Los autores reconocen WJ Looney por su cuidadosa revisión del manuscrito.

Estándar 2 de las Normas Internacionales para la Tuberculosis estados cuidado de que todos los pacientes con sospecha de tuberculosis pulmonar debe presentar al menos dos muestras de esputo para examen bacteriológico. Cuando sea posible, al menos una mañana temprano muestra debe ser obtenida, como esputo recogido en este momento tiene el mayor rendimiento. 11 El Xpert MTB / RIF ensayo puede ser aplicado a las muestras de esputo o sedimentos concentrados preparados a partir de esputo expectorado inducido o esputos que son . ya sea bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) con baciloscopía positiva o negativa 6, 12, 13 El ensayo está diseñado para utilizarse con muestras de pacientes para los cuales hay sospecha clínica de tuberculosis pulmonar que tienen: 1) no ha recibido tratamiento antituberculoso, 2 ) tenían menos de 7 días de terapia, o 3) no han recibido tratamiento en los últimos 60 días. Ten en cuenta que no debe ser usado para monitorear los efectos de la terapia con medicamentos 7, porque el ADN bacteriano puede persistir después de la terapia antimicrobiana. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Tratar de muestras clínicas, incluyendo los cartuchos usados, como si fueran capaces de transmitir agentes infecciosos. Utilice las precauciones adecuadas, tales como el uso de guantes de protección desechables, batas de laboratorio y protección para los ojos, y seguir los procedimientos de su institución y directrices de seguridad. 1. Las muestras de esputo expectorado Nota: El proceso sólo muchos ejemplares de una sola vez, ya que hay GeneXpert sistema DX módulos disponibles para ejecutar la prueba! <ol><li> Marca cada uno de Xpert MTB / RIF cartucho con el ID de la muestra correspondiente. </li><li> Transferir 1,0 ml de esputo expectorado a una cónica, con tapón de rosca del tubo con una pipeta de transferencia estéril. Alternativamente, la muestra completa se puede procesar en el original a prueba de fugas contenedor de recogida de esputos. </li><li> Añadir 2,0 ml Xpert MTB / RIF reactivo Muestra (2:1, v / v) para el esputo expectorado utilizando una pipeta de transferencia estéril. </li><li> Vuelva a colocar la tapa y agitar el tubo vigorosamente 10-20 Veces. Alternativamente, la mezcla puede ser vortex (30 segundos). </li><li> Permitir el tubo en posición vertical durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Agite el tubo vigorosamente 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg). </li><li> Permitir el tubo en posición vertical durante otros 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Inspeccione las muestras: las muestras deben ser licuado y sin grumos visibles de esputo. </li></ol> 2. Los sedimentos concentrados Nota: El proceso sólo muchos ejemplares de una sola vez, ya que hay GeneXpert sistema DX módulos disponibles para ejecutar las pruebas! <ol><li> Marca cada uno de Xpert MTB / RIF cartucho con el ID de la muestra correspondiente. </li><li> Transferir 1,5 ml Xpert MTB / RIF reactivo a una muestra cónica, con tapón de rosca del tubo con una pipeta de transferencia estéril. </li><li> Añadir al menos 0,5 ml de sedimento concentrado al tubo de reactivo que contiene la muestra usando una pipeta de transferencia estéril. </li><li> Vuelva a colocar la tapa y agitar el tubo de vigorously 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg). </li><li> Permitir el tubo en posición vertical durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Agite el tubo vigorosamente 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg). </li><li> Permitir el tubo en posición vertical durante otros 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Inspeccione las muestras: las muestras deben ser licuado y sin grumos visibles de esputo. </li></ol> 3. Carga del Xpert MTB / RIF Cartucho Nota: Comience la prueba en 30 minutos de la adición de la muestra en el cartucho! <ol><li> Revise las etiquetas de la MTB Xpert / cartucho de RIF y el ID de la muestra. </li><li> Abra la tapa del cartucho. </li><li> Utilizando la pipeta de transferencia estéril suministrado, aspirar la muestra licuado en la pipeta de transferencia hasta que el menisco está por encima de la marca mínima y transferir la muestra en el puerto abierto del Xpert MTB / RIF cartucho. </li></ol> Nota:Dispense lentamente para minimizar el riesgo de formación de aerosol! <ol start="4"><li> Cierre la tapa del cartucho. </li></ol> 4. Inicio de la prueba Nota: Antes de comenzar la prueba, asegúrese de que el Sistema de GeneXpert Dx está equipado con el software GX2.1, y el Xpert MTB / RIF ensayo se importan en el software de 9! <ol><li> Encienda el ordenador y, a continuación, encienda el instrumento GeneXpert Dx. </li><li> En el escritorio de Windows, haga doble clic en el icono de acceso directo GeneXpert Dx. </li><li> Inicie sesión en el software del sistema GeneXpert Dx con su nombre de usuario y contraseña. </li><li> En la ventana Sistema GeneXpert Dx, haga clic en Crear prueba. El cartucho de escaneo de código de barras el cuadro de diálogo. </li><li> En el cuadro de ID de la muestra, lea o escriba el ID de la muestra. </li><li> Explorar el código de barras en el Xpert MTB / RIF cartucho. La ventana de prueba que aparezca Crear. </li><li> Haga clic en Inicio de prueba </strong&gt;, e introduzca su contraseña en el cuadro de diálogo que aparece. </li><li> Abra la puerta del módulo de instrumento con la luz verde parpadea, y cargar el cartucho. </li><li> Cierre la puerta. La prueba se inicia y la luz deja de parpadear y se mantiene constantemente en verde. Cuando la prueba haya finalizado, la luz se apaga. </li><li> Espere hasta que el sistema libera la cerradura de la puerta al final de la carrera, a continuación, abra la puerta del módulo y retire el cartucho. </li><li> Deseche los cartuchos utilizados en los contenedores de desechos apropiados de acuerdo a las prácticas habituales de la institución. </li></ol> 5. Los resultados representativos Cada Xpert MTB / RIF cartucho incluye reactivos para la detección de MTB complejo y resistencia a RIF, así como un control de procesamiento de la muestra (CPE) para controlar el procesamiento adecuado de las bacterias diana y para controlar la presencia de inhibidor de la (s) en la reacción de PCR . El control de comprobación de sonda (PCC) verifica la rehidratación reactivo, tubo de PCR rellenandoel cartucho, la estabilidad integridad de la sonda, y el tinte. 9 Los cebadores en el Xpert MTB / RIF ensayo amplificar una porción del gen rpoB que contiene el par 81 de base &quot;núcleo&quot; región. Cinco de diferente color fluorogénicos sondas de hibridación de ácidos nucleicos, llamados balizas moleculares, interrogar toda la 81-pb núcleo. 14 Cada baliza molecular fue diseñado para ser tan específica que no se une a su destino si la secuencia diana difiere de la de tipo salvaje rpoB secuencia por tan poco como una sustitución de un solo nucleótido. Desde fluorescencia molecular balizas sólo cuando están unidos a sus objetivos, es decir, de tipo salvaje secuencia rpoB, la ausencia de cualquiera de los cinco colores en el ensayo de diferenciar entre la conservadas secuencia del tipo salvaje y las mutaciones en la región del núcleo que están asociados con resistencia a RIF. 6 La RCP debe ser positivo en una muestra negativa y puede ser negativo o positivo en una muestra positiva. La pruebaresultado será &quot;no válida&quot; si el CPE no se detecta en una prueba negativa. Antes del inicio de la reacción de PCR, el Sistema GeneXpert Dx mide la señal de fluorescencia de las sondas para controlar la rehidratación talón, el llenado de reacción de tubo, la integridad de la sonda y la estabilidad del colorante. El PCC pasa si la señal de fluorescencia de las sondas cumple con los criterios de aceptación asignadas. Los resultados son interpretados por el sistema de GeneXpert Dx de las señales de fluorescencia medidos y algoritmos de cálculo integradas y se muestran en la ventana de resultados 9, como se indica a continuación: MTB Detectado: ADN diana se detecta MTB; ambos controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas. Los valores más bajos de Ct representan una mayor concentración de partida de molde de DNA; valores más altos de Ct representan una menor concentración de molde de ADN. En los resultados de MTB detectados &quot;resistencia a RIF DETECTED&quot; (Figura 1A), &quot;NO DETECTA resistencia a RIF&quot; ( <str1B ong&gt; Figura), o &quot;resistencia a RIF INDETERMINADO&quot; se mostrará en una línea separada. BTT no se detecta: el ADN de MTB de destino no se detecta, tanto en los controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas (Figura 2). Inválido: La presencia o ausencia de MTB no se puede determinar: SPC no cumple con los criterios de aceptación, es decir, la muestra no ha sido procesada correctamente, o PCR fue inhibida (Figura 3). Nota: repetición de la prueba con la muestra extra! Error: Uno o más de los resultados fallidos del PCC (FAIL). Tanto BTT y SPC muestra ningún resultado. Nota: repetición de la prueba con la muestra extra! Si el PCC pasado (PASS), el error está causado por un fallo de un componente del sistema. Figura 1: ADN MTB blanco es detectado, tanto en los controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas. Los valores más bajos de Ct representa una partida más altaconcentración de ADN molde; valores más altos de Ct representan una menor concentración de molde de ADN. En los resultados de MTB detectado &quot;no resistencia a RIF DETECTED&quot; (Figura 1A), &quot;resistencia a RIF DETECTED&quot; (fig. 1B), o &quot;resistencia a RIF INDETERMINADO&quot; se mostrará en una línea separada. <img alt="Figura 1A" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" /> . Figura 1A MTB DETECTADO; resistencia a RIF NO DETECTA, es decir, sólo la de tipo salvaje secuencia de ácido nucleico de la RIF de 81 pb resistencia a la determinación de la región (RRDR) del gen rpoB estaba presente 6. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 1B" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1B.jpg" /> . Figura 1B MTB DETECTADO; resistencia a RIF DETECTADO. Completa abandonar la Probe B (flecha), que cubre las posiciones 513 a 517 de la R<html> RDR del gen rpoB. 6 En el ejemplo, la secuenciación parcial reveló que la mutación del gen rpoB D516V se detectó. 8 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1Blarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig2.jpg" /> Figura 2 ADN MTB objetivo no se ha detectado,.. Ambos controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignados <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig3.jpg" /> . Resultado la Figura 3 la prueba no válida, es decir, presencia o ausencia de MTB no se puede determinar: SPC no cumple con los criterios de aceptación, ya que la muestra no ha sido procesada correctamente, o porque se inhibe la PCR.3547fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande figura.

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R., Alland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+rifampin+resistance+in+Mycobacterium+tuberculosis+in+a+single+tube+with+molecular+beacons.">Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 4131-4137 (2001).</li><li>Hillemann, D., Ruesch-Gerdes, S., Boehme, C., Richter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+molecular+detection+of+extrapulmonary+tuberculosis+by+automated+GeneXpert+MTB/RIF+system.">Rapid molecular detection of extrapulmonary tuberculosis by automated GeneXpert MTB/RIF system.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 1202-1205 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El Xpert MTB / RIF ensayo integra la descontaminación de la muestra, la operación de manos libres, a bordo de procesamiento de muestras, y ultra-sensible de PCR semi-anidada para la detección simultánea de MTB y la resistencia a RIF, ya sea en el esputo expectorado o sedimentos concentrados, en un solo , sistema fácil de usar. El ensayo analítico límite de detección se encontró que era 131 ufc / ml de esputo. 6 La relación log-lineal entre los valores de Ct y el número de células presentes MTB es válido desde 02 10 hasta julio 10 UFC / ml de esputo. Como las concentraciones de BTT clínicamente relevantes están comprendidos dentro del rango lineal del ensayo, el ensayo proporciona estimaciones semicuantitativas de la carga bacteriana. 7 El ensayo requiere infraestructura de laboratorio sólo moderada y la formación. El límite de detección se encuentra al menos dos órdenes de magnitud menor que la de microscopía convencional. 6 Especificidad es excelente. Por otra parte, la detección simultánea de RIF-resist MTB es un beneficio significativo en la configuración de las pruebas de punto de atención en la era de la tuberculosis farmacorresistente. 3 Hasta la fecha pocos datos publicados sobre los resultados del ensayo de para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en la práctica clínica están disponibles 12, 13. El Xpert MTB / RIF ensayo de la sensibilidad clínica global de detección de MTB en el esputo de los pacientes con tuberculosis pulmonar se sospecha fue del 97,6% en comparación con la cultura como referencia. Estos fueron los resultados de un estudio prospectivo multicéntrico que incluyó cinco sitios de estudio (Lima, Perú; Bakú, Azerbaiyán, Ciudad del Cabo y Durban, Sudáfrica, Mumbai, India) y un total de 1462 pacientes. El total de probabilidad pretest de la cultura-confirmó la tuberculosis en la población estudiada fue de 50,7%. La sensibilidad fue del 99,8% para los casos con baciloscopia y cultivo positivo y 90,2% para baciloscopia negativa, los casos con cultivo positivo. Entre los pacientes VIH-positivos con tuberculosis pulmonar, la sensibilidad de la prueba MTB / RIF fue del 93,9%, en comparación con el 98,4% enEl VIH-negativos pacientes de 12 En un entorno de baja prevalencia de la tuberculosis, el acuerdo global para la detección de MTB fue del 89% en comparación con la cultura, la sensibilidad fue del 98% para% con baciloscopia positiva y 72 para las muestras con baciloscopia negativa, respectivamente, y el especificidad fue excelente. 13 No hubo diferencia significativa en la sensibilidad entre las pruebas de esputo sin tratar y los de los sedimentos concentrados. 12 En el mismo estudio, la prueba MTB / RIF detecta correctamente la resistencia a RIF en 209 de los 211 pacientes (99,1% de sensibilidad) y en todos los 506 pacientes con susceptibilidad de RIF (100% de especificidad), cuando los resultados de la secuenciación se han tenido en cuenta. 12 Los autores encontraron que el rendimiento de la detección de casos ambos, y la discriminación de la resistencia a RIF, fue similar en los diversos sitios, lo que sugiere que los resultados es probable que ser ampliamente aplicable. 12 Además, los sedimentos concentradas de muestras respiratorias que no sean esputo, tales como lavado broncoalveolar y bronquiossecreciones l, se pusieron a prueba con una sensibilidad y especificidad comparable. 13 Los datos sobre las cualidades del ensayo de prueba, cuando la tuberculosis extrapulmonar está emergiendo. 15 Control de la tuberculosis mundial necesita urgentemente instrumentos eficaces que permitan el diagnóstico rápido de nuevos casos de tuberculosis y la detección de la RIF-resistente a la BTT, en el punto de acceso universal de los entornos de atención. 3 Los actuales métodos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar MTB son complejas, mano de obra, y técnicamente exigente. El Xpert MTB / RIF ensayo tiene el potencial de traer las pruebas de diagnóstico estandarizados, sensible y muy específica, tanto para la tuberculosis y la resistencia a los medicamentos en estos valores, a condición de que será capaz de pagar. Con el fin de facilitar el acceso, la Fundación para Nuevos Diagnósticos Innovadores (FIND) ha negociado reducciones de precios significativas para el Xpert MTB / RIF prueba. Los actuales precios FIND-negociados, junto con la lista de países elegibles para los descuentos, están disponibles en la web. 10 </sup&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Xpert MTB / RIF prueba </td><td> Cepheid </td><td> GXMTB/RIF-10 </td></tr><tr><td> Pipetas de transferencia </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1172.001 </td></tr><tr><td> Tubos cónicos, de 15 ml, 120 x 17 mm, PS </td><td> Sarstedt </td><td> 62.553.542 </td></tr></tbody></table>

diagnosing pulmonary tuberculosis with the xpert mtb/rif test

La tuberculosis (TB), debido a Mycobacterium tuberculosis (MTB) sigue siendo un importante problema de salud pública: la infección afecta a hasta un tercio de la población mundial 1, y casi dos millones de personas mueren por tuberculosis cada año 2 El acceso universal de alta calidad. , centrada en el paciente el tratamiento para todos los pacientes con TB se destaca por la OMS Estrategia Alto a la Tuberculosis. 3 La detección rápida de BTT en las muestras respiratorias y terapia con medicamentos basados ​​en resultados fiables de detección de drogas de resistencia son un requisito previo para la implementación exitosa de esta estrategia. Sin embargo, en muchas zonas del mundo, el diagnóstico de TB todavía se basa en métodos insensibles, microscopía de esputo poco estandarizados. Detección de la tuberculosis ineficaz y la aparición y transmisión de cepas resistentes a los medicamentos BTT cada vez más en peligro las actividades mundiales de lucha contra la tuberculosis. 2 El diagnóstico efectivo de la tuberculosis pulmonar requiere la disponibilidad - a escala mundial - del standnormalizadas y herramientas de diagnóstico fáciles de usar y robusto que permitan la detección directa de ambos el complejo MTB y la resistencia a los antibióticos clave, como la rifampicina (RIF). Este último resultado puede servir como marcador para multirresistente MTB (TB MDR) y ha sido reportado en&gt; 95% de las cepas de TB-MDR. 4, 5 La rápida disponibilidad de resultados de las pruebas confiables es probable que se traducen directamente en el manejo del paciente de sonido decisiones que, en última instancia, va a curar al paciente individual y romper la cadena de transmisión de la tuberculosis en la comunidad. 2 Cefeida (Sunnyvale, CA, EE.UU.) Xpert MTB / RIF ensayo de 6, 7 cumple con las exigencias señaladas anteriormente de una manera notable. Es una prueba de amplificación nucleicos-ácidos por 1) la detección de ADN de MTB complejo en el esputo o sedimentos concentrados de esputo, y 2) la detección de RIF asociadas a la resistencia mutaciones del gen rpoB 8 Se ha diseñado para su uso con GeneXpert Cefeida DX. Sistema ªen integra y automatiza el procesamiento de muestras, la amplificación de ácido nucleico, y la detección de las secuencias diana mediante PCR en tiempo real y PCR transcriptasa inversa. El sistema consta de un instrumento, una computadora personal, un escáner de código de barras y el software precargado para ejecutar pruebas y ver los resultados. 9 Se emplea un solo uso y desechables Xpert MTB / RIF cartuchos que contienen los reactivos de la PCR y la sede del proceso de PCR. Debido a que los cartuchos son auto-contenido, la contaminación cruzada entre las muestras se elimina. 6 actuales métodos de amplificación de ácidos nucleicos para detectar MTB son complejas, requieren mucho trabajo, y técnicamente exigente. El Xpert MTB / RIF ensayo tiene el potencial de traer las pruebas de diagnóstico estandarizados, sensible y muy específica, tanto para la tuberculosis y la resistencia a los medicamentos de acceso universal en el punto de atención de la configuración 3, a condición de que será capaz de pagar. Con el fin de facilitar el acceso, la Fundación para Nuevos Diagnósticos Innovadores (FIND) ha negociado significativareducciones significativas de precios. Los actuales precios FIND-negociados, junto con la lista de países elegibles para los descuentos, están disponibles en la web. 10

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Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

El Xpert MTB / RIF prueba integra la descontaminación de la muestra, la operación de manos libres, a bordo de procesamiento de muestras, y ultra-sensible de PCR semi-anidada para la detección simultánea de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Resistencia a la rifampicina, ya sea en el esputo expectorado o sedimentos concentrados de esputo, en aproximadamente dos horas. La prueba es estandarizada y requiere una infraestructura de laboratorio sólo moderada y la formación.

El diagnóstico de tuberculosis pulmonar con el Xpert MTB / RIF prueba

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

79.8K vistas.  University of Bern. El Xpert MTB / RIF prueba integra la descontaminación de la muestra, la operación de manos libres, a bordo de procesamiento de muestras, y ultra-sensible de PCR semi-anidada para la detección simultánea de Mycobacterium tuberculosis Resistencia a la rifampicina, ya sea en el esputo expectorado o sedimentos concentrados de esputo, en aproximadamente dos horas. La prueba es estandarizada y requiere una infraestructura de laboratorio sólo moderada y la fo...

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Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Investigación

Inmunología e Infección

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

Ventricular derecha sistólica mediciones de presión en combinación con la cosecha de pulmón y muestras de tejido inmune en ratones

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modelo experimental para estudiar la tuberculosis-Malaria Coinfección sobre Transmisión Natural de Mycobacterium tuberculosis Y Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Proyección de imagen de tuberculosis del Mycobacterium en ratones con reportero enzima fluorescencia

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Ensayo de co-inmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre los receptores y enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Aplicación de Perturbaciones Consistentes Similares al Masaje en Los terneros de ratón y Monitoreo de los Cambios de Presión Intramuscular Resultantes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...