Este trabajo fue financiado por una beca del Centro para la Innovación en Prevención y Tratamiento de enfermedades de las vías de subvención, el NINDS (NS052574), y del Programa de Sandler para la Investigación del Asma.

1. Equipo Los componentes principales de un dispositivo de medición de la contracción se muestra esquemáticamente en la Figura 2A). <ol><li> Un baño de tejido. El baño de tejido mantiene una solución fisiológica oxigenada a temperatura caliente. Para ratones anillos traqueales, se utiliza un baño de 10 ml de tejido que contiene una camisa de agua para hacer circular una solución para el calentamiento, una entrada de vidrio poroso a oxígeno burbuja (95% / 5% de O 2 / CO 2 mezcla) y la entrada y salida para cambiar soluciones. Una solución PSS depósito se almacena con burbujeo constante de 95% / 5% de O 2 / CO 2 en una mezcla de 37 ° C baño de agua (no mostrado). Para los intercambios de solución, solución PSS se bombea desde el depósito a la entrada del baño de tejido (puerto inferior) en aproximadamente 100 ml por minuto para permitir el intercambio solución relativamente rápida. La salida solución es a través de un puerto de desbordamiento (puerto superior) que permite que el volumen constante (~ 10 ml) en el tejido murciélagoh durante la solución de intercambio. Utilizamos un circulador de calefacción Haake para bombear agua caliente a través de la camisa de baño de tejido (para mantener 37 ° C). Baños de tejidos puede obtenerse a partir de un número de proveedores y vienen en una variedad de tamaños y estilos para adaptarse a las necesidades experimentales del investigador. </li><li> Un transductor de fuerza. Para medir la tensión isométrica, el tubo de la tráquea se coloca sobre en forma de L extremos de dos varillas de acero inoxidable (Figura 2A). Se debe tener cuidado de utilizar un tipo de acero inoxidable que es compatible con el material biológico. La varilla superior está conectado a través de un clip a un transductor de fuerza isométrica. La varilla inferior contiene la tráquea en una posición fija, y está montado sobre un micrómetro para el ajuste de la tensión pasiva y / o la longitud del músculo. La contracción de la tráquea crea tensión en el transductor de fuerza, que se convierte en una señal de tensión en el preamplificador. La varilla inferior también puede ser configurado para incluir dos placas de platino rectangulares (4 mm de separación) t<html> sombrero de flanco de la tráquea (Figura 2B). Las placas de platino están conectados a un estimulador Grass S88 que permite la entrega de un campo eléctrico a través de la tráquea. Alambres abiertos y soldadura están recubiertos con Sylgard (Sylgard 184 elastómero de silicona, de Dow Corning Corp., Midland, MI), para evitar la lixiviación de los metales en la solución del baño. </li><li> A / D de software de conversión, y la adquisición de equipo. Las señales de los preamplificadores se registran en una MacLab 8 sistema de A / D. Se trata de una versión anterior de la ADInstrument actual de hardware Powerlab. Utilizamos la Tabla de programa (ADInstruments) que permite el registro continuo de la tensión durante todo el experimento. Generación de tensión muscular tráquea es muy lenta, y por lo tanto, nos encontramos con que la adquisición de 100 puntos por segundo es adecuada. La medición de la tensión se calibra utilizando pesos conocidos (hasta 5 gramos) antes de cada experimento. Sistemas similares están disponibles en vendedores de otros (por ejemplo, Biopac, Instrumentos de GW). </li></ol>título &quot;&gt; 2. Tráquea aislamiento <ol><li> Antes de aislamiento tejido del transductor de fuerza está calibrada con pesos conocidos, y el baño de tejido se llena con PSS normales (ver Tabla I). La entrada de aire se ajusta para obtener un flujo de luz de O 2 / CO 2. </li><li> Las tráqueas de dos meses o los ratones más viejos son óptimas. Los animales más jóvenes pueden ser usados, pero tráqueas obtenidos a partir de estos requieren una mayor habilidad para montar en los cables del transductor de fuerza, debido a su pequeño tamaño. Antes de la disección, los ratones están profundamente sedado con isoflurano. El nivel apropiado de sedación se alcanza cuando un dedo del pie-pellizco con fórceps es incapaz de provocar una respuesta. Los ratones son inmediatamente sacrificados por dislocación cervical Una nota importante:. Hemos observado que Avertin (tribromoetanol), un sedante comúnmente utilizado en los ratones, tiene fuertes efectos relajantes sobre el músculo liso bronquial y por lo tanto no deben ser utilizados para estudios de contracción tráquea. </li><li> La piel (y de la piel) se retira del tórax a la garganta. RIBS se cortan de la base del esternón, lateralmente (en ambos lados) a la parte superior del corazón. El esternón y las costillas luego se tira hacia delante en la garganta para revelar el corazón / pulmones, la tráquea, el timo (ventral) y el esófago (que se adjunta a - y dorsal a la tráquea). </li><li> La tráquea se escinde por corte por debajo de la bifurcación bronquial y por encima de la faringe. La tráquea se coloca en un helado oxigenada (95/5) solución PSS (composición dada en la Tabla I). </li><li> La tráquea se diseca limpia de los tejidos circundantes. Durante la limpieza, la tráquea se llevará a cabo en la faringe o por debajo de la bifurcación. Sin embargo, se debe tener cuidado de no aplicar directamente la pinza a la propia tráquea. Tijeras finas se pueden utilizar para cortar los tejidos circundantes, pero el corte debe hacerse siempre paralela a la tráquea para evitar daños. Esta parte del procedimiento se facilita si la preparación tráquea se fija debajo de la bifurcación y por encima de la faringe en un plato Sylgard recubierto (184 Sylgard siliconaElastómero, Dow Corning Corporation, Midland, MI). </li><li> Después de retirar el tejido circundante, la tráquea se corta por debajo de la faringe y encima de la bifurcación bronquial y suavemente montado sobre los cables de fuerza del transductor. </li><li> La tráquea se coloca sobre dos dientes de metal en forma de L (Figura 2A). Una púa está conectado a un transductor de fuerza-desplazamiento para el registro continuo de la tensión isométrica. Otra clavija está conectada a un micrómetro. El baño de tejido se eleva entonces a fin de que la tráquea se sumerge en PSS. Montaje de la tráquea se debe hacer tan pronto como sea posible para minimizar el tiempo en que la tráquea se llevan a cabo fuera de PSS. Con la práctica, el montaje de la tráquea se puede hacer en un minuto, pero por lo general evitar veces más de 3 minutos para evitar la pérdida de viabilidad. </li><li> El micrómetro se ajusta lentamente para obtener una tensión pasiva de ~ 10 mN (~ 1 gramo-fuerza). La tensión de reposo óptima se determina empíricamente y hemos encontrado que la tensión pasiva de ~ 5 a 10 mN resulta en una respuesta equivalente, a la estimulación máxima de niveles altos de potasio. Esto es consistente con un número de otros estudios que utilizan una tensión pasiva en este rango de 16,17,18. Durante los primeros 5-10 minutos, la tensión tráquea pasiva tiende a disminuir algo (tensión-relajación fenómeno) y el micrómetro se utiliza para ajustar la tensión pasiva a ~ 10 mN durante equilibración. La tráquea se deja equilibrar durante al menos 1 hora antes de desafíos experimentales. </li></ol> 3. La estimulación de potasio de alta Después del equilibrio, la tráquea es desafiado dos veces con una solución de potasio PSS alta (67 mM de KCl, Tabla I). La contracción generalmente requiere minutos ~ 5-10 para alcanzar el estado estacionario en cuyo momento el baño de tejido se enjuaga varias veces con PSS normales para relajarse completamente la tráquea. La contracción de potasio se repite una segunda vez, y una tercera vez (si es necesario) hasta que las contracciones reproducibles se obtienen. <pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. La contracción evocada por la estimulación eléctrica La tráquea está flanqueada por dos placas rectangulares de platino (electrodos) que permiten la estimulación de campo eléctrico (EFS) para la preparación. La respuesta contráctil a SSC es una función de la frecuencia y voltaje. También se ve afectado por parámetros físicos tales como el área de los electrodos y la distancia entre ellos. Las características de potencia del estimulador también afectan a este tipo de respuestas que a voltajes más altos y los resultados actuales del estimulador puede llegar a su máximo. Las características de cualquier sistema EFI se debe determinar mediante el examen de las respuestas contráctiles del músculo en las diferentes duraciones de estímulo, frecuencias, voltajes y duración del pulso. Para nuestra configuración experimental, hemos encontrado que los electrodos separados por ~ 4 mm, y la amplitud de estimulación de 44 V (0,5 ms pulsos) y 30 Hz son óptimas para lograr reproducibles casi máxima respuestas contráctiles. 5. Contracción Evoked por la estimulación colinérgica La capacidad de respuesta de la tráquea a exógenamente compuestos aplicados se evalúa ya sea mediante la adición de una dosis única del fármaco de interés o, mediante adiciones múltiples de la droga en una forma dosis acumulativa. Para la tráquea, nuestro laboratorio utilizan habitualmente carbacol para activar los receptores colinérgicos, porque, a diferencia de la acetilcolina, carbacol no es degradada por la acetilcolinesterasa. Un razonable de la dosis-respuesta es de 10 -8 a 10 -5 M carbacol. Montaje de la sesión [carbacol]-contráctil curva de respuesta con una ecuación de Hill-tipo permite una estimación de la CE 50 (mitad de la máxima concentración efectiva) que es una medida de la sensibilidad de la contracción traqueal para el agonista colinérgico 19. Vale la pena señalar que una determinada dosis de carbacol dará una respuesta ligeramente mayor que una dosis única de formar parte de una curva dosis-respuesta acumulativa. 6. Los resultados representativos </p&gt; Un ejemplo de una respuesta contráctil al potasio alta se muestra en la Figura 3A. La contracción alcanza un máximo en los 10 minutos, pero pueden mostrar un ligero descenso a partir de entonces. Durante lavado precoz de potasio, el músculo puede mostrar un aumento transitorio de la contracción que se debe a un descenso de la temperatura como el pequeño volumen de solución PSS sin calefacción en las líneas de solución transitoriamente perfunde la preparación. Esto puede ser minimizado por tener un volumen muerto mínimo en el tubo que conecta el depósito PSS calentada y baño de tejidos, y también mediante el intercambio de solución relativamente rápida (en general que bombear soluciones a 100 ml / min). Cada preparación tendrá algunas diferencias en la respuesta contráctil, debido a las diferencias en la masa muscular o daños sufridos durante la disección. Figura 3B muestra dos tráqueas de la masa muscular diferente desafiados con niveles altos de potasio y carbacol. A pesar de las contracciones colinérgica-evocados diferentes, ely son similares después de la normalización de la respuesta con una solución de potasio (Figura 3C). La Figura 4 muestra un ejemplo de un carbacol (colinérgico) contracción evocada utilizando dosis únicas (A) y un incremento acumulativo (B). Las soluciones de carbacol se añaden directamente a la bañera y el gas burbujeado ayuda en la mezcla rápida. Cabe señalar que la adición de una dosis única (es decir, 1 mM, Figura 4A) tiene una respuesta ligeramente mayor que la concentración equivalente durante un acumulativo curva dosis-respuesta (1 mM, Figura 4B). 4C figura muestra un gráfico de fuerza de contracción como una función de las concentraciones de carbacol utilizando datos de la Figura 4B. Efectos de carbacol saturan a 10 M de concentración -5. Aunque los agonistas colinérgicos inicia la contracción a través de mecanismos de liberación de calcio, un componente sustancial de la contracción también está mediada por la despolarización yactivación de los canales de calcio dependientes de voltaje 20. Figura 5 muestra un ejemplo de EFS-evocó las contracciones. Las tráqueas son estimulados con 0,5 milisegundos de duración, 40 voltios pulsos hasta que las contracciones alcanzan una meseta (ver recuadro A1). Un aumento en la frecuencia de estimulación provoca un aumento de la respuesta contráctil (frecuencia curva de respuesta se representa en la Figura 5B). Estimulación de campo eléctrico se ha demostrado que evocan contracciones predominantemente mediante la activación de los nervios presinápticos. Prueba de ello es el efecto de la toxina botulínica, un bloqueador de la liberación del neurotransmisor que bloquea la mayoría de las contracciones provocadas por EFS de la tráquea 21. Por otra parte, la tetrodotoxina, un agente que bloquea los canales de Na + también inhibe la actividad de los nervios y elimina la respuesta de la tráquea a la EFS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de tque las principales vías de señalización en una preparación de la tráquea aislada. Se muestra un terminal de axón colinérgico inervan una célula traqueal músculo liso. Las principales vías de señalización son M3 y M2-muscarínico activación del receptor de acetilcolina (mAChR) que causan la liberación de calcio a través de receptores IP3 (M3) y la reducción de cAMP (M2). Los receptores M2 (y alguna contribución de los receptores M3) también pueden causar la despolarización colinérgico-evocó que activa los canales de tipo L de calcio dependientes de voltaje y el influjo de calcio. Comunes agentes contráctiles y sus efectores son 1. ricos en potasio (despolarizan la célula del músculo liso y axón colinérgico), 2. la estimulación de campo eléctrico (EFS, despolariza colinérgica axón) y 3. aplicación exógena de agentes colinérgicos tales como la acetilcolina o carbacol (activa los receptores muscarínicos directamente). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> Figura 2. Diagrama del equipo utilizado para medir las contracciones traqueales. A. El transductor de fuerza, micrómetros y baño de tejido están montados en barras de apoyo por medio de abrazaderas de tornillo. El anillo traqueal se coloca sobre las barras superior e inferior. En el diagrama, el baño de tejido se coloca debajo de la preparación (es decir, durante el montaje de la tráquea sobre el transductor de fuerza). Durante los estudios de contracción, el baño de tejido se mueve verticalmente para bañar la preparación. B. Para la estimulación campo eléctrico de la barra inferior se modifica para incluir dos placas de platino que están montados lateralmente al alambre explotación tráquea. Las placas de platino están conectados por cables eléctricos a un estimulador. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> Figura 3. Ejemplos de potasio (67 mm) de respuesta contráctil de la tráquea. (A) muestra respuestas duplicadas y reproducibles a niveles altos de potasio. (B) Ejemplos de respuesta contráctil a carbachol de dos tráqueas diferentes. (C) Las respuestas a las tráqueas en B son similares cuando se normalizand para la respuesta de potasio alto. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> Figura 4. Ejemplos de carbacol contracciones inducidas. (A) carbachol contracciones inducidas con dosis únicas seguido de lavado. (B) Ejemplo acumulativo curva dosis-respuesta para la tráquea en A. (C) contracciones pico de B se representan como una función de la concentración de carbacol. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> Figura 5. Ejemplos de las contracciones provocadas por la estimulación de campo eléctrico. (A) la estimulación de campo eléctrico de la tráquea gracias a la contracción de 0,5 ms de pulso, 40 voltios, y varias frecuencias de estimulación, como se indica. El recuadro es el tiempo de contracción-expansión a 30 Hz. (B) las contracciones máximas de A son plotted como una función de la frecuencia de estimulación. PSS normales <table border="1"><tbody><tr><td> Sal </td><td> Conc. (MM) </td><td> Cantidad (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 119 </td><td> 13,91 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 4.7 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,18 </td><td> 0,32 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> 1,17 </td><td> 0,58 </td></tr><tr><td> NaHCO $ 3 </td><td> 18 </td><td> 3,02 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 0,026 </td><td> 0,1 ml de 0,5 M </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 11 </td><td> 3,96 </td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> 12,5 </td><td> 8,56 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 400 ml de 10 mM </td></tr></tbody></table> High K + PSS (NACL y ajustes KCl) <table border="1"><tbody><tr><td> Sal </td><td> Conc. (MM) </td><td> Cantidad (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 56,7 </td><td> 6,628 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 67 </td><td> 9,991 </td></tr></tbody></table> . Tabla 1 Receta para soluciones PSS. Nota: Las soluciones son frescas por semana, con agua ultrapura de calidad y se almacenan en un refrigerador por no más de 5 días para evitar la contaminación de crecimiento.

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T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle.">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li><li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP,+and+PGE2.">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li><li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+(ET(B))+receptor+knockout+mice.">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li><li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M(3)-receptor+knockout+mice:+muscarinic+receptor+function+in+atria,+stomach+fundus,+urinary+bladder,+and+trachea.">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li><li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder.">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li><li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction.">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li><li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"classical"+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice.">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo que aquí se presenta ofrece una preparación fisiológica para evaluar la función muscular vías respiratorias. Por lo general, operan 3-4 preparaciones para el baño de órganos al mismo tiempo, sin embargo, los sistemas de envasados ​​están disponibles en una serie de proveedores que permiten la medición simultánea de hasta 8 preparaciones (ADInstruments, Instrumentos del Mundo de precisión y aparatos de la Universidad de Harvard). Hemos utilizado una serie de transductores de fuerza y ​​ba?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Convertidor analógico-digital </td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 4/35 </td><td></td></tr><tr><td> Carbacol (cloruro de Carbamoylcholine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4832 </td><td> 10 -2 M en agua (alícuotas pueden ser almacenadas a -20 ° C) </td></tr><tr><td> Gráficos de Software </td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Termostato de circulación </td><td> Haake </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Transductor de fuerza isométrica </td><td> Kent Científico </td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td> Estimulador </td><td> Tecnologías de la hierba </td><td> S88 Squ salida dualEstimulador de pulsos son </td><td></td></tr><tr><td> Papel higiénico </td><td> IPM </td><td> 47264 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro measurements of tracheal constriction using mice

Transgénicos y ratones knock-out han sido herramientas poderosas para la investigación de la fisiología y la fisiopatología de las vías respiratorias 1,2. En tensometry in vitro de aislados traqueal preparativos ha demostrado ser una prueba útil de músculo liso bronquial (ASM) la respuesta contráctil en ratones modificados genéticamente. Estas preparaciones in vitro traqueales son relativamente simples, dar una respuesta contundente, y retener a los dos terminaciones nerviosas colinérgicas funcionales y las respuestas musculares, incluso después de incubaciones largas. Tensometry traqueal también proporciona un ensayo funcional para estudiar una variedad de vías de segundo mensajero de señalización que afectan a la contracción del músculo liso. La contracción de la tráquea está mediado principalmente por los nervios parasimpáticos, los colinérgicos que la liberación de acetilcolina en ASM (Figura 1). Los principales receptores de acetilcolina son ASM muscarínicos M2 y M3, que son G E / S y los receptores acoplados a Gq, respectivamente <sup&gt; 3,4,5. Receptores M3 evocan la contracción por el acoplamiento a Gq para activar la fosfolipasa C, el aumento de la producción de IP3 y el IP3 mediada por la liberación de calcio desde el retículo sarcoplásmico 3,6,7. M2 / G i / o señalización se cree que mejora las contracciones por la inhibición de la adenilato ciclasa que conduce a una disminución en los niveles de AMPc 5,8,9,10. Estas vías constituyen el llamado &quot;fármaco-contracción de acoplamiento&quot; de músculo liso bronquial 11. Además, la señalización a través de receptores colinérgicos M2 (y modulada por M3 señalización) implica vías que despolarizan la ASM que a su vez activar tipo L, dependientes de voltaje canales de calcio (Figura 1) y el influjo de calcio (llamado &quot;acoplamiento excitación-contracción&quot; ) 4,7. Revisiones más detalladas sobre las vías de señalización que controlan la constricción vía aérea se puede encontrar 4,12. Las vías superiores parecen ser conservadas entre los ratones y otras especies. Sin embargo, tráqueas de ratón difieren de otras especies in algunas vías de señalización. El más destacado es la falta de respuesta contráctil a la histamina y adenosina 13,14, los moduladores ASM bien conocidas en los seres humanos y otras especies 5,15. Aquí se presentan los protocolos para el aislamiento de murinos anillos traqueales y la medición in vitro de su producción contráctil. Se incluyen descripciones de la configuración del equipo, el aislamiento de la tráquea y el anillo de las medidas de contracción. Se dan ejemplos para evocar contracciones indirectamente mediante la estimulación de alta de potasio de los nervios y directamente por despolarización del músculo ASM para activar tensión dependiente de la afluencia de calcio (1. Alto K +, Figura 1). Además, los métodos se presentan para estimulaciones de nervios solamente utilizando la estimulación de campo eléctrico (2. SSC, Figura 1) la estimulación, o para directo de músculo ASM utilizando neurotransmisor exógena aplicada al baño (3. Exógeno ACH, Figura 1). Esta flexibility y facilidad de preparación hace que el modelo aislado tráquea anillo un ensayo robusto y funcional para un número de cascadas de señalización que intervienen en la contracción del músculo liso bronquial.

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Los ratones transgénicos han sido extremadamente útiles en atribuir la función fisiológica de los genes. Como este tipo de investigación, en general, y los estudios funcionales de las vías respiratorias, en particular, han experimentado un notable cambio hacia modelos murinos. A continuación presentamos los protocolos para<em&gt; In vitro</em&gt; Estudios de la tráquea de constricción para evaluar la función del músculo liso en las vías respiratorias de ratón.

Mediciones in vitro de la constricción de la tráquea Utilizando ratones

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

20.6K vistas.  UT Health Science Center, San Antonio. Los ratones transgénicos han sido extremadamente útiles en atribuir la función fisiológica de los genes. Como este tipo de investigación, en general, y los estudios funcionales de las vías respiratorias, en particular, han experimentado un notable cambio hacia modelos murinos. A continuación presentamos los protocolos para In vitro Estudios de la tráquea de constricción para evaluar la función del músculo liso en las vías respiratorias de ratón...

Video: In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of the population1,2. Symptoms include spontaneous (tingling, burning, electric-shock like) pain, dysaesthesia, paraesthesia, allodynia (pain resulting from normally non-painful stimuli) and hyperalgesia (an increased response to painful stimuli). The sensory symptoms are co-morbid with behavioural disabilities, such as insomnia and depression. To study chronic neuropathic pain several animal models mimicking peripheral nerve injury have been developed, one of the most widely used is Bennett and Xie's (1988) unilateral sciatic nerve chronic constriction injury (CCI)3 (Figure 1). Here we present a method for performing CCI and testing pain hypersensitivity.
CCI is performed under anaesthesia, with the sciatic nerve on one side exposed by making a skin incision, and cutting through the connective tissue between the gluteus superficialis and biceps femoris muscles. Four chromic gut ligatures are tied loosely around the sciatic nerve at 1 mm intervals, to just occlude but not arrest epineural blood flow. The wound is closed with sutures in the muscle and staples in the skin. The animal is then allowed to recover from surgery for 24 hrs before pain hypersensitivity testing begins.
For behavioural testing, rats are placed into the testing apparatus and are allowed to habituate to the testing procedure. The area tested is the mid-plantar surface of the hindpaw (Figure 2), which falls within the sciatic nerve distribution. Mechanical withdrawal threshold is assessed by mechanically stimulating both injured and uninjured hindpaws using an electronic dynamic plantar von Frey aesthesiometer or manual von Frey hairs4. The mechanical withdrawal threshold is the maximum pressure exerted (in grams) that triggers paw withdrawal. For measurement of thermal withdrawal latency, first described by Hargreaves et al (1988), the hindpaw is exposed to a beam of radiant heat through a transparent glass surface using a plantar analgesia meter5,6. The withdrawal latency to the heat stimulus is recorded as the time for paw withdrawal in both injured and uninjured hindpaws. Following CCI, mechanical withdrawal threshold, as well as thermal withdrawal latency in the injured paw are both significantly reduced, compared to baseline measurements and the uninjured paw (Figure 3). The CCI model of peripheral nerve injury combined with pain hypersensitivity testing provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to modify chronic neuropathic pain. In our laboratory, we utilise CCI alongside thermal and mechanical sensitivity of the hindpaws to investigate the role of neuro-immune interactions in the pathogenesis and treatment of neuropathic pain.

Due to the simplicity of surgery and the robust behavioural outcome, chronic constriction of the sciatic nerve is one of the pre-eminent animal models of neuropathic pain. Within 24 hrs following surgery, pain hypersensitivity is established and can be quantitatively measured using a von Frey aesthesiometer (mechanical test) and plantar analgesia meter (thermal test).

La constricción crónica del nervio ciático y pruebas de hipersensibilidad dolor en ratas

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of ...

Investigación

Medicina

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart failure. Here, we describe a detailed surgical procedure for creating pressure overload and cardiac hypertrophy in rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. After anesthesia, the trachea is intubated by inserting a cannula through a half way incision made between two cartilage rings of trachea. Then a skin incision is made at the level of the second intercostal space on the left chest wall and muscle layers are cleared to locate the ascending portion of aorta. The ascending aorta is constricted to 50&#8211;60% of its original diameter by application of a small sized titanium clip. Following aortic constriction, the second and third ribs are approximated with prolene sutures. The tracheal cannula is removed once spontaneous breathing was re-established. The animal is allowed to recover on the heating pad by gradually lowering anesthesia. The intensity of pressure overload created by constriction of the ascending aorta is determined by recording the pressure gradient using trans-thoracic two dimensional Doppler-echocardiography. Overall this protocol is useful to study the remodeling events and contractile properties of the heart during the gradual onset and progression from compensated cardiac hypertrophy to heart failure stage.

We describe a stepwise procedure for creating pressure overload and left ventricular hypertrophy in Wistar rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. This model is extensively used for studying remodeling changes during cardiac hypertrophy and for identifying and evaluating strategies for regression of such changes.

Ascendente aórtica Constricción en ratas para la Creación de la sobrecarga de presión hipertrofia cardíaca Modelo

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

A Model of Cardiac Remodeling Through Constriction of the Abdominal Aorta in Rats

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Un modelo de remodelamiento cardiaco A través de la constricción de la aorta abdominal en ratas

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

La constricción aórtica mínimamente invasiva transversal en ratones

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Técnica mínimamente invasiva constricción aórtica transversal en ratones para la inducción de la hipertrofia Ventricular izquierda

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo la detección de la mitofagia en células humanas, C. Elegansy los ratones

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to perform a partial thoracotomy to visualize the transverse aortic arch. However, the surgical trauma caused by the thoracotomy in open-chest models changes the respiratory physiology as the ribs are dissected and left unattached after chest closure. To prevent this, we established a minimally invasive, closed chest approach via lateral thoracotomy. Herein we approach the aortic arch via the 2nd intercostal space without entering the chest cavities, leaving the mouse with a less traumatic injury to recover from. We perform this operation using standard laboratory settings for open chest TAC procedures with equal survival rates. Apart from maintaining physiological breathing patterns due to the closed chest approach, the mice seem to benefit by showing rapid recovery, as the less invasive technique appears to facilitate a fast healing process and to reduce immune response after trauma.

Here, we present a protocol of Transverse Aortic constriction (TAC) via a lateral thoracotomy. This technique is a minimally invasive, closed chest surgical procedure aiming to simulate pressure overload and heart failure in mice utilizing standard TAC laboratory settings.

Un modelo del cerrado-pecho para inducir constricción aórtica transversal en ratones

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Evaluación In Vitro de la Función Cardíaca usando Cardiomiocitos Pielados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Sleeve Gastrectomy in Mice using Surgical Clips

The number of people who are overweight and obese is continually increasing both in the adult and adolescent populations. This coincides with the increased universal phenomenon of type 2 diabetes (T2D) and other metabolic problems. Bariatric surgery, such as SG, is currently one of the most effective and commonly used long-term treatment for obesity and T2D, but the association between them is not completely explored yet. The mechanisms underlying the outcomes seen after bariatric surgery in humans can be investigated based on preclinical animal studies. The SG reduces body weight, glucose levels and many metabolic parameters, and is easy to perform with a low incidence of complications. The goal of this work is to provide a simple method and an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery in animals for researchers.

The prevalence of diabetes and obesity is continuously increasing worldwide. The mechanisms between diabetes, obesity and their associated mortality and co-morbidities need to be further investigated. Here, we present a protocol for sleeve gastrectomy (SG) in animals as an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery.