 ° C et ajouter 10 ml de IsoVitaleX réhydratés, versez gélose chocolat </td></tr><tr><td> Pince à disséquer, pointe fine, recourbée </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Sachets de stérilisation auto-obturant </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfate de gentamicine, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> Ajouter 10 microlitres / ml à MM EpiAirway pour le tuer gentamicine </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

Haemophilus influenzae non typables (NTHi) sont humains adaptés bactéries Gram-négatives qui peuvent causer des infections récurrentes et chroniques de la muqueuse respiratoire 1, 2. Pour étudier les mécanismes par lesquels ces organismes survivent et à l&#39;intérieur des tissus des voies respiratoires, un modèle dans lequel réussite à long terme de co-culture de bactéries et de cellules humaines peuvent être réalisées est nécessaire. Nous utilisons des primaires respiratoire humain tissus épithéliaux soulevées à l&#39;interface air-liquide, le modèle EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Ce sont des non-immortalisés, bien différencié, 3-dimensionnelle des tissus qui contiennent des jonctions serrées, cellules ciliées et non ciliées, des cellules caliciformes qui produisent la mucine, et conserver la capacité de produire des cytokines en réponse à l&#39;infection. Cette biologiquement pertinentes modèle in vitro de la voie aérienne supérieure humaine peut être utilisée dans un certain nombre de façons, l&#39;objectif global de cette méthode consiste à effectuer à long terme de co-culture de tissus EpiAirway avec NTHi et quantifier les bactéries associées aux cellules et intériorisé au fil du temps . De même, la production de mucine et le profil des cytokines de l&#39;infection co-cultures peuvent être déterminées. Cette approche améliore les méthodes existantes dans ce nombreux protocoles actuels utilisent des cultures monocouches ou submergés Transwell de cellules humaines, qui ne sont pas capables de soutenir les infections bactériennes sur de longues périodes 3. Par exemple, si un organisme peut se répliquer dans les médias sus-jacent, ce qui peut entraîner des niveaux inacceptables de la cytotoxicité et la perte de cellules de l&#39;hôte, en arrêtant l&#39;expérience. Le modèle permet de caractériser EpiAirway long terme interactions hôte-pathogène. En outre, depuis la source de la EpiAirway est normal humaine trachéo-bronchique cellules plutôt que d&#39;une ligne immortalisé, chacun est une excellente représentation de tissus humains réels des voies respiratoires supérieures, tant dans sa structure et dans la fonction 4. Pour cette méthode, les tissus sont EpiAirway sevrés de composés anti-microbiens et anti-fongique pour 2 jours avant la livraison, et toutes les procédures sont exécutées sous antibiotique sans conditions. Cela nécessite des considérations spéciales, puisque les bactéries et les principaux tissus humains sont utilisés dans la même armoire de biosécurité, et sont co-cultivées pendant des périodes prolongées.

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Cette méthode permet la caractérisation des bactéries étendu co-culture avec EpiAirways, des tissus humains primaires épithéliales respiratoires grandi à l&#39;interface air-liquide, une biologiquement pertinentes<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle. L&#39;approche peut être utilisée avec n&#39;importe quel microbe qui se prêtent à long terme de co-culture.

L&#39;utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K vues.  Mercer University School of Medicine. Cette méthode permet la caractérisation des bactéries étendu co-culture avec EpiAirways, des tissus humains primaires épithéliales respiratoires grandi à l'interface air-liquide, une biologiquement pertinentes In vitro Modèle. L'approche peut être utilisée avec n'importe quel microbe qui se prêtent à long terme de co-culture.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

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Immunologie et infection

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Chronique à long terme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infection des voies respiratoires chez les souris

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Utilisation d&#39;<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Pour étudier les interactions de l&#39;autophagie cytosquelette

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modèle de souris transmissible transitoirement IL-8 pour le<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi à long terme des réponses inflammatoires

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

À long terme In Vivo suivi de la dynamique de cellules inflammatoires dans les pupes de la drosophile

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Utilisation complémentaire des techniques microscopiques et de la lecture de fluorescence dans l'étude des interactions Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...