Nuestro protocolo describe el uso de un biosensor de peróxido de hidrógeno en neuronas y larvas cultivadas de pez cebra. Este protocolo ayudará a los investigadores a diseccionar el papel de las especies reactivas de oxígeno en la fisiología normal y la fisiopatología. La principal ventaja de esta técnica es la detección en tiempo real de peróxido de hidrógeno en animales vivos y células cultivadas.
Este método se puede aplicar a otros animales, como el sistema modelo de roedores. Para preparar las cubiertas, utilice cubrebocas limpiadas con ácido almacenadas en etanol al 100%. Use las autocara para quitar un cubrebocas del contenedor de almacenamiento y quema para eliminar el etanol residual.
Seque al aire el cubrebocas por completo colocándolo en un ángulo dentro de un plato de cultivo de 35 milímetros. Prepare Poli-D-Lisina o PDL, o solución de trabajo. Aplique PDL en el centro de cada cubrebocas, evitando la dispersión de la solución a los bordes e incube la PDL durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente.
Asegúrese de que la PDL no se seque. Lave la PDL con 0,5 mililitros de agua estéril y deje que las placas se sequen por completo. Prepare la solución de trabajo de laminina.
Y aplíquelo al centro de cada cubrebocas, asegurándose de evitar la propagación de la solución a los bordes. Incubar las placas a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada durante dos a seis horas, evitar un secado de la solución de laminina. Para realizar una disección embrionaria en células ganglionares de la retina de placa o RGCs, prepare y etiquete cuatro platos de cultivo de tejidos de 35 milímetros y llénelos con cuatro mililitros de etanol al 70%.
Medios uno E2. E2 media dos. Y E2 media tres, el día de la disección.
Mantenga los platos en la nevera. Cuando los embriones de pez cebra son 34 horas después de la fertilización, tomar los platos de cultivo recubiertos con laminina fuera de la incubadora. Y lavar los resbalones de la cubierta tres veces con 0.5 mililitros de PBS 1X.
Después del lavado final, agregue cuatro mililitros de ZFCM+media a cada plato de cultivo. Evite secar la placa. Recupere los platos de cultivo refrigerados preparados y déjelos equilibrar a temperatura ambiente.
Llene de cuatro a seis tubos de PCR con 15 microlitros de ZFCM+media. Recupere embriones de pez cebra de la incubadora y sumerja los embriones en un plato de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contenga etanol al 70% durante 5-10 segundos para esterilizarlo. Usando una transferencia de pipeta, transfiera embriones al medio E2 un plato, que contiene medios E2 estériles para lavar el exceso de etanol.
A continuación, transferir los embriones a la E2 media dos plato y retirar sus coriones con pórceps afilados. Por último, transferir embriones a la E2 media tres platos para realizar disecciones. Usando un par de pórceps finos, coloque y sostenga los embriones anteriores a la yema con uno de los pórceps.
Y retirar la cola posterior al saco vitelino con las otras espas denórpides. Agarra el cuello con las medidas de subad y típate la cabeza para exponer el cerebro y los ojos al medio E2. Con la punta de las fórceps finas, ruede suavemente los ojos de la cabeza mientras sostiene el tejido craneal hacia abajo con un segundo fórceps.
Transfiera cuatro ojos a uno de los tubos previamente preparados que contienen ZFCM+Triturar suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta p20 unas 45 veces para disociar las células. Transfiera el ZFCM+ con las células disociadas al centro de los coverslips. Mantenga los cultivos en la parte superior del banco a 22 grados Centígrados en un estante de espuma de poliestireno para absorber las vibraciones.
El día de la proyección de imagen, revise las células bajo el microscopio para validar el crecimiento de los axones de RGC. Para las imágenes de células vivas, transfiera los cubrebocas del plato de cultivo a una cámara de imágenes de células vivas. Utilice un microscopio invertido equipado con un filtro rojo OG-590 Longpass objetivo DIC y una cámara EMCCD.
Antes de la toma de imágenes, sustituya el zfcm+medium por ZFCM-Después de colocar las células con el objetivo 10X, adquiera imágenes a un aumento de 60X utilizando un objetivo de inmersión en aceite. Utilice un aumento adicional de 1,5X. Primero adquiera imágenes DIC.
A continuación, imagen roGFP2-Orp1, utilizando el conjunto de filtros adecuado. Después de tomar el primer conjunto de imágenes, intercambie medios con medios que contengan diferentes soluciones de tratamiento. Los medios deben cambiarse cada 30 minutos de imágenes para evitar cambios en el pH y la osmolaridad.
Para obtener imágenes in vivo, mantenga embriones post-fertilización de 22 a 24 horas en medios E3, que contengan 0,003% de fenil tiourea sin azul de metileno. Intercambiar medios y retirar los embriones muertos diariamente. A la edad deseada, anestesiar y montar embriones en agarosa al 1% en platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 milímetros.
Los embriones se pueden orientar dorsal, ventral, o lateralmente, dependiendo de la región del interés para la proyección de imagen. Después de que la agarosa se solidifique, llene los platos con medios E3 sin azul de metileno, pero con 0.016% tricaine. Configure el microscopio para la toma de imágenes.
Utilice un microscopio confocal de barrido láser invertido para obtener imágenes de embriones montados en la parte inferior de una gota de agarosa. Excitar roGFP2-Orp1, y adquirir las imágenes correspondientes con los filtros de emisión deseados. Adquiera z-stacks con cinco micro metros de espesor de sección a través de la parte deseada de los embriones.
Después de la toma de imágenes, retire los embriones de la agarosa con pórceps finos y manténgalos en la incubadora y en medios libres de azul de metileno con fenil tiourea hasta la edad deseada. Aquí se muestra una imagen representativa del biosensor de peróxido de hidrógeno y los axones extendidos RGC de pez cebra cultivados. El cuerpo celular, el axón y los conos de crecimiento son claramente visibles en las neuronas individuales.
La adición de peróxido de hidrógeno al medio de cultivo aumenta los valores de relación, mostrando que los cambios en tiempo real se pueden detectar con este sistema. La cuantificación de los niveles de peróxido de hidrógeno se muestra en el panel B.To determinar los niveles de peróxido de hidrógeno en embriones enteros de pez cebra, el ARNm se inyectó durante la etapa de una célula, haciendo que todos los tejidos expresaran el biosensor roGFP2-Orp1. La región de la cabeza de las larvas de pez cebra se muestra en dos puntos de tiempo diferentes, centrándose en los niveles de peróxido de hidrógeno en la retina.
Se midieron los niveles basales de peróxido de hidrógeno en los embriones de pez cebra a los dos días posteriores a la fertilización y cinco días después de la fertilización. A los dos días posteriores a la fertilización, los valores de la relación fueron significativamente más bajos que a los cinco días después de la fertilización. Además, cada animal mostró un nivel diferente de aumento en su contenido de peróxido de hidrógeno retiniano.
El uso de fórceps finos para eliminar los ojos y la disociación suave de los ojos con la pipeta son los pasos más críticos en este procedimiento. Este protocolo puede ser seguido por tratamientos farmacológicos para investigar los factores implicados en la señalización ros.
