El ganglio ciliar del pollo, es una estructura localizada en la parte posterior del ojo, adyacente al nervio óptico en la fisura coroides. Y las neuronas ganglionares ciliar, pertenecen al sistema nervioso parasimpático, y son neuronas colinérgicas, y por lo tanto pueden establecer sinapsis colinérgicas. El ganglio ciliar consiste en una enorme población de neuronas ciliares y neuronas coroideas, que son estructural y funcionalmente distintas.
Así que las neuronas ciliares inerva músculo intraocular, y las neuronas corooidales inerva el músculo del estado de ánimo en el ojo. Y durante los primeros días en la cultura, las neuronas ganglionares ciliares presentan una morfología multipolar, y después de estos, comienzan a pasar a un estado unipolar, donde una de las neuritas se extiende y forma el axón. Uno de los estudios más comunes con neuronas ganglionares ciliar, es un estudio de las sinapsis neuromusculares, que son sinapsis colinérgicas, y el uso de neuronas ganglionares ciliar se ha convertido en una buena alternativa, en comparación con modelos anteriores, debido al hecho de que la población neuronal obtenida, es homogénea en el sentido de que, todas las neuronas son colinérgicas, y así pueden establecer sinis , lo que no sucede cuando estamos trabajando con una población neuronal, que no es totalmente colinérgico.
La identificación y disección del ganglio ciliar puede ser bastante difícil para alguien que lo hace por primera vez, por lo que aquí proporcionamos un protocolo paso a paso, para la identificación y disección apropiada del ganglio ciliar, así como las pautas para el cultivo exitoso de estas neuronas. Para la preparación de los cubreobjetos, necesitará, cubreobjetos de vidrio de 13 milímetros, un recipiente resistente a los ácidos, 65%ácido nítrico, pinzas, agua Milli-Q, 75%etanol y un agitador orbital. La preparación de los cubreobjetos para cultivos primarios, debe hacerse dos días antes del procedimiento.
Coloque el número deseado de cubreobjetos de vidrio, dentro de un recipiente resistente a los ácidos, y agregue 65% ácido nítrico, hasta que todos los cubren los cubren. Coloque el recipiente en un agitador orbital e incubar durante la noche a temperatura ambiente con agitación. Al día siguiente, retire cuidadosamente el ácido nítrico y la estrella para su reutilización.
Lave los cubreobjetos, agregue agua Milli-Q al recipiente. Una vez más, colocando agitación durante 30 minutos, deseche la solución de lavado y repita este proceso cinco veces. Enjuague los cubreobjetos dos veces con 75%etanol.
Separe y coloque cuidadosamente los cubreobjetos individuales en un estante metálico, cubierto con papel de aluminio, e incubar a 50 grados, durante 10 a 15 minutos, o hasta que estén completamente secos. Esterilice los cubreobjetos en la luz UV, durante 10 a 15 minutos. Para el recubrimiento de los cubreobjetos, necesitará, cubreobjetos de vidrio estéril, una placa de 24 pozos, pinzas estériles, 0,1 miligramos por solución de PDL mililitro, agua estéril, un medio completo de 10 microgramos por mililitro de laminin, medio neurobasal liso y ganglio ciliar completo.
El recubrimiento de los cubreobjetos, debe hacerse el día antes del procedimiento. Usando una pinza estéril, coloque un cubreobjetos en cada pocóter de una placa de 24 pocillos, agregue 500 microlitros de solución de poli dializador, a una concentración de 0,1 miligramos por mililitro, e incubar durante la noche a 37 grados. Al día siguiente, lave los cubreobjetos tres veces con agua estéril, deseche el agua y agregue 350 microlitros de la solución de laminin a una concentración de 10 microgramos por mililitro a cada pozo.
Colocar en una incubadora, a 37 grados durante dos horas. Después de este tiempo, y antes del enchapado celular, retire la solución de laminin y lave dos veces con 300 microlitros de medio neurobasal liso. Agregue 300 microlitros de medio completo y colóquelos en una incubadora, a 37 grados y 5% co2, hasta que esté listo para chapar las celdas.
Para el procedimiento de disección, necesitará, huevos de pollo en el día embrionario siete, 75%etanol, fórceps de disección número 545 y número 55, tijeras, una cuchara, disección de platos petri con fondo negro y solución de HBSS helada. Asegúrese de esterilizar todas las herramientas de disección en 75%etanol. Los huevos deben almacenarse a 16 grados antes de ser incubados en una incubadora de óvulos, a 37,7 grados, durante siete días u otra etapa embrionaria deseada.
En el día del procedimiento, retire los huevos de la incubadora, rocíe los huevos con 75% de etanol. Consigue la parte superior del huevo usando una tijera, y saca cuidadosamente el embroy usando una cuchara. Coloque el embrión, en una placa de petri con solución HBSS helada, e inmediatamente separe la cabeza del cuerpo, cortando en la región del cuello.
A continuación, transfiera la cabeza a un nuevo plato de petri con solución HBSS helada limpia. Tan pronto como el embrión se retira del óvulo, es capaz de producir proteasas que son responsables de la muerte celular. Por lo tanto, es importante separar la cabeza del cuerpo lo más rápido posible, una vez que el embrión está fuera del óvulo para minimizar la muerte celular.
También es muy importante mantener la cabeza del embrión en solución HBSS helada. Sostenga la cabeza del embrión hacia arriba, y fijarla en el pico del polluelo, y luego comenzar a eliminar la capa delgada de piel alrededor del ojo. Con cuidado, retire el ojo girándolo suavemente lejos de la cabeza.
Y mientras separa el ojo de la cabeza de la pollita, observe que el nervio óptico está siendo seccionado. Mantenga el ojo con el lado posterior hacia arriba, y observe el ganglio ciliar, adyacente al nervio óptico del sensor y la fisura coroides. El nervio pregangliónico todavía podría estar unido al ganglio ciliar, facilitando su identificación.
Disecciona el ganglio ciliar, de cada ojo, y límpialo muy bien eliminando el exceso de tejido. Transfiera los ganglios diseccionados a un plato de petri con solución HBSS en hielo. Con el fin de tener un rendimiento de alrededor de 1 millón de células por mililitro, debe diseccionar alrededor de 70 ganglios, y también tener en cuenta que la población celular obtenida, también tiene células no neuronales, por lo que con el fin de disminuir el número de células no neuronales, y también para aumentar la pureza de su población neuranal, es importante limpiar los ganglios ciliar muy bien muy bien , eliminando todo el exceso de tejido.
Para la disociación de tejido, necesitará, una placa de 24 pozos, una solución de 0,1% de tripsina, un medio de ganglios ciliar incompleto, una pipeta de vidrio pulido contra incendios y una pipeta de plástico pasteur. Pre-mojar una pipeta de plástico estéril pasteur, y recoger todos los ganglios ciliar a un tubo de 15 ML, y centrifugar durante dos minutos a 200 Gs.Cuidadosamente, retirar todo el medio HBSS, utilizando una pipeta pasteur para eliminar un volumen mayor, y luego, cuando esté más cerca del pellet, utilice una pipeta micro. Añadir un mililitro de 0,1% de solución de tripsina, e incubar durante 20 minutos, a 37 grados en un baño de agua.
Centrifugar durante dos minutos, a 200 Gs.Inmediatamente, retire la solución de tripsina y agregue un mililitro de medio incompleto. El suero en el medio incompleto, detendrá inmediatamente la actividad de la trippsina. Centrifugar durante dos minutos, a 200 Gs, y retire todo el medio.
Añadir 500 microlitros de medio completo e iniciar la disociación del tejido con una micropipeta P1000. Comience por pipetear hacia arriba y hacia abajo, de 10 a 15 veces, y luego, cambie a una pipeta pasteur de vidrio pulido contra incendios, y de nuevo, pipetee hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces. La suspensión celular debe volverse borrosa, como un signo de disociación exitosa del tejido.
El volumen necesario para disociar las células depende del número de ganglios ciliar obtenidos en este, y del tamaño del pellet. Al pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar un tejido, es importante evitar la formación de burbujas de aire, esto minimizará la pérdida celular. Después de resuspending cells, puede dejar la suspensión celular sobre hielo hasta el enchapado.
Determinar la densidad celular utilizando una solución azul tripano, en la cámara neubauer. Esa suspensión de la célula de plomo en medio completo, con 5FTU, a la densidad deseada y placa 500 microlitros de células por pozo. Incubar células a 37 grados y 5%CO2.
Asegúrese de comprobar nuestro cultivo todos los días y seguir el desarrollo de las células. Las células ganglios ciliares se desarrollan bastante rápido in vitro, y después de un día, ya podemos ver algunas neuritas que se extienden desde el cuerpo celular. Después de siete a ocho días in vitro, la red neuronal está muy bien establecida, y las células se pueden mantener durante al menos 15 días.
Después de un día in vitro, las neuronas ganglionares ciliares muestran una mitología multipolar. Sin embargo, la extensión de las neuritas se produce rápidamente en las neuronas visiblemente establecida la red neuronal, ya después de 24 horas. In vitro, las neuronas ganglionares ciliar son responsables de la inervación del músculo en el ojo.
Y así, estas culturas neuronales.son muy adecuadas para el estudio de las sinapsis neuromusculares. Para esto, las neuronas ganglionares ciliares se pueden placar en la parte superior de las células musculares. Aquí, mostramos una cultura exitosa, del ojo vítreo, neuronas CG, en la parte superior del ojo V7 pollas musculares pectrales.
Marcador de vesícula sináptica, SV2, muestran sinapsis activas que se establecen entre las neuronas CG axones, y las fibras musculares, fácilmente identificadas por los múltiples núcleos. Las neuronas ganglionares ciliar obtenidas con este protocolo son adecuadas para ensayos de inmunocitoquímica, electrofisiología y supervivencia, entre otros. Este protocolo de disección, produce un número muy bajo de neuronas, pero si se hace correctamente, proporcionará la población pura de las neuronas colinérgicas.
Es muy importante que cada ganglio esté muy bien limpio y se extraiga el exceso de tejido. Para ello, se deben utilizar instrumentos de alta calidad, por lo que este tejido se puede extraer con el fin de evitar la contaminación por células no neuronales. La edad del embrión determinará el éxito de nuestro protocolo.
Idealmente, la disección debe realizarse entre E7 y E8. Este punto de tiempo es muy importante porque en esta etapa, la muerte celular del desarrollo que ocurre normalmente in vitro aún no se ha producido. Con el fin de minimizar la contaminación de estas células no neuronales, utilizamos 5FTU en los medios de cultivo para minimizar el crecimiento de células gliales y fibroblastos. Este modelo celular proporciona una excelente alternativa para estudiar su enfermedad nueromusclara.
Sobre la base de este protocolo, se pueden abordar preguntas científicas adicionales, por ejemplo, cómo la localización subcélula de carbonatos específicos y proteínas específicas regulan la formación y el funcionamiento de la sinapsis. Además, es bastante fácil establecer co-cultivos musculares nerviosos para abordar otras preguntas como el estudio de enfermedades neuromusculares.
