Damos las gracias a Melissa Klocke de asistencia preparando la Figura 1 y Ratliff Anna para demostrar el protocolo. Este trabajo fue apoyado por la Corporación de Investigaciones para el Avance de la Ciencia.

1. Microtúbulos delta del ensayo de Soluciones Prepárese con ensayo de deslizamiento. <ol><li> Polimerizar 0,5 mg microtúbulos poco marcados con fluoróforo brillante orgánica 22. La concentración etiqueta de destino es 1 fluoróforo por micrómetro de microtúbulos, o una densidad de etiquetado de aproximadamente 1 por cada 1.500 fluoróforo dímeros de tubulina. Almacenar a temperatura ambiente, protegida de la luz con aluminio, papel de aluminio de hasta dos semanas. </li><li> Purificar biotina-quinesina 21 a aproximadamente 1 mM. Almacenar a -80 ° C en 5 ml de alícuotas para su uso en los experimentos individuales. </li><li> Preparar el tampón de ensayo (AB) de imidiazole 50 mM, 50 mM de cloruro de potasio (KCl), 4 mM de cloruro magnésico (MgCl 2), 2 mM etilenglicol tetraacético (EGTA), pH 6,7. Filtro estéril y se almacena a 4 ° C. </li><li> Disolver albúmina de suero bovino biotinilada (biotina-BSA) a 2 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras.Almacenar a -80 ° C en 100 ml de alícuotas durante largos períodos, a 4 º C hasta por un mes. </li><li> Disolver estreptavidina (SA) a 10 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en alícuotas de 20 l durante largos períodos de tiempo, a 4 ° C durante hasta dos semanas. </li><li> Disolver α-caseína a 5 mg / ml en AB. Filtrar con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en 100 ml de alícuotas durante largos períodos, a 4 ° C durante hasta dos semanas. </li><li> Disolver ditiotreitol (DTT) en agua desionizada a 200 mM. Almacenar a -20 ° C en 100 ml de alícuotas, utilizar antes de 8 horas de descongelación. Se puede volver a congelar. </li><li> Disolver paclitaxel (PT) en grado HPLC-dimetil sulfóxido (DMSO) a 4 mM. Almacenar en 10 ml de alícuotas a -80 º C a largo plazo, -20 ° C a corto plazo. Usar dentro de las 8 horas de descongelación. Se puede volver a congelar. </li><li> Disolver la glucosa en agua desionizada a 120 mg / ml. Almacenar en 100 ml de alícuotas a -20 ° C. Se puede volver a congelar. </li><li> Disresolver el trifosfato de adenosina (ATP) en agua desionizada a 150 mM, pH 7,0. Tienda en 5 alícuotas a -80 ° C, utilizar antes de 8 horas de descongelación. </li><li> Preparar 100x acciones de captación de oxígeno 25 mediante la disolución de 10.000 unidades de glucosa oxidasa y catalasa 156.000 unidades en 600 l tampón de ensayo total. Centrifugar brevemente en una microcentrífuga para sedimentar los sólidos; sobrenadante filtro con filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -80 ° C en alícuotas de 10 l durante largos períodos de tiempo, a 4 º C durante hasta una semana. </li></ol> 2. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos, Preparación misma solución de Día Preparar las soluciones en 2.1-2.6 en el día del experimento. Con la práctica, las soluciones de 2.2-2.6 se pueden preparar durante el lavado de celda de flujo. A menos que se indique lo contrario, mantener soluciones madre en hielo. <ol><li> Preparar AB, 1 ml de tampón de ensayo con 10 l de DTT de stock (AB con 2 mM DTT). Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar bio-tampón BSA, 40 y mu; L de una mezcla 1:1 de la población de biotina-BSA y AB. Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampón de BSA, la mezcla de 645 l de AB con 5,5 l de BSA (1 mg / ml de BSA en AB). Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampón SA, mezclar 57 l de AB con 3 l de stock estreptavidina (0,5 mg / ml de estreptavidina en AB). Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar α-caseína tampón, mezclando 200 l de tampón BSA, 50 l de stock caseína, y 0,8 l de ATP mu M 15 (1 mg / ml de α-caseína, 0,8 mg / ml de BSA, 50 nM ATP en AB). Conservar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar fluorescencia anti-cloro tampón, mezclar 95 l α-caseína tampón, 2,5 stock de glucosa l, 1 l mezcla oxígeno 100x compactación, 1 stock de paclitaxel l, 1 l de 2-mercaptoetanol (βME). Añadir βME bajo campana de humos. Utilice fluorescencia anti-blanqueo tampón dentro de 1 hora de preparación PRECAUCIÓN:. ΒME es altamente tóxico y huele horrible. Asegúrese de abrir sólo en la campana de humos. Tienda botella en laausencia de luz, la luz degrada βME y su capacidad para reducir photobleaching. </li></ol> 3. Ensayo de deslizamiento de microtúbulos <ol><li> Construir sobre cuatro carriles de flujo entre un cubreobjetos de 24 x 60 mm y 22 x 22 mm cubreobjetos utilizando grasa de vacío, extruidos de una jeringa a través de una punta de pipeta, como un espaciador. Cada carril de flujo debe ser de aproximadamente 10 l en volumen (escala volúmenes subsiguientes). </li><li> Lavar 10 l de bio-tampón BSA en cada carril. Incubar 5 min para permitir la BSA para revestir las superficies de vidrio. </li><li> Lavar cada carril tres veces con 15 l tampón de BSA para eliminar libre biotina-BSA, mientras que continúa para bloquear la superficie de deslizamiento. Utilice un Kimwipe o papel de filtro para eliminar el tampón desde el lado opuesto de la cámara de flujo, asegurándose de no permitir que las burbujas de aire que pasar por la cámara de flujo. </li><li> Lávese 15 l SA-buffer en cada carril. Esperar 10 min, o hasta 2 hr. La estreptavidina se une a la superficie unida a biotina-BSA. </li><li> Lavar cada carril tres veces con 15 l tampón de BSA para eliminar libre SA mientras que continúa para bloquear la superficie de deslizamiento. </li><li> Lavar cada carril con 15 l α-caseína tampón. α-caseína ayuda adicional bloquear la unión no específica de kinesin y los microtúbulos en el cristal. </li><li> Diluir kinesin a 10 nM en tampón de α-caseína y lavar cada carril con 15 l de esta kinesin - α-caseína solución. Esperar 15 min (o hasta una hora) para la quinesina biotinilada para unirse específicamente a la estreptavidina unida a la superficie. Los dominios kinesin motor seguirá siendo gratuito a los microtúbulos se unen. </li><li> Diluir paclitaxel a 40 micras a temperatura ambiente α-caseína de amortiguamiento, y lave cada carril con 15 l de esta solución para lavar kinesin libre y para precargar cada cámara de flujo con una solución de paclitaxel de microtúbulos para prevenir la despolimerización. Fría también despolimeriza microtúbulos, así que asegúrese de estas medidas se producen a temperatura ambiente con habitación temre soluciones. </li><li> Diluir la etiqueta fluorescente microtúbulos 1:100-1:1,000 de la fluorescencia anti-blanqueo tampón con 1 mM ATP. Lavar 15 l en un carril y observar dentro de 30 min. </li></ol> 4. Recopilación de datos <ol><li> Observe el deslizamiento microtúbulos mediante microscopía de fluorescencia, un microscopio capaz de resolver los fluoróforos individuales, tales como una configuración de TIRF comercial o doméstica de aumento se requiere 26 (Figura 2). Los microtúbulos debe ser propulsado por los motores de quinesina sobre el sustrato a aproximadamente 0,5 m / s, dependiendo de la temperatura. Si el campo de visión del microscopio es de 50 micras, los microtúbulos individuales debe ser visible para aproximadamente 100 seg. Establecer la intensidad de iluminación de manera que los fluoróforos individuales no fotoblanqueador más rápidamente que 100 seg. Si se utiliza láser de excitación, un ajuste de potencia de aproximadamente 3-5 mW es apropiado. </li><li> Recoger secuencias de imágenes para el análisis. 600 imágenes en5 Hz (2 en total min) funciona bien. Usar secuencias tiempo suficiente que los microtúbulos atravesar todo el campo de visión. </li></ol> 5. Análisis de Datos Una rutina de IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , se adjunta. Esta rutina devuelve un valor de longitud de persistencia basado en toda deslizamiento microtúbulos en una secuencia de imagen dada. O utilizar esta rutina en cada secuencia de imágenes, modificar parámetros de intensidad en función de la configuración del microscopio especial, o haga lo siguiente: <ol><li> El seguimiento de cada fluoróforo unido a un microtúbulo para crear trayectorias de fluoróforo. </li><li> Combinar todas las trayectorias de fluoróforos sobre un microtúbulo determinado en una trayectoria de microtúbulos en general, repetir para cada uno de los microtúbulos en la secuencia de imágenes (Figura 3). </li><li> Calcular el ángulo tangente a cada punto a lo largo de la trayectoria (Figura 4)Y calcular &lt;cos θ s&gt; en la ecuación. 1 promediando el coseno de la diferencia de ángulo para cada par de puntos separados por una longitud de recorrido s (Figura 5). Halla la longitud de persistencia para un microtúbulo o grupo de microtúbulos por &lt;cos ajuste θ s&gt; a la ecuación. 1, la ponderación de los puntos de datos individuales en el ajuste por el número de valores independientes de cos θ s que se utilizan para calcular el promedio. </li></ol>

<ol>
	<li>Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+microtubules.">Mechanics of microtubules.</a> Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).</li><li>Pampaloni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+fluctuations+of+grafted+microtubules+provide+evidence+of+a+length-dependent+persistence+length.">Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).</li><li>Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+depart+from+the+wormlike+chain+model.">Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model.</a> Physical review letters. 100, 028102 (2008).</li><li>Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+curvatures+under+perpendicular+electric+forces+reveal+a+low+persistence+length.">Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length.</a> Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).</li><li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape.">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).</li><li>Brangwynne, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+dynamics+of+fluctuating+biopolymers+probed+by+automated+high-resolution+filament+tracking.">Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking.</a> Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).</li><li>Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XMAP215+is+a+long+thin+molecule+that+does+not+increase+microtubule+stiffness.">XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness.</a> Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).</li><li>Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+methods+for+the+robust+measurement+of+the+flexural+rigidity+of+biopolymers.">Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers.</a> Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).</li><li>van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+single+protein+polymers+to+measure+flexural+rigidity.">Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity.</a> Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).</li><li>Hua, W., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+inchworm+and+hand-over-hand+processive+kinesin+movement+by+neck+rotation+measurements.">Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements.</a> Science. 295, 844-848 (2002).</li><li>Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Gliding+assays"+for+motor+proteins:+A+theoretical+analysis.">"Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis.</a> Physical review letters. 74, 330-333 (1995).</li><li>Mehrbod, M., Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+significance+of+microtubule+flexural+behavior+in+cytoskeletal+mechanics.">On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics.</a> PLoS one. 6, e25627 (2011).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+changes+in+actin+and+microtubules+underlie+the+developing+surface+mechanical+properties+of+sensory+and+supporting+cells+in+the+mouse+cochlea.">Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea.</a> Development. 139, 2187-2197 (2012).</li><li>Gal, N., Weihs, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Mechanics+and+Activity+of+Breast+Cancer+Cells+Correlate+with+Metastatic+Potential.">Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential.</a> Cell biochemistry and biophysics. , (2012).</li><li>Volokh, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+tensegrity+in+cell+mechanics.">On tensegrity in cell mechanics.</a> Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).</li><li>Kasas, S., Dietler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+measuring+microtubule+stiffness.">Techniques for measuring microtubule stiffness.</a> Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).</li><li>Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+individual+microtubules+measured+by+a+buckling+force+with+optical+traps.">Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps.</a> Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).</li><li>Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+microtubule+rigidity+using+hydrodynamic+flow+and+thermal+fluctuations.">Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations.</a> Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).</li><li>van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+length+measurements+from+stochastic+single-microtubule+trajectories.">Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories.</a> Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).</li><li>Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical biology of the cell. , (2008).</li><li>Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+a+single-headed+kinesin+to+track+parallel+to+microtubule+protofilaments.">Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments.</a> Nature. 373, 718-721 (1995).</li><li>Anderson, E. K., Martin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+GTP+analog+as+a+specific,+high-precision+label+of+microtubules.">A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules.</a> Biotechniques. 51, 43-48 (2011).</li><li>Hyman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+modified+tubulins.">Preparation of modified tubulins.</a> Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).</li><li>Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curve+reconstruction+from+unorganized+points.">Curve reconstruction from unorganized points.</a> Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).</li><li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+walks+hand-over-hand:+Single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization.">Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li><li>Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence.">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).</li><li>Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+single-molecule+localization+that+achieves+theoretically+minimum+uncertainty.">Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty.</a> Nature Methods. 7, 373-375 (2010).</li><li>Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum-dot-assisted+characterization+of+microtubule+rotations+during+cargo+transport.">Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport.</a> Nature. 3, 552-556 (2008).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Mediciones Longitud persistencia son una buena caracterización de las propiedades mecánicas de biopolímeros individuales. En este artículo, hemos descrito un método de medición de la longitud de persistencia de los microtúbulos. Como se ha señalado en la introducción, este método se extiende fácilmente a examinar las propiedades mecánicas de microtúbulos en una variedad de condiciones, simplemente variando los reactivos, la temperatura o viscosidad en la etapa final del ensayo de deslizamiento, 3,9, o por p...

El citoesqueleto, una red de biopolímeros se encuentran en la mayoría de las células eucariotas, desempeña un papel en la organización celular, el transporte intracelular, y la mecánica celular. Las características mecánicas de los biopolímeros del citoesqueleto (principalmente actina y microtúbulos) desempeñan un papel importante en la determinación de las características mecánicas de la célula como un todo 12. Puesto que la mecánica de células enteras puede caracterizar células sanas y enfermas 13,14 y está implicado en la motilidad celular 15, las propiedades mecánicas de los componentes del citoesqueleto subyacentes han sido un área activa de estudio para las dos últimas décadas 1. La flexibilidad (o rigidez) de los biopolímeros se caracteriza por la persistencia de longitud, la longitud de polímero que se dobla por aproximadamente un radián menores fluctuaciones térmicas a temperatura ambiente. Una serie de técnicas han sido desarrolladas para medir la longitud de persistencia 16, para example activos técnicas que implican doblar el polímero utilizando flujo hidrodinámico, trampas ópticas, o campos eléctricos 4,17,18, y técnicas pasivas que miden las fluctuaciones de polímeros libres en solución 5,6. Las mediciones activos, sin embargo, requieren configuraciones especiales para aplicar fuerzas conocidas en la escala del micrómetro, y las mediciones de libre fluctuación puede ser difícil debido a la difusión fuera del plano de foco del microscopio utilizado. En este artículo, se describe un complementaria, técnica pasiva, para medir la longitud de persistencia de los microtúbulos, un polímero citoesquelético. La técnica consiste en ensayos de deslizamiento, que aseguran que el polímero permanece siempre en el plano focal 19. Por otra parte, implica el seguimiento fluoróforos individuales unidos permanentemente al polímero de interés, de modo que los lugares específicos a lo largo del polímero están bien caracterizados. Una caricatura del método se muestra en la Figure 1. Kinesin mueve específicamente hacia el extremo + de microtúbulos, por lo que los microtúbulos en un ensayo de deslizamiento son impulsados ​​unidireccionalmente. El extremo delantero de los microtúbulos, más allá de la quinesina último unido, es libre de fluctuar bajo las fuerzas térmicas de la solución circundante. Como los microtúbulos es propulsado hacia adelante, el extremo fluctúa hasta la unión a una molécula de quinesina nuevo aún más a lo largo de la lámina de vidrio se congela en una fluctuación dada. Debido a kinesin concede microtúbulos muy fuertemente, los microtúbulos se ve obligado a seguir el camino del extremo delantero. Por lo tanto, las fluctuaciones estadísticas congelados en la trayectoria de microtúbulos son las mismas que las fluctuaciones estadísticas del extremo libre 11 de los microtúbulos, y por lo tanto se puede utilizar para calcular la longitud de persistencia de acuerdo con 20 <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; donde p es l la longitud de persistencia de los microtúbulos, s θ es el ángulo entre las tangentes a la trayectoria separados por una longitud de contorno s, y &lt;&gt; denota un promedio sobre todos los pares de posiciones separadas por una longitud de contorno s. El ensayo de deslizamiento misma utiliza kinesin biotinilado en el enrollado de la bobina 21 se unía específicamente a la placa de vidrio mediante un enlace estreptavidina-biotina. Esta unión se asegura de que los dominios de motor son libres para unirse a microtúbulos y propulsar. Con el fin de seguir la trayectoria de microtúbulos, los microtúbulos están escasamente etiquetados con fluoróforos orgánicos 22,23 - las etiquetas deberán ser lo suficientemente escasa que fluoróforos individuales se pueden resolver utilizando microscopía de fluorescencia de una sola molécula. Fluoróforos individuales son rastreados utilizando rutinas de análisis de imágenes escrito en IDL. Las trayectorias de cada fluoróforo unido a un micrófono dadorotubule se combinan en una trayectoria de microtúbulos compuesto automáticamente 24. Los ángulos tangentes θ para cada punto a lo largo de una trayectoria se calculan, a partir de estos ángulos tangentes de la &lt;cosθ s&gt; valor se calcula para cada longitud de contorno s. Finalmente, estos datos se ajustan a la ecuación. 1 con el fin de extraer una longitud de persistencia para un microtúbulo dado, o para muchos microtúbulos en el mismo ensayo de deslizamiento. El método es lo suficientemente robusto como para trabajar con los microtúbulos preparados en una amplia variedad de condiciones (con diferentes agentes estabilizantes u otras moléculas pequeñas unidas a los microtúbulos, con las proteínas microtubulares unidos asociadas (MAPs), o con una variedad de soluciones viscosas). En nuestro laboratorio, la técnica se ha utilizado para caracterizar la longitud de persistencia de los microtúbulos como una función de la longitud a lo largo de los microtúbulos y los microtúbulos con diferentes agentes estabilizantes. La restricción principal es que los microtúbulos todavía debe spoyo kinesin motilidad. Desde quinesina es una enzima motor robusto, esta es una restricción bastante suelta. Mediante la sustitución de microtúbulos con la actina y la quinesina con una enzima de familia de la miosina, la longitud de persistencia de la actina puede ser medida utilizando la misma técnica.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reactivos</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro potásico</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro de magnesio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinilado BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-caseína</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Estreptavidina</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ditiotreitol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratorios</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosa oxidasa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalasa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosa</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoetanol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Comprar pequeña cantidad.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm N º 1 1/2 tapa de vidrio</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22 mm N º 1 cubierta de vidrio</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Grasa de alto vacío</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Equipos</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microscopio TIRF</td&gt;<td&gt; Muchos</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; El microscopio TIRF utilizado en este método fue hecho en casa.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; ¿Podría sustituir MATLAB, ImageJ, u otro software de análisis de imágenes.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

Los microtúbulos son polímeros del citoesqueleto que desempeñan un papel en la división celular, la mecánica celular y el transporte intracelular. Cada una de estas funciones requiere microtúbulos que son rígidos y recta suficiente para abarcar una fracción significativa de la célula de diámetro. Como resultado, la longitud de persistencia microtúbulos, una medida de la rigidez, se ha estudiado activamente durante las últimas dos décadas 1. No obstante, las preguntas abiertas permanecen: microtúbulos cortos son 10-50 veces menos rígidos que los microtúbulos largos 2-4, e incluso microtúbulos largas han medido las longitudes de persistencia que pueden variar en un orden de magnitud 5-9. A continuación, se presenta un método para medir la longitud de microtúbulos persistencia. El método se basa en un kinesin impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento 10. Mediante la combinación de etiquetado fluorescente escaso de microtúbulos individuales con seguimiento sola partícula de fluoróforos individuales unidos a los microtúbulos, la gliding trayectorias individuales de los microtúbulos se realiza un seguimiento con precisión nanométrica nivel. La persistencia de longitud de las trayectorias es la misma que la longitud de persistencia de los microtúbulos en las condiciones utilizadas 11. Una rutina de seguimiento automatizado se utiliza para crear trayectorias de microtúbulos a partir de los fluoróforos unidos a los microtúbulos individuales, y la longitud de persistencia de esta trayectoria se calcula utilizando las rutinas escritas en IDL. Esta técnica es rápida implementación, y capaz de medir la longitud de persistencia de 100 microtúbulos en un día de experimentación. El método puede ser extendido para medir la longitud de persistencia bajo una variedad de condiciones, incluyendo la longitud de persistencia como una función de la longitud a lo largo de microtúbulos. Además, las rutinas de análisis usados ​​pueden extenderse a miosina de acción basados ​​en ensayos de deslizamiento, para medir la longitud de persistencia de los filamentos de actina también.

Una instantánea de un ensayo de deslizamiento se muestra en la Figura 2. Una densidad de los microtúbulos es bueno microtúbulos 1-10 por campo de visión; sustancialmente más resultará en mal seguimiento como microtúbulos se cruzan entre sí. Una gráfica de las trayectorias 11 de microtúbulos a partir del ensayo de deslizamiento en la Figura 2 se muestra en la Figura 3. Trayectorias típicas son de 10 a 30 um de largo; algunas trayectorias tienen espacios donde ...

Watch this Scientific Journal Video about Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays at JoVE.com

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

Medidas de flexión rigidez de biopolímeros utilizando ensayos de Vuelo a Vela

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

flexural-rigidity-measurements-of-biopolymers-using-gliding-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K vistas.  Lawrence University. Un método para medir la longitud de persistencia o rigidez a la flexión de los biopolímeros se describe. El método utiliza una quinesina impulsado por microtúbulos ensayo de deslizamiento para determinar experimentalmente la longitud de persistencia de los microtúbulos individuales y es adaptable a actina ensayos basados ​​en deslizamiento.

Video: Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Desarrollar ovario de hámster chino anfitrión-ensayos con células de proteínas utilizando la tecnología de membrana acústica de micropartículas

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Investigación

Bioingeniería

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Velocímetro de Micro-partículas para Velocity perfil mediciones de flujos de sangre Micro

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Grano de agregación Los ensayos para la caracterización de Putativos Moléculas de Adhesión Celular

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Molecular Enredo y Electrospinnability de Biopolímeros

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Métodos para la auto-integración de Megamolecular Biopolímeros en el Aire-LC Interfaz de secado

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Medidas de entrada de potencia en biorreactores agitados a escala de laboratorio

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Un milímetro a la flexión prueba sistema de la escala para medir las propiedades mecánicas de espículas de esponja marina

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.