Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la tuberculosis, como cuál es el papel de las respuestas inmunitarias adaptativas y la patogénesis de esta enfermedad multifactorial. La principal ventaja de este método base de ácido nucleico es que tanto las cargas bacterianas como los niveles de expresión génica se pueden medir desde el mismo individuo. Para comenzar este procedimiento, haga referencia a M.marinum en una placa 7H10 como se describe en el protocolo de texto.
Transfiera 10 mililitros de medio 7H9 que contengan enriquecimiento ADC, polisorbato 80 y glicerol a un matraz de cultivo celular. A continuación, utilice un bucle de inoculación estéril de un microlitrotro para transferir asépticamente un bucle de masa bacteriana M.marinum al matraz. Deje la tapa suelta o use una tapa de filtro para permitir un intercambio de gas y un cultivo suficientes a 29 grados centígrados en la oscuridad sin agitar durante tres o cuatro días hasta que el OD600 alcance aproximadamente 0,7.
Diluir y continuar cultivando las bacterias como se describe en el texto. Para comenzar a preparar la solución bacteriana para la infección, transfiera un mililitro del cultivo a un tubo fresco. Centrifugar a 10.000 g durante tres minutos.
Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en un mililitro de PBS estéril. Usando PBS estéril con un 0,3 miligramos por mililitro de fenol rojo como un trazador, diluir la suspensión para alcanzar la concentración bacteriana deseada. Después de esto, utilice una jeringa de un mililitro para tirar lentamente de la suspensión a través de una aguja de calibre 27 tres veces.
Realice este paso justo antes de su uso para cada alícuota. En primer lugar, pipetear una gota de cinco microlitros de la solución bacteriana diluida en un trozo de película de parafina. Luego, tire de la gota en una aguja de insulina de calibre 30.
Usa un pez de cinco a ocho meses para este experimento con uno siendo un pez de tipo salvaje y el otro un pez mutante de trapo. Coloque estos peces de lado ventral hacia arriba en las rendijas de un pedazo de plástico espumado húmedo. Inyecte la aguja de insulina entre las aletas pélvicas en un ángulo de 45 grados.
Mantenga la aguja abriéndose hacia arriba para asegurarse de que toda la abertura esté dentro de la cavidad abdominal. Luego, inyecte lentamente la solución bacteriana. Después de esto, retire cuidadosamente la aguja y transfiera inmediatamente el pescado a un tanque de recuperación lleno de agua fresca del tanque.
Tomar muestras de la alícuota bacteriana en uso cada 15 minutos en placas 7H10. Incubar estas muestras a 29 grados centígrados durante cinco días para verificar la dosis de infección. Compruebe el bienestar de los peces regularmente, asegurándose de eutanasiar cualquier pez con síntomas de infección incubando en agua con más de 0.02%de 3-ácido aminobenzoico éster etílico.
Después de eutanasiar el pescado, inserte un pasador posterior a los rayos branchiostegal. Inserte un segundo pasador a través de la cola para atajer el pez en la plataforma. Con un bisturí, abre toda la cavidad abdominal.
Luego, usa una cuchara pequeña y pinzas afiladas para recoger los órganos internos comenzando en el corazón y trabajando a lo largo de la columna vertebral hacia la cola para separar todos los órganos internos en un bloque. Utilice pinzas para separar la red intestinal de la cloaca y transferir los órganos a un tubo de homogeneización de 1,5 mililitros que contiene media docena de cuentas de cerámica de 2,8 milímetros. Coloque inmediatamente el tubo sobre hielo seco para congelar la muestra.
Almacene la muestra a 80 grados celsius negativos hasta que esté lista para homogeneizarse. Después de extraer el ADN y el ARN, mida las cargas micobacterianas por PCR cuantitativo como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, los peces cebra adultos se infectan con M.marinum mediante una inyección intraperitoneal.
Se observa una dosis alta de infección que conduce a una enfermedad progresiva en la que la carga micobacteriana continúa aumentando hasta que la carga media alcanza alrededor de cinco millones de bacterias matando en última instancia a los peces. Una dosis baja, por otro lado, conduce al desarrollo de un espectro de enfermedad similar al observado en la tuberculosis humana con infecciones progresivas, latentes, reactivadas y esterilizadas. En este caso, la carga continúa aumentando durante cuatro semanas después de lo cual la enfermedad alcanza un estado estable en la mayoría de los peces.
Estos datos revelan que el número inicial de micobacterias utilizadas para infectar a los peces es un determinante crítico para el resultado de la infección. Se considera que el pez cebra mutante de trapo no puede limitar suficientemente el crecimiento de las micobacterias, lo que aumenta las cargas bacterianas y aumenta la morbilidad. Esto demuestra claramente la importancia de la inmunidad adaptativa para controlar la infección micobacteriana.
Los niveles de interleucina-4 son significativamente más altos en el grupo de tipo salvaje revelando que la respuesta adaptativa es necesaria para la introducción eficiente de la interleucina-4, pero prescindible para la introducción de la gamma de interferón después de la infección micobacteriana. Este protocolo permite la recopilación de ADN y ARN de la misma muestra, lo que permite combinar la carga micobacteriana de la muestra con datos de expresión génica tanto del huésped como de las bacterias. Esta técnica se puede combinar con la administración de medicamentos o candidatos a vacunas para evaluar su efecto en las cargas micobacterianas y las respuestas inmunitarias.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar seguir las pautas locales para la seguridad personal y la eliminación de residuos cuando se trabaja con un patógeno de nivel dos de bioseguridad. Esta técnica permite estudiar la tuberculosis activa y latente con micobacterias latentes en el pez cebra que es un modelo ético no mamífero in vivo.
