Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW), American Heart Association, filial Fundadores (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fondo, Nueva York (SHP).

1. Preparación <ol><li> Preparar las siguientes soluciones y tubos (Tabla 1) como sigue: <ol><li> Hanks solución, sin calcio, magnesio o indicador con penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml). </li><li> Salina tamponada con fosfato (PBS), 1x, calcio no, magnesio no. </li><li> Etanol, 70%, hacer 500 ml. </li><li> Buffered formaldehído, un 7-10% con PBS, hacer 500 ml. </li><li> Anestesia soluciones: <ol><li> Avertin. Añadir cuidadosamente 5 ml de 2-metil-2-butanol a 5 g de 2,2,2-tribromoetanol. Una vez disuelto, mantener solución madre a temperatura ambiente en la oscuridad. Tomar 0,25 ml de la solución madre y se diluye con 10 ml de 1xPBS en botella de vidrio de fondo. Envolver el frasco con hoja de aluminio, lugar a 37 º C hasta que se disolvió y luego alícuota en tubos de 5 ml de polipropileno y mantener en el refrigerador. Calentar una alícuota en la mañana del experimento. </li><li> Barbitúricos. Diluir solución madre con PBS para obtener un 2,6% de barbitúricos sollución. Colocar alícuotas de 3-4 ml en tubos de polipropileno. </li></ol></li></ol></li><li> Organizar el trabajo-tres áreas (Figura 1). </li><li><ol><li> Zona A: Colocar los siguientes elementos: formulario de estudio para registrar el número de identificación del estudio, la fecha, el peso corporal y peso del corazón derecho, corazón izquierdo y el tabique, balanza de precisión (0-50 g a 0,01 g de precisión) para determinar el peso del cuerpo, escala micro para determinar los pesos del corazón a 0,001 g de precisión; pesan barcos; soluciones de anestesia (claramente marcada); pequeño Dewar con nitrógeno líquido; recipiente aislado con hielo; tubos y la placa de 24-bien para recoger muestras de sangre y tejidos (Tabla 1); instrumentos quirúrgicos ( Tabla 2, Figura 2), y soluciones para limpiar los instrumentos (Tabla 1). </li><li> Zona B: Colocar los siguientes elementos: microscopio de disección; catéter pulmonar conectado a una unidad de control de presión que está conectado a un amplificador y un ordenador portátil. El catéter se coloca enun vaso de precipitados que contiene agua. Organizar los instrumentos quirúrgicos (Tabla 2), piezas de corte a la longitud óptima de sutura y se coloca en un barco pesa; cinta (cinta de autoclave es óptimo) corta a la longitud y la anchura óptima y alineados en el banco o en el laboratorio microscopio para facilitar el acceso; hisopos de algodón y pelo removedor de solución. Calibrar el catéter en el inicio del estudio. </li><li> Zona C: Coloque los siguientes artículos: lupa lente; cánula traqueal, jeringas de 1 ml, corte a la longitud óptima de sutura y se coloca en un barco pesa; pequeño termo con nitrógeno líquido, recipiente aislado con hielo, tubos y 24-así placa para recoger BAL y muestras de tejido (Tabla 1), y los instrumentos quirúrgicos (Tabla 2), soluciones para realizar BAL y para limpiar la cánula traqueal y los instrumentos (Tabla 1). </li></ol></li></ol> 2. La cateterización del corazón derecho <ol><li> Pesar ratón utilizando una balanza de precisión colocando suavemente el ratón en un pesaje bavena. Asegúrese de manejar al animal suavemente y en silencio. Registre el peso. El protocolo descrito funciona mejor para los ratones que son 20 g o más, porque el diámetro de la vena yugular tiene que acomodar la sonda de presión, es posible para la cateterización más pequeños ratones (17 g o más), siempre que la vena es lo suficientemente grande. </li><li> Anestesiar el ratón por inyección con Avertin en función del peso corporal (10 l / g), por ejemplo, para dar 20 g 200 l, para dar 25 g 250 l, para dar 30 g 300 l. El volumen de inyección exacta necesita ser ajustado dependiendo de la cepa de ratón. Asegúrese de manejar el animal suave y silenciosamente porque el estrés puede alterar la respuesta a la anestesia. </li><li> Una vez que el ratón está sedado, coloque en papel de seda de doble plegado. Tenga en cuenta el número de ID en el papel. Frote suavemente la crema del retiro del pelo en la cara ventral del cuello para limpiar el campo quirúrgico. Coloque el ratón de nuevo en el papel y esperar 1-2 min. </li><li> Quitar el pelo de la cara ventraldel cuello suavemente acariciando el cabello contra la dirección del crecimiento del pelo con hisopos de algodón. </li><li> Determinar cuidadosamente la profundidad de anestesia mediante la comprobación de la ausencia del reflejo de dedo del pie: el ratón no reacciona a pellizcos de los dedos del pie. </li><li> Trabajando rápidamente y relajado, el resto de la cateterización del corazón derecho no debe tomar más de 10 minutos, de manera óptima 3-6 min. Es importante que el tejido no se seque, ya que el catéter debe deslizarse dentro de la vena y se mueven dentro de la vena en una capa de humedad. Tiempo coherente del procedimiento es importante para la generación de los datos que son comparables entre los grupos. </li><li> Coloque de nuevo el ratón sobre un pañuelo de papel y la transferencia de papel de seda en la espuma de poliestireno bordo. Fijar las patas y la cabeza en su sitio con cinta de autoclave. </li><li> Hacer la incisión de la piel de las mandíbulas hasta el esternón (esternón). </li><li> Con cuidado, diseccionar hacia arriba tiroides grandes hacia las mandíbulas para exponer la vena yugular derecha unnd tráquea. </li><li> Lugar de espuma de poliestireno bordo Manteniendo el ratón bajo el microscopio de disección con el plano de enfoque ya existentes y la lente de aproximadamente 0,8 x ampliación (ampliación total [x lente ocular] es aproximadamente 8 veces. </li><li> Microdissect cuidadosamente la vena yugular derecha mediante la eliminación de tejido conectivo circundante con pinzas quirúrgicas. </li><li> Coloque dos piezas de sutura en la parte superior de la vena yugular derecha. Atar la sutura más cercano a las mandíbulas para cerrar el flujo de sangre en la vena para un pequeño goteo, colocar la sutura que está más cerca del esternón / esternón en un nudo flojo alrededor de la vena. Uno puede usar el pequeño goteo de sangre para encontrar más tarde el agujero en la vena, si esto fuera necesario. </li><li> Respira y relájate (aflojar los músculos del cuello y la mandíbula) para mantener sus ojos en la vena a través del ocular. Esto se asegurará de que sus manos y dedos se moverán de forma segura, suave y relajado. Mientras sostiene la vena con pinzas en el lado más cercano alas mandíbulas, cortar un agujero en la vena entre las dos suturas utilizando micro-tijeras operados por otra parte. Deja las tijeras microempresas, y mantener esa mano relajada, trate de sentir el catéter. Suavemente recuperar el catéter sosteniéndolo entre el pulgar y el dedo índice (Figura 3). Insertar el catéter en el orificio de la vena. </li><li> Avance suavemente el catéter en el corazón derecho (Figura 3). Observe las marcas en el catéter que da un índice aproximado de hasta qué punto el catéter necesita ser insertado y observar el monitor. Una vez que las curvas de presión se muestran, apretar suavemente la sutura inferior alrededor de la sonda. Debido a que el catéter tiene resistencia a la tracción que le da una bobina, y porque la respiración y los latidos del corazón del ratón añadir movimiento, además, fijar el catéter con cinta adhesiva. </li><li> Registrar las mediciones de presión durante 2 minutos para su análisis posterior (Figura 4). </li><li> Abra la sutura de la celebración de la sonda, luego suavemente RetrieVe catéter. Limpiar la parte detrás del transductor de presión, coloque de nuevo en el vaso de precipitados con agua. No toque el transductor de presión. </li><li> Transferir el ratón en la parte superior del papel de seda a la zona A de la eutanasia, la recogida de tejido de la sangre y el bazo. Limpiar instrumentos quirúrgicos. </li><li> Iniciar el procedimiento con el siguiente animal. Cuando el tiempo lo permite, inyectar el anestésico mientras espera para registrar la curva de presión (2,15). </li></ol> 3. Toma de muestras de sangre y el bazo <ol><li> Inyectar solución barbitúricos, 400 l por ratón y esperar 1-2 min. Esto se realiza rutinariamente en nuestro laboratorio para evitar la posibilidad de que los ratones sin querer recuperarse de avertina-anestesia mientras desangrado. Normalización adecuada del experimento se consigue mediante la inyección de la misma dosis de solución barbitúrico por ratón, y esperando la misma cantidad de tiempo antes de la cosecha de la sangre. Si está permitido por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión ysiempre y cuando los animales son cuidadosamente monitorizados por la profundidad de la anestesia antes de la exanguinación, este paso puede ser omitido. </li><li> Hacer incisión en el abdomen. Abrir la vena caudal (vena cava) y recoger la sangre usando una pipeta de transferencia. </li><li> Extirpar el bazo, o una pieza del bazo en el tubo de Eppendorf y congelamiento rápido en nitrógeno líquido, o en la placa de 24 pocillos en un pozo que contiene tampón de Hanks para la preparación posterior de las células individuales. </li><li> Transferir el ratón en la parte superior del papel tisú a C del área de trabajo para la recogida de BAL, pulmón drenaje de ganglios linfáticos, el pulmón y los tejidos del corazón. Limpiar instrumentos quirúrgicos. </li></ol> 4. Recolección de muestras de pulmón y corazón <ol><li> Disecciona la tráquea libre de músculo y tejido conectivo. Fórceps inclusión en la traquea, saque la sutura a través. Suavemente generar tramo suficiente para cortar un agujero. Mantener el estiramiento suave, inserte la cánula traqueal con un movimiento ligeramente torneado, y la sutura cánula into lugar. Para la inserción de la cánula traqueal, asegúrese de que la tráquea está húmedo, si es necesario añadir una gota de solución de Hanks. Durante todo el procedimiento, respirar, relajarse cuello y músculos de la mandíbula, para mantener movimientos de la mano segura y sin problemas. </li><li> Disecciona abrir la caja torácica retirando cuidadosamente el esternón a partir de finales abdominal. No moleste a los contenidos del tórax porque esto hará que sea muy difícil encontrar el ganglio linfático. </li><li> Realizar el lavado broncoalveolar (BAL), insertando suavemente 1 ml de tampón Hanks, gire suavemente la jeringa y recupere el líquido de BAL. Repetir 3 veces, el tubo de cierre y colocar en hielo. Durante todo el procedimiento, mantener los ojos en el extremo de la cánula traqueal que se conecta a la jeringa. Una mirada a tórax para observar el inflado y desinflado de los pulmones. </li><li> Pulmón cosecha de ganglios linfáticos mediante la celebración de pared de la caja torácica con un juego de fórceps, encontrar y recuperar el ganglio linfático con otros fórceps. Lugar de ganglios linfáticos en placa de 24 pocillos. Es importante kahora dónde buscar: empezando por el cuello, encontrar la entrada de la caja torácica desde el lado derecho del ratón y mirar por encima de la espina dorsal (Figura 5). </li><li> Harvest corazón y colocar en papel de seda. Aislar el lado derecho del corazón mediante una cuidadosa disección lado del tabique. Traslado al trabajo de la zona A de pesar, registrar el peso y el lugar en tubos eppendorf para ajustar congelación en nitrógeno líquido. </li><li> Coloque sutura alrededor del lóbulo pulmonar izquierdo para cerrar el bronquio principal. Diseccionar el pulmón izquierdo lóbulo libre, lugar en el tubo eppendorf y congelamiento rápido en nitrógeno líquido, o el lugar en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía solución de Hanks para el aislamiento posterior de suspensiones de células individuales. </li><li> Inserte aprox. 0,5 ml solución tamponada de formaldehído a través de la cánula traqueal en los lóbulos pulmonares restantes. Después de la inflación, diseccionar los lóbulos pulmonares fuera del tórax y el lugar en el tubo de 50 ml que contiene una solución de formaldehído. Para un estudio de diseño alternativo, los pulmones se pueden inflar con optimal corte de los medios de comunicación (octubre, se diluyó 1:4 con PBS) y se congeló en un molde que contiene octubre sin diluir para la preparación posterior de secciones congeladas. Otro diseño del estudio podría requerir la obtención de tejido pulmonar congelado complemento y suspensiones de células individuales de los pulmones. En ese caso, no es necesario inflación: diseccionar los lóbulos pulmonares restantes; recuperarlos del tórax y el lugar en la placa de 24 pocillos en un pozo que contiene tampón de Hanks. </li><li> Retire la cánula traqueal, limpio por lavado con tampón de Hanks, limpiar los instrumentos quirúrgicos. </li></ol> 5. El análisis de las curvas de presión generadas a partir del catéter pulmonar Los datos registrados de presión ventricular derecha se analizan utilizando LabChart 7 software sin conocimiento de la identidad de grupo de cada grabación. Más de 20 curvas se seleccionan al azar y la diferencia entre la máxima y la presión ventricular mínima para cada curva de medición (DP). La? P media se calcula a dar el derecho vpresión sistólica entricular.

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No hay conflictos de interés declarado.

El flujo experimental descrito aquí permite la medición rápida y simultánea de la presión sistólica del ventrículo derecho y la cosecha de las muestras para el análisis de las respuestas en los pulmones, el corazón y el sistema inmune en ratones. El procedimiento combina mediciones cardíacas fisiología, micro-disección y posterior cosecha de tejidos para estudios de células vivas, el análisis histológico o ómicas-análisis de los tejidos. El procedimiento completo tarda menos de 20 min por ratón. Debido...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reactivos </td></tr><tr><td> 2-metil-2-butanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 152463 </td><td></td></tr><tr><td> 2,2,2-tribromoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T48402 </td><td></td></tr><tr><td> desinfectante jabón (Cobertura de rociado más Steris TB) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1629-08 </td><td></td></tr><tr><td> Alcohol etílico, 200 Proof, Absolute, anhidro ACS / USP Grade </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> Diluir a 70% con agua destilada </td></tr><tr><td> Solución de formaldehído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1635-500ML </td><td> Diluir hasta un 7-10% de formaldehyde concentración a una concentración de 1x PBS utilizando PBS solución madre y agua </td></tr><tr><td> Hanks solución, sin calcio, magnesio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-022 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Octubre </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina (10.000 U / ml) / estreptomicina (10.000 mg / ml) solución </td><td> Thermo Scientific </td><td> SV30010 </td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada con fosfato (PBS), sin calcio, magnesio no, las soluciones de 1x y 10x </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital sódico 26% </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> NDC 0856-0471-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Labware </td></tr><tr><td> Las placas 12, 24, 96 así </td><td> Halcón </td><td></td><td></td></tr&gt; <tr><td> Transferencia Pipet </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711 9BM- </td><td></td></tr><tr><td> Tube, EDTA revestida </td><td> Sarstedt </td><td> 2013-08 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 0,65 ml y 1,7 ml de centrífuga micro- </td><td> VWR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 12 x 75 mm de polipropileno </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1D </td><td></td></tr><tr><td> Tubos, varios tamaños, polipropileno </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Pinzas, Dumon º 5 Fine </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas, extra fino Graefe-0.5mm puntas curvas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11152-10 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas, extra fine Graefe-0.5mm tips recta </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11150-10 </td><td></td></tr><tr><td> La cánula calibre 18, 19 ga </td><td> BD </td><td> Precisión Glide Needles </td><td> Cortar a la longitud óptima, se hizo romo y fuera de raspado para crear una superficie exterior rugosa </td></tr><tr><td> Tijeras, tijeras de disección-delgadas hojas de 9cm </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 14081-09 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura de BAL, sutura de seda trenzada, 4-0 </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Sutura de cateterismo cardíaco derecho, sutura trenzada de seda, 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 18020-60 </td><td></td></tr><tr><td> Jeringa, 1 ml </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipo </td></tr><tr><td> Amplificador, PowerLab 4/30 </td&gt; <td> ADInstrument </td><td> Modelo ML866 </td><td></td></tr><tr><td> Catéter, presión F1.4 </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> 840-6719 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Variscope </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinzas, tijeras Vannas primavera-2mm cuchillas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Lupa luminosa halógena Desk </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-990-56 </td><td></td></tr><tr><td> Ordenador portátil </td><td> Asus </td><td> Número de modelo del procesador i5 A52F, 15 pulgadas </td><td></td></tr><tr><td> Fuente de luz </td><td> Amscope </td><td> HL-250-A </td><td></td></tr><tr><td> Unidad de Control de Presión </td><td> Millar Instruments, Inc </td><td> PCU-2000 </td><td></td></tr><tr><td> Software, LabChart-Pro V.7 </td><td> En ADinstrumentos </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

right ventricular systolic pressure measurements in combination with harvest of lung and immune tissue samples in mice

La función del corazón derecho es bombear sangre a través de los pulmones, uniendo así la fisiología del corazón derecho y la fisiología vascular pulmonar. La inflamación es un modificador común de corazón y la función pulmonar, mediante la elaboración de la infiltración celular, la producción de citoquinas y factores de crecimiento, y mediante el inicio de procesos de remodelación 1. En comparación con el ventrículo izquierdo, el ventrículo derecho es una bomba de baja presión que funciona en una zona relativamente estrecha de los cambios de presión. El aumento de la presión arterial pulmonar se asocian con aumento de la presión en el lecho vascular pulmonar y la hipertensión pulmonar 2. La hipertensión pulmonar se asocia a menudo con enfermedades pulmonares inflamatorias, por ejemplo enfermedad pulmonar obstructiva crónica, o enfermedades autoinmunes 3. Dado que la hipertensión pulmonar confiere un mal pronóstico para la calidad de vida y la esperanza de vida, mucha investigación se dirige hacia la comprensión de los mecanismos que might ser blanco de 4 intervención farmacéutica. El principal desafío para el desarrollo de herramientas de gestión eficaces para la hipertensión pulmonar sigue siendo la complejidad de la comprensión simultánea de los cambios moleculares y celulares en el corazón derecho, los pulmones y el sistema inmunológico. Aquí, se presenta un flujo de trabajo de procedimiento para la medición rápida y precisa de los cambios de presión en el corazón derecho de ratones y la cosecha simultánea de muestras de corazón, los pulmones y los tejidos inmunes. El método se basa en la cateterización directa del ventrículo derecho a través de la vena yugular en estrecha de pecho ratones, desarrollado por primera vez en la década de 1990 como medida indirecta de la presión en la arteria pulmonar 5-13. El equipo organizó enfoque facilita una técnica muy rápida cateterismo cardíaco derecho. Esto hace que sea posible llevar a cabo las mediciones en los ratones que espontáneamente respirar aire de la habitación. La organización del flujo de trabajo en distintas áreas de trabajoreduce el tiempo de retardo y abre la posibilidad de realizar simultáneamente experimentos de fisiología y tejidos cosecha corazón inmune, y pulmón. El flujo de trabajo del procedimiento descrito aquí se puede adaptar para una amplia variedad de entornos de laboratorio y diseños de estudio, a partir de experimentos pequeñas y enfocadas, a grandes ensayos de selección de fármacos. La adquisición simultánea de datos en fisiología cardiaca que se puede ampliar para incluir la ecocardiografía 5,14-17 y cosecha de los tejidos del corazón, pulmón e inmune reduce el número de animales necesarios para obtener los datos que se mueven a la base de conocimientos científicos adelante. El flujo de trabajo de procedimiento que aquí se presenta también proporciona una base ideal para el conocimiento de las redes que vinculan a pulmón inmune y la función cardiaca. Los mismos principios descritos aquí pueden adaptarse para estudiar otros órganos o adicional según sea necesario.

El resultado primario para la obtención de curvas de presión derecho del corazón se logra por la posición correcta del catéter en el corazón derecho. La forma de las curvas de presión de tiempo es crítico porque la correcta colocación del catéter dentro del ventrículo derecho se traducirá en mesetas de presión (Figura 4). Curvas de punta, en cambio, indican un catéter que se mueve por la respiración o el movimiento latido del corazón contra la pared del ventrículo derecho. Para detectar...

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Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice | Immunology and Infection | Video

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Un protocolo específico y rápido para investigar simultáneamente la función del corazón derecho, inflamación pulmonar, y la respuesta inmune que se describe como una herramienta de aprendizaje. Vídeo y figuras describen la fisiología y técnicas de microdisección en un equipo organizado-enfoque que es adaptable para ser utilizado para pequeñas y grandes estudios de tamaño.

Ventricular derecha sistólica mediciones de presión en combinación con la cosecha de pulmón y muestras de tejido inmune en ratones

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

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25.0K vistas.  New York University School of Medicine, Tuxedo. Un protocolo específico y rápido para investigar simultáneamente la función del corazón derecho, inflamación pulmonar, y la respuesta inmune que se describe como una herramienta de aprendizaje. Vídeo y figuras describen la fisiología y técnicas de microdisección en un equipo organizado-enfoque que es adaptable para ser utilizado para pequeñas y grandes estudios de tamaño.

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Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic Poly(I:C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric disorders. Numerous studies have demonstrated that MIA model is able to show face, construct, and predictive validity that are relevant to autism and schizophrenia. To model MIA, investigators often use viral mimic polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)) to activate the immune system in pregnant rodents. Generally, the offspring from immune activated dam exhibit behavioral abnormalities and physiological alterations that are associated with autism and schizophrenia. However, poly(I:C) injection with different dosages and at different time points could lead to different outcomes by perturbing brain development at different stages. Here we provide a detailed method of inducing MIA by intraperitoneal (i.p.) injection of 20 mg/kg poly(I:C) at mid-gestational embryonic 12.5 days (E12.5). This method has been shown to induce acute inflammatory response in the maternal-placental-fetal axis, which ultimately results in the brain perturbations and behavioral phenotypes that are associated with autism and schizophrenia.

Induction of Maternal Immune Activation in Mice at Mid-gestation Stage with Viral Mimic PolyI:C

Maternal immune activation (MIA) is a model for an environmental risk factor of autism and schizophrenia. The goal of this article is to provide a step-by-step procedure of how to induce MIA in the pregnant mice in order to enhance the reproducibility of this model.

La inducción de la activación inmune materna en ratones en la etapa mitad de la gestación con Viral Mimic poli (I: C)

Maternal immune activation (MIA) model is increasingly well appreciated as a rodent model for the environmental risk factor of various psychiatric ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Análisis de citometría de flujo de las células asesinas naturales lítico Actividad en sangre entera humana

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Evaluación de la citotóxica y efectos inmunomoduladores de sustancias en lonchas de pulmón humano de precisión de corte

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Aplicación de Perturbaciones Consistentes Similares al Masaje en Los terneros de ratón y Monitoreo de los Cambios de Presión Intramuscular Resultantes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Monitoring Neutrophil Elastase and Cathepsin G Activity in Human Sputum Samples

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical challenge. Among the ~600 proteases encoded by the human genome, neutrophil serine proteases (NSPs) are thoroughly investigated for their involvement in the onset and progression of inflammatory conditions including respiratory diseases. Uniquely, secreted NSPs not only diffuse within extracellular fluids but also localize to plasma membranes. During neutrophil extracellular trap (NETs) formation, NSPs become an integral part of the secreted chromatin. Such complex behavior renders the understanding of NSPs pathophysiology a challenging task. Here, detailed protocols are shown to visualize, quantify and discriminate free and membrane-bound neutrophil elastase (NE) and cathepsin G (CG) activities in sputum samples. NE and CG are NSPs whose activities have pleiotropic roles in the pathogenesis of cystic fibrosis (CF) and chronic obstructive pulmonary disease (COPD): they promote tissue remodeling, regulate downstream immune responses and correlate with lung disease severity. The protocols show how to separate fluid and cellular fraction, as well as the isolation of neutrophils from human sputum for enzymatic activity quantification via small-molecule F&#246;rster resonance energy transfer-based (FRET) reporters. To gather specific insights into the relative role of NE and CG activities, a FRET readout can be measured by different technologies: i) in vitro plate reader measurements allow for high-throughput and bulk detection of protease activity; ii) confocal microscopy spatiotemporally resolves membrane-bound activity at the cell surface; iii) small-molecule FRET flow cytometry enables for the rapid evaluation of anti-inflammatory treatments via single-cell protease activity quantification and phenotyping. The implementation of such methods opens the doors to explore NSPs pathobiology and their potential as biomarkers of disease severity for CF and COPD. Given their standardization potential, their robust readout and simplicity of transfer, the described techniques are immediately shareable for implementation across research and diagnostic laboratories.

The protocols herein described provide a guide to visualize and quantify the activity of neutrophil proteases in human sputum. The applications of such analysis span from the evaluation of anti-inflammatory treatments, to biomarker validation, drug screening and large cohort clinical studies.

Monitoreo De La ElastasA NeutrófiloS Y La Actividad De La Catepsina G En Muestras De Esputo Humano

Proteases are regulators of countless physiological processes and the precise investigation of their activities remains an intriguing biomedical ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms include irregular fever, lymphadenopathy, and significantly increased lymphocytes in peripheral blood. The pathogenic mechanism of IM is still unclear; there is no effective treatment method for it, with mainly symptomatic therapies being available. The main question in EBV immunobiology is why only a small subset of infected individuals shows severe clinical symptoms and even develop EBV-associated malignancies, whilemost individuals are asymptomatic for life with the virus.
B cells are first involved in IM because EBV receptors are presented on their surface. Natural killer (NK) cells are cytotoxic innate lymphocytes that are important for killing EBV-infected cells. The proportion of CD4+ T cells decreases while that of CD8+ T cells expands dramatically during acute EBV infection, and the persistence of CD8+ T cells is important for lifelong control of IM. Those immune cells play important roles in IM, and their functions need to be identified separately. For this purpose, monocytes are separated first from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of IM individuals using CD14 microbeads, a column, and a magnetic separator.
The remaining PBMCs are stained with peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56, and APC anti-CD16 antibodies to sort CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and NK cells using a flow cytometer. Furthermore, transcriptome sequencing of five subpopulations was performed to explore their functions and pathogenic mechanisms in IM.

We describe a method combining immunomagnetic beads and fluorescence-activated cell sorting to isolate and analyze defined immune cell subpopulations of peripheral blood mononuclear cells (monocytes, CD4+ T cells, CD8+ T cells, B cells, and natural killer cells). Using this method, magnetic and fluorescently labeled cells can be purified and analyzed.

Separación de subpoblaciones de células inmunitarias en muestras de sangre periférica de niños con mononucleosis infecciosa

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

Periodontitis (PD) is a highly prevalent, chronic immune-inflammatory disease of the periodontium, that results in a loss of gingival soft tissue, periodontal ligament, cementum, and alveolar bone. In this study, a simple method of PD induction in rats is described. We provide detailed instructions for placement of the ligature model around the first maxillary molars (M1) and a combination of injections of lipopolysaccharide (LPS), derived from Porphyromonas gingivalis at the mesio-palatal side of the M1. The induction of periodontitis was maintained for 14 days, promoting the accumulation of bacteria biofilm and inflammation. To validate the animal model, IL-1&#946;, a key inflammatory mediator, was determined by an immunoassay in the gingival crevicular fluid (GCF), and alveolar bone loss was calculated using cone beam computed tomography (CBCT). This technique was effective in promoting gingiva recession, alveolar bone loss, and an increase in IL-1&#946; levels in the GCF at the end of the experimental procedure after 14 days. This method was effective in inducing PD, thus being able to be used in studies on disease progression mechanisms and future possible treatments.

Induction of Periodontitis via a Combination of Ligature and Lipopolysaccharide Injection in a Rat Model

In this study, a rat model of induction of periodontitis is presented via a combination of retentive ligature and repetitive injections of lipopolysaccharide derived from Porphyromonas gingivalis, over 14 days around the first maxillary molars. The ligation and LPS injection techniques were effective in inducing peridontitis, resulting in alveolar bone loss and inflammation.