Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da parte del Centro per l&#39;Innovazione nella prevenzione e nel trattamento delle malattie delle vie aeree, NINDS sovvenzione (NS052574), e dal Programma per la Ricerca Sandler asma.

1. Attrezzatura I componenti principali di un dispositivo di misurazione contrazione sono mostrate schematicamente in figura 2A). <ol><li> Un bagno tessuto. Il bagno tessuto mantiene una soluzione ossigenata fisiologica a temperatura calda. Per topi anelli trachea, si usa un bagno tessuto 10 ml contenente una camicia d&#39;acqua per la circolazione di una soluzione di riscaldamento, un ingresso di vetro sinterizzato a bolle di ossigeno (95% / 5% O 2 / CO 2 miscela) e di ingresso e di uscita per cambiare soluzioni. Una soluzione PSS serbatoio viene memorizzato a ebollizione costante del 95% / 5% O 2 / CO 2 in miscela a 37 ° C in bagno di acqua (non mostrato). Per gli scambi, soluzione PSS viene pompata dal serbatoio verso l&#39;ingresso bagno tessuto (porta inferiore) a circa 100 ml al minuto per consentire lo scambio di soluzione relativamente veloce. La soluzione è presa attraverso una porta troppopieno (apertura superiore) che permette volume costante (~ 10 ml) nel tessuto del bloccoh durante la soluzione di scambio. Usiamo un circolatore Haake riscaldamento per pompare acqua calda attraverso la camicia bagno di tessuto (per mantenere 37 ° C). Bagni dei tessuti può essere ottenuto da una serie di fornitori e sono disponibili in una varietà di formati e stili per soddisfare le esigenze sperimentali del ricercatore. </li><li> Un trasduttore di forza. Per misurare la tensione isometrica, il tubo trachea viene infilato su L-forma estremità di due barre di acciaio inossidabile (Figura 2A). Si deve prestare attenzione ad utilizzare un tipo di acciaio inossidabile che è compatibile con materiale biologico. L&#39;asta superiore è collegato tramite una clip a un trasduttore di forza isometrica. L&#39;asta inferiore contiene la trachea in una posizione fissa, ed è montato su un micrometro per la regolazione della tensione passiva e / o lunghezza del muscolo. Contrazione della trachea crea tensione sul trasduttore di forza, che viene convertito in un segnale di tensione al preamplificatore. L&#39;asta inferiore può anche essere configurato per includere due piastre rettangolari platino (4 mm di distanza) t<html> cappello fianco della trachea (Figura 2B). Le piastre platino sono collegati ad uno stimolatore Grass S88 che consente l&#39;erogazione di un campo elettrico attraverso la trachea. Fili aperti e saldatura sono rivestiti con Sylgard (Sylgard 184 elastomero di silicone, Dow Corning Corp, Midland, MI), per evitare la lisciviazione dei metalli nella soluzione del bagno. </li><li> A / D converter software, computer e acquisizione. Segnali provenienti dai preamplificatori sono registrati su un MacLab 8 A / D del sistema. Questa è una versione precedente di hardware corrente ADInstrument PowerLab. Usiamo il programma grafico (ADInstruments) che consente la registrazione continua della tensione in tutto l&#39;esperimento. Generazione di tensione del muscolo trachea è piuttosto lento, e quindi troviamo che l&#39;acquisizione di 100 punti al secondo è sufficiente. La misura della tensione viene calibrato utilizzando pesi noti (fino a 5 grammi) prima di ogni esperimento. Sistemi simili sono disponibili presso i venditori di altri (ad esempio, BIOPAC, Instruments GW). </li></ol>titolo &quot;&gt; 2. Trachea isolamento <ol><li> Prima di isolamento tessuto il trasduttore di forza viene calibrato con pesi noti, e il bagno tessuto viene riempito con PSS normali (vedi Tabella I). L&#39;entrata dell&#39;aria è regolata per ottenere un flusso di luce di O 2 / CO 2. </li><li> Trachee da due mesi o topi più anziani sono ottimali. I piccoli animali possono essere usati ma trachee ottenuti da questi richiedono una maggiore abilità da montare sui cavi dei trasduttori di forza a causa delle loro piccole dimensioni. Prima di dissezione, i topi sono profondamente sedato con isoflurano. Il livello adeguato di sedazione viene raggiunto quando un dito-pinch con pinza è in grado di suscitare una risposta. I topi sono immediatamente sacrificati mediante dislocazione cervicale Una nota importante:. Abbiamo osservato che Avertin (Tribromoethanol), un sedativo comunemente usato nei topi, ha forti effetti rilassanti sulla muscolatura liscia delle vie aeree e, pertanto, non deve essere utilizzato per gli studi di contrazione trachea. </li><li> La pelle (e in pelliccia) viene rimosso dal torace alla gola. Ribs sono tagliati dalla base dello sterno, lateralmente (su entrambi i lati) all&#39;inizio del cuore. Lo sterno e le costole sono poi tirato in avanti alla gola per rivelare il cuore / polmoni, timo, trachea (ventrale) ed esofago (allegata al - e dorsale a trachea). </li><li> La trachea viene asportata tagliando la biforcazione bronchiale sotto e sopra la faringe. La trachea viene inserito in un gelido ossigenato (95/5) soluzione di PSS (composizione indicata nella tabella I). </li><li> La trachea è sezionato pulizia dei tessuti circostanti. Durante la pulizia, la trachea può essere tenuto alla faringe o al di sotto della biforcazione. Tuttavia, si deve fare attenzione a non applicare direttamente le pinze alla stessa trachea. Forbici Belle può essere usato per tagliare tessuti circostanti, ma il taglio deve essere effettuato sempre parallelo alla trachea per evitare danni. Questa parte della procedura è facilitata se la preparazione trachea è bloccato sotto la biforcazione e sopra la faringe su un Sylgard rivestita piatto (Sylgard 184 SiliconeElastomero, Dow Corning Corp, Midland, MI). </li><li> Dopo aver rimosso il tessuto circostante, la trachea è tagliato sotto la faringe e sopra la biforcazione bronchiale e delicatamente montato su fili trasduttori di forza. </li><li> La trachea viene infilato su due a forma di L uncini metallici (Figura 2A). Un rebbio è collegato ad un trasduttore forza-spostamento per la registrazione continua della tensione isometrica. Un altro polo è collegato ad un micrometro. Il bagno tessuto viene quindi sollevato in modo che la trachea è immerso in PSS. Montaggio della trachea dovrebbe essere fatto più rapidamente possibile per ridurre il tempo trachea si tengono fuori di PSS. Con la pratica, il montaggio della trachea può essere fatto in un minuto ma in genere evitare di volte di più di 3 minuti per evitare la perdita di vitalità. </li><li> Il micrometro viene regolato lentamente per ottenere una tensione passiva di ~ 10 mN (~ 1 grammo-forza). La tensione ottimale di riposo è stata determinata empiricamente e abbiamo trovato che la tensione passiva di circa 5-10 risultati mN in un equivalente, massima risposta ad alta stimolazione di potassio. Questo è coerente con un numero di altri studi che utilizzano una tensione passiva in questo intervallo 16,17,18. Nei primi 5-10 minuti, trachea tensione passiva tende a scendere leggermente (stress-rilassamento fenomeno) e il micrometro viene utilizzato per regolare la tensione passiva a ~ 10 mN durante equilibrazione. La trachea è lasciato equilibrare per almeno 1 ora prima sfide sperimentali. </li></ol> 3. Alta stimolazione di potassio Equilibrazione seguito, la trachea è sfidato due volte con una soluzione di alta PSS di potassio (67 mM KCl, Tabella I). La contrazione generalmente richiede 5-10 minuti per raggiungere ~ steady-state in quel momento il bagno tessuto è risciacquato più volte con PSS normali per rilassarsi completamente la trachea. La contrazione potassio viene ripetuto una seconda volta, e una terza volta (se necessario) fino contrazioni riproducibili. <pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Contrazione evocati dalla stimolazione elettrica La trachea è fiancheggiato da due piastre rettangolari platino (elettrodi) che permettono la stimolazione di campo elettrico (EFS) alla preparazione. La risposta contrattile alla EFS è una funzione della frequenza e tensione. Esso è inoltre influenzata da parametri fisici quali la superficie degli elettrodi e la distanza tra loro. Le caratteristiche di potenza del stimolatore anche influenzare la risposta tali che a tensioni superiori e uscite di corrente lo stimolatore può raggiungere il suo massimo. Le caratteristiche di ogni sistema EFS dovrebbe essere determinata esaminando le risposte muscolari contrattili a diverse durate di stimolo, frequenze, tensioni e durate di impulso. Per il nostro setup sperimentale, abbiamo scoperto che gli elettrodi separati da ~ 4 mm, ampiezza e la stimolazione di 44 V (0,5 ms impulsi) e di 30 Hz è ottimale per raggiungere riproducibili risposte contrattili quasi massimi. 5. Contrazione Evoked dalla stimolazione colinergica La reattività della trachea di esogena composti applicati è valutata mediante aggiunta di una singola dose del farmaco di interesse o, con aggiunte multiple del farmaco in modo dose cumulativa. Per la trachea, il nostro laboratorio solitamente usata carbacolo per attivare i recettori colinergici, perché, a differenza di acetilcolina, carbacolo non è degradato dalla acetilcolinesterasi. Una ragionevole dose-risposta è compreso tra 10 -8 a 10 -5 M carbacolo. Montaggio del registro [carbacolo] contrattile curva di risposta con uno di tipo Hill-equazione consente una stima della CE 50 (mezza raggiungere la massima concentrazione efficace) che è una misura della sensibilità di contrazione tracheale per l&#39;agonista colinergico 19. Vale la pena notare che una data dose di carbacolo darà una risposta leggermente maggiore in dose singola che come parte di una curva di risposta alla dose cumulativa. 6. Risultati rappresentativi </p&gt; Un esempio di una risposta contrattile di potassio è mostrata in Figura 3A. La contrazione raggiunge un massimo in circa 10 minuti, ma può mostrare un lieve calo negli anni successivi. Durante il lavaggio iniziale di potassio, il muscolo può mostrare un aumento transitorio di contrazione che è causa di una caduta nella temperatura del piccolo volume di soluzione PSS riscaldato nelle linee soluzione perfusione transitoriamente la preparazione. Questo può essere minimizzata con un volume morto minimo nella tubazione che collega il serbatoio riscaldata PSS bagno e tessuti, e anche attraverso lo scambio di soluzione relativamente velocemente (generalmente si pompa soluzioni a 100 ml / min). Ogni preparazione avrà alcune differenze nella risposta contrattile a causa delle differenze di massa muscolare o danni verificatisi durante la dissezione. 3B figura mostra due trachee di massa muscolare diversa sfidati con potassio e carbacolo. Anche se le contrazioni colinergici-evocati differiscono, ily sono simili dopo la normalizzazione della risposta con soluzione di potassio (Figura 3C). La figura 4 mostra un esempio di (colinergico) contrazione carbacolo evocata utilizzando dosi singole (A) e un aumento cumulativo (B). Le soluzioni carbacolo vengono aggiunti direttamente alla vasca e il gas gorgogliati aiuta in miscelazione rapida. Vale la pena notare che l&#39;aggiunta di una singola dose (cioè 1 pM, Figura 4A) ha una risposta leggermente maggiore della concentrazione equivalente durante un cumulativa curva dose-risposta (1 pM, Figura 4B). Figura 4C mostra un grafico della forza di contrazione in funzione delle concentrazioni carbacolo utilizzando i dati di Figura 4B. Effetti di carbacolo saturano ad concentrazione 10 -5 M. Anche se agonisti colinergici avvia contrazione attraverso meccanismi di rilascio di calcio, una componente sostanziale della contrazione è mediata da depolarizzazione eattivazione di canali voltaggio-dipendenti calcio 20. Figura 5A mostra un esempio di EFS evocati contrazioni. Trachee sono stimolati con durata di 0,5 millisecondi, 40 impulsi volt fino contrazioni raggiungere un plateau (vedi riquadro a1). Un aumento della frequenza di stimolazione determina un aumento della risposta contrattile (frequenza curva di risposta è riportata in Figura 5B). Stimolazione del campo elettrico è stato dimostrato per evocare contrazioni prevalentemente attivando nervi presinaptici. Ciò è dimostrato dal l&#39;effetto della tossina botulinica, un bloccante del rilascio di neurotrasmettitore che blocca la maggior parte delle contrazioni EFS-evocati trachea 21. Inoltre, tetrodotossina, un agente che blocca i canali del Na + inibisce anche l&#39;attività nervosa ed elimina la risposta della trachea per EFS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di tha grandi vie di segnalazione in una preparazione trachea isolata. Mostrato è un terminale assone colinergico innerva una cellula del muscolo liscio tracheale. Le vie di segnalazione principali sono M3-M2-muscarinici e l&#39;attivazione del recettore dell&#39;acetilcolina (mAChR) che causano il rilascio del calcio attraverso i recettori IP3 (M3) e la riduzione del cAMP (M2). Recettori M2 (e alcuni contributo dei recettori M3) anche causare depolarizzazione colinergica evocata che attiva L canali di tipo dipendente dalla tensione di calcio e influsso di calcio. Comuni agenti contrattili e dei loro effettori sono: 1. di potassio (depolarizzare cellule muscolari lisce e assoni colinergici), 2. campo di stimolazione elettrica (EFS, depolarizza colinergico assone) e 3. l&#39;applicazione esogena di agenti colinergici quali acetilcolina o carbacolo (attiva i recettori muscarinici direttamente). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> Figura 2. Schema di materiale utilizzato per misurare le contrazioni tracheali. A. Il trasduttore di forza, micrometro e bagno tessuti sono montati su asta di supporto tramite morsetti a vite. L&#39;anello tracheale è filettato sulle aste superiore e inferiore. Nel diagramma, il bagno di tessuto è posizionata sotto la preparazione (ad esempio durante il montaggio della trachea sul trasduttore di forza). Durante gli studi di contrazione, il bagno tessuto viene spostata verticalmente a fare il bagno la preparazione. B. Per la stimolazione del campo elettrico l&#39;asta inferiore viene modificato per includere due piastre platino che sono montati lateralmente al filo azienda trachea. Le piastre platino sono collegati da fili elettrici ad uno stimolatore. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> Figura 3. Esempi di potassio (67 mM) di risposta contrattile della trachea. (A) mostra duplicati, risposte riproducibili al potassio alto. (B) Esempi di risposta contrattile alla carbacolo di due differenti trachee. (C) Le risposte alle trachee in B sono simili quando normalizzared per la risposta ad alta potassio. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di carbacolo contrazioni indotte. (A) carbacolo contrazioni indotte sono state somministrate dosi singole seguita da washout. (B) Esempio cumulativa curva dose-risposta per la trachea in A. (C) contrazioni picco da B vengono tracciati come funzione della concentrazione carbacolo. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> Figura 5. Esempi di contrazioni evocati dalla stimolazione del campo elettrico. (A) stimolazione del campo elettrico della contrazione trachea utilizzando impulsi 0,5 ms, 40 volt, e frequenze di stimolazione diversi come indicato. Inset è tempo espanso contrazione a 30 Hz. (B) contrazioni di picco di A sono plotted in funzione della frequenza di stimolazione. PSS normali <table border="1"><tbody><tr><td> Sale </td><td> Conc. (MM) </td><td> Importo (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 119 </td><td> 13,91 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 4,7 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,18 </td><td> 0,32 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7H 2 O </td><td> 1,17 </td><td> 0,58 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 18 </td><td> 3,02 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 0,026 </td><td> 0,1 ml di 0,5 M </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 11 </td><td> 3,96 </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 12,5 </td><td> 8,56 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 400 ml di 10 mM </td></tr></tbody></table> Alta K + PSS (NACL e rettifiche KCl) <table border="1"><tbody><tr><td> Sale </td><td> Conc. (MM) </td><td> Importo (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 56,7 </td><td> 6,628 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 67 </td><td> 9,991 </td></tr></tbody></table> . Tabella 1 Ricetta per soluzioni PSS. Nota: Le soluzioni sono fatta fresca ogni settimana, con acqua ultrapura di qualità, e sono conservate in frigorifero per non più di 5 giorni per evitare di contaminare la crescita.

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T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle.">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li><li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP,+and+PGE2.">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li><li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+(ET(B))+receptor+knockout+mice.">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li><li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M(3)-receptor+knockout+mice:+muscarinic+receptor+function+in+atria,+stomach+fundus,+urinary+bladder,+and+trachea.">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li><li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder.">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li><li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction.">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li><li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"classical"+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice.">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il protocollo qui presentato fornisce una preparazione fisiologica per valutare la funzionalità muscolare delle vie aeree. In genere funzionano 3-4 prodotti per il bagno di organi contemporaneamente, tuttavia, i sistemi preconfezionati sono disponibili un certo numero di fornitori che permettono misurazioni simultanee fino a 8 preparazioni (ADInstruments, strumenti di precisione del mondo, e apparecchi di Harvard). Abbiamo utilizzato un certo numero di trasduttori di forza e bagni organo tessuto con risultati equivalen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Convertitore analogico-digitale </td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 4/35 </td><td></td></tr><tr><td> Carbacolo (Chloride Carbamoylcholine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4832 </td><td> 10 -2 M in acqua (aliquote possono essere conservati a -20 ° C) </td></tr><tr><td> Charting Software </td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldamento circolatore </td><td> Haake </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Trasduttore di forza isometrica </td><td> Kent Scientific </td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td> Stimolatore </td><td> Grass Technologies </td><td> S88 Squ Doppia uscitasono Pulse stimolatore </td><td></td></tr><tr><td> Carta igienica </td><td> WPI </td><td> 47264 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro measurements of tracheal constriction using mice

Transgenici e topi knockout sono potenti strumenti per lo studio della fisiologia e fisiopatologia delle vie aeree 1,2. In tensometry isolati in vitro di preparazioni tracheali ha dimostrato di essere un saggio utile della muscolatura liscia delle vie aeree (ASM) risposta contrattile nei topi geneticamente modificati. Questi preparati in vitro tracheali sono relativamente semplici, forniscono una risposta forte, e trattenere sia funzionali terminazioni nervose colinergiche e risposte muscolari, anche dopo lunghi incubazioni. Tensometry tracheale fornisce inoltre un saggio funzionale per studiare una varietà di vie di segnalazione secondo messaggero che influenzano la contrazione della muscolatura liscia. Contrazione della trachea è mediato principalmente dai parasimpatici, nervi colinergici che rilasciano acetilcolina sulla ASM (Figura 1). I principali recettori muscarinici dell&#39;acetilcolina ASM sono M2 e M3 che sono G e I / O GQ recettori accoppiati, rispettivamente <sup&gt; 3,4,5. Recettori M3 evocare contrazione accoppiamento Gq per attivare la fosfolipasi C, aumento della produzione e IP3 IP3-mediato rilascio del calcio dal reticolo sarcoplasmatico 3,6,7. M2 / G i / o segnalazione è creduto per migliorare contrazioni mediante inibizione di adenilato ciclasi che porta ad una diminuzione dei livelli di cAMP 5,8,9,10. Questi percorsi costituiscono il cosiddetto &quot;farmaco-contrazione&quot; della muscolatura liscia delle vie aeree 11. Inoltre, colinergici segnalazione attraverso i recettori M2 e M3 modulata dal segnale) comporta percorsi che depolarizzare il ASM che a loro volta attivano L-type, voltaggio-dipendenti canali del calcio (Figura 1) e flusso di calcio (cosiddetto &quot;eccitazione-contrazione&quot; ) 4,7. Recensioni più dettagliate sulle vie di segnalazione che controllano costrizione delle vie respiratorie può essere trovato 4,12. Le vie di cui sopra sembrano essere conservati tra i topi e altre specie. Tuttavia, trachee topo differiscono da altre specie in alcuni percorsi di segnalazione. Il più importante è la loro mancanza di risposta contrattile di istamina e adenosina 13,14, entrambi i modulatori ASM ben noti negli esseri umani e altre specie 5,15. Presentiamo qui protocolli per l&#39;isolamento di murini anelli tracheali e la misura in vitro della loro produzione contrattile. Sono incluse le descrizioni della configurazione delle apparecchiature, l&#39;isolamento anello di trachea e misure contrattili. Esempi sono forniti per evocare contrazioni indirettamente con elevata stimolazione dei nervi e potassio direttamente da depolarizzazione del muscolo ASM attivare il voltaggio-dipendenti influsso di calcio (1. Alto K +, Figura 1). Inoltre, i metodi sono presentati per stimolazioni di nervi solo utilizzando stimolazione di campo elettrico (2. EFS, Figura 1) stimolazione, o per diretta del muscolo ASM utilizzando neurotrasmettitore esogeno applicato alla vasca (3. Esogeno ACH, Figura 1). Questo FLExibility e facilità di preparazione rende il modello di anello trachea isolata un saggio robusto e funzionale per un numero di segnalazione cascate coinvolti nella contrazione muscolare liscia delle vie aeree.

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Topi transgenici sono stati estremamente utili per attribuire funzione fisiologica ai geni. Come tale, la ricerca in generale, e studi funzionali delle vie aeree, in particolare, hanno subito un notevole spostamento verso modelli murini. Qui forniamo protocolli per<em&gt; In vitro</em&gt; Studi di costrizione trachea per valutare la funzionalità della muscolatura liscia delle vie aeree in murino.

Nelle misure in vitro di costrizione tracheale con Mice

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

20.6K Views.  UT Health Science Center, San Antonio. Topi transgenici sono stati estremamente utili per attribuire funzione fisiologica ai geni. Come tale, la ricerca in generale, e studi funzionali delle vie aeree, in particolare, hanno subito un notevole spostamento verso modelli murini. Qui forniamo protocolli per In vitro Studi di costrizione trachea per valutare la funzionalità della muscolatura liscia delle vie aeree in murino.

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Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of the population1,2. Symptoms include spontaneous (tingling, burning, electric-shock like) pain, dysaesthesia, paraesthesia, allodynia (pain resulting from normally non-painful stimuli) and hyperalgesia (an increased response to painful stimuli). The sensory symptoms are co-morbid with behavioural disabilities, such as insomnia and depression. To study chronic neuropathic pain several animal models mimicking peripheral nerve injury have been developed, one of the most widely used is Bennett and Xie's (1988) unilateral sciatic nerve chronic constriction injury (CCI)3 (Figure 1). Here we present a method for performing CCI and testing pain hypersensitivity.
CCI is performed under anaesthesia, with the sciatic nerve on one side exposed by making a skin incision, and cutting through the connective tissue between the gluteus superficialis and biceps femoris muscles. Four chromic gut ligatures are tied loosely around the sciatic nerve at 1 mm intervals, to just occlude but not arrest epineural blood flow. The wound is closed with sutures in the muscle and staples in the skin. The animal is then allowed to recover from surgery for 24 hrs before pain hypersensitivity testing begins.
For behavioural testing, rats are placed into the testing apparatus and are allowed to habituate to the testing procedure. The area tested is the mid-plantar surface of the hindpaw (Figure 2), which falls within the sciatic nerve distribution. Mechanical withdrawal threshold is assessed by mechanically stimulating both injured and uninjured hindpaws using an electronic dynamic plantar von Frey aesthesiometer or manual von Frey hairs4. The mechanical withdrawal threshold is the maximum pressure exerted (in grams) that triggers paw withdrawal. For measurement of thermal withdrawal latency, first described by Hargreaves et al (1988), the hindpaw is exposed to a beam of radiant heat through a transparent glass surface using a plantar analgesia meter5,6. The withdrawal latency to the heat stimulus is recorded as the time for paw withdrawal in both injured and uninjured hindpaws. Following CCI, mechanical withdrawal threshold, as well as thermal withdrawal latency in the injured paw are both significantly reduced, compared to baseline measurements and the uninjured paw (Figure 3). The CCI model of peripheral nerve injury combined with pain hypersensitivity testing provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to modify chronic neuropathic pain. In our laboratory, we utilise CCI alongside thermal and mechanical sensitivity of the hindpaws to investigate the role of neuro-immune interactions in the pathogenesis and treatment of neuropathic pain.

Due to the simplicity of surgery and the robust behavioural outcome, chronic constriction of the sciatic nerve is one of the pre-eminent animal models of neuropathic pain. Within 24 hrs following surgery, pain hypersensitivity is established and can be quantitatively measured using a von Frey aesthesiometer (mechanical test) and plantar analgesia meter (thermal test).

La costrizione cronica del nervo sciatico e Ipersensibilità Testing Pain in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of ...

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Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart failure. Here, we describe a detailed surgical procedure for creating pressure overload and cardiac hypertrophy in rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. After anesthesia, the trachea is intubated by inserting a cannula through a half way incision made between two cartilage rings of trachea. Then a skin incision is made at the level of the second intercostal space on the left chest wall and muscle layers are cleared to locate the ascending portion of aorta. The ascending aorta is constricted to 50&#8211;60% of its original diameter by application of a small sized titanium clip. Following aortic constriction, the second and third ribs are approximated with prolene sutures. The tracheal cannula is removed once spontaneous breathing was re-established. The animal is allowed to recover on the heating pad by gradually lowering anesthesia. The intensity of pressure overload created by constriction of the ascending aorta is determined by recording the pressure gradient using trans-thoracic two dimensional Doppler-echocardiography. Overall this protocol is useful to study the remodeling events and contractile properties of the heart during the gradual onset and progression from compensated cardiac hypertrophy to heart failure stage.

We describe a stepwise procedure for creating pressure overload and left ventricular hypertrophy in Wistar rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. This model is extensively used for studying remodeling changes during cardiac hypertrophy and for identifying and evaluating strategies for regression of such changes.

Crescente aortica Costrizione in ratti per la creazione di sovraccarico di pressione cardiaca Ipertrofia Modello

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Microscopio video intravitale misurazioni della retina flusso sanguigno nei topi

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

A Model of Cardiac Remodeling Through Constriction of the Abdominal Aorta in Rats

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Un modello di rimodellamento cardiaco Attraverso Costrizione del Aorta addominale in Rats

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

Minimamente invasiva trasversale aortica costrizione nei topi

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Tecnica di costrizione aortico trasversale mininvasiva in topi per induzione dell'ipertrofia ventricolare sinistra

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to perform a partial thoracotomy to visualize the transverse aortic arch. However, the surgical trauma caused by the thoracotomy in open-chest models changes the respiratory physiology as the ribs are dissected and left unattached after chest closure. To prevent this, we established a minimally invasive, closed chest approach via lateral thoracotomy. Herein we approach the aortic arch via the 2nd intercostal space without entering the chest cavities, leaving the mouse with a less traumatic injury to recover from. We perform this operation using standard laboratory settings for open chest TAC procedures with equal survival rates. Apart from maintaining physiological breathing patterns due to the closed chest approach, the mice seem to benefit by showing rapid recovery, as the less invasive technique appears to facilitate a fast healing process and to reduce immune response after trauma.

Here, we present a protocol of Transverse Aortic constriction (TAC) via a lateral thoracotomy. This technique is a minimally invasive, closed chest surgical procedure aiming to simulate pressure overload and heart failure in mice utilizing standard TAC laboratory settings.

Un modello chiuso-cassa per indurre costrizione trasversale aortica in topi

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Sleeve Gastrectomy in Mice using Surgical Clips

The number of people who are overweight and obese is continually increasing both in the adult and adolescent populations. This coincides with the increased universal phenomenon of type 2 diabetes (T2D) and other metabolic problems. Bariatric surgery, such as SG, is currently one of the most effective and commonly used long-term treatment for obesity and T2D, but the association between them is not completely explored yet. The mechanisms underlying the outcomes seen after bariatric surgery in humans can be investigated based on preclinical animal studies. The SG reduces body weight, glucose levels and many metabolic parameters, and is easy to perform with a low incidence of complications. The goal of this work is to provide a simple method and an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery in animals for researchers.

The prevalence of diabetes and obesity is continuously increasing worldwide. The mechanisms between diabetes, obesity and their associated mortality and co-morbidities need to be further investigated. Here, we present a protocol for sleeve gastrectomy (SG) in animals as an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery.