Este trabalho foi financiado por uma doação do Centro para a Inovação na Prevenção e Tratamento de doenças respiratórias, NINDS concessão (NS052574), e do Programa de Pesquisa Sandler Asma.

1. Equipamento Os principais componentes de um dispositivo de medição de contracção são mostrados esquematicamente na Figura 2A). <ol><li> Um banho de tecido. O banho de tecido mantém uma solução oxigenada fisiológico à temperatura quente. Para anéis ratinhos traqueia, usamos um banho de tecidos 10 ml que contém uma camisa de água para fazer circular uma solução de aquecimento, uma entrada de frita de vidro ao oxigénio bolha (95% / 5% de O 2 / CO 2 mistura) e de entrada e de escape para alterar soluções. Uma solução PSS reservatório é armazenada com borbulhamento constante de 95% / 5% de O 2 / CO 2 mistura em um banho de 37 ° C água (não mostrado). Para trocas de solução, a solução de PSS é bombeado do reservatório para a entrada de banho de tecido (porta inferior) a cerca de 100 ml por minuto para permitir a troca solução relativamente rápido. A solução é tomada através de uma porta transbordamento (porta superior) que permite que a volume constante (~ 10 ml) no tecido morcegoh durante a solução de câmbio. Usamos um circulador de aquecimento Haake para bombear a água quente através da camisa banho de tecido (para manter a 37 ° C). Banhos de tecido pode ser obtido a partir de um certo número de fornecedores e vêm em uma variedade de tamanhos e estilos para se adequar às necessidades experimentais do investigador. </li><li> Um transdutor de força. Para medir a tensão isométrica, o tubo de traqueia é enfiada sobre L-extremidades em forma de duas hastes de aço inoxidável (Figura 2A). Deve ser tomado cuidado para usar um tipo de aço inoxidável que é compatível com o material biológico. A haste de topo é ligado através de um grampo a um transdutor de força isométrica. A haste inferior mantém a traqueia, numa posição fixa, e é montado sobre um micrómetro para o ajuste de tensão passiva e / ou o comprimento do músculo. Contracção da traqueia cria tensão sobre o transdutor de força, que é convertido para um sinal de tensão no pré-amplificador. A haste inferior pode também ser configurado para incluir duas placas de platina rectangulares (4 mm de intervalo) t<html> chapéu flanco da traquéia (Figura 2B). As placas de platina são ligados a um estimulador Grass S88 que permite que a entrega de um campo eléctrico através da traqueia. Fios abertos e de solda são revestidos com Sylgard (Sylgard elastómero de silicone 184, Dow Corning Corp, Midland, MI), para evitar a lixiviação de metais na solução do banho. </li><li> A / D de software de computador conversor, e de aquisição. Sinais dos amplificadores são registados numa MacLab 8 Um sistema de / D. Esta é uma versão mais antiga do atual hardware ADInstrument Powerlab. Nós usamos o gráfico de programa (ADInstruments) que permite gravação contínua de tensão durante todo o experimento. Geração de tensão do músculo traquéia é bastante lento e, portanto, achamos que a aquisição de 100 pontos por segundo é suficiente. A medição da tensão é calibrado usando pesos conhecidos (até 5 gramas), antes de cada experiência. Sistemas similares estão disponíveis a partir de outros fornecedores (por exemplo, Biopac, GW Instruments). </li></ol>título &quot;&gt; 2. Isolamento Traquéia <ol><li> Antes de isolamento tecido do transdutor de força é calibrado com pesos conhecidos, eo banho de tecido é preenchido com PSS normal (ver Tabela I). A entrada de ar é ajustada para se obter um fluxo de luz de O 2 / CO 2. </li><li> Traquéias de dois meses ou camundongos mais velhos são ótimas. Animais jovens podem ser usados, mas traqueias obtidos a partir destes exigem uma maior capacidade para montar sobre os fios transdutor de força devido ao seu tamanho pequeno. Antes de dissecção, os ratos estão profundamente sedado com isoflurano. O nível apropriado de sedação é alcançado quando um toe pitada com fórceps não é capaz de eliciar uma resposta. Os ratos são imediatamente sacrificados por deslocamento cervical Uma nota importante:. Temos observado que Avertin (tribromoetanol), um sedativo usado em camundongos, tem fortes efeitos relaxantes sobre o músculo liso das vias aéreas e, portanto, não deve ser usado para estudos de contração de traquéia. </li><li> A pele (e peles com pêlo) é removido do tórax de garganta. Ribs são cortadas a partir da base do esterno, lateralmente (em ambos os lados) para o topo do coração. O esterno e costelas são, então, puxado para a frente para a garganta para revelar o coração / pulmões, timo, traquéia (ventral) e esôfago (em anexo - e dorsal a traquéia). </li><li> A traqueia é excisado cortando abaixo da bifurcação brônquica e acima da faringe. A traqueia é colocado em um gelada oxigenado solução PSS (95/5) (composição dada na Tabela I). </li><li> A traquéia é dissecado limpo dos tecidos circundantes. Durante a limpeza, a traquéia pode ser realizada na faringe ou abaixo da bifurcação. No entanto, o cuidado deve ser tomado para não se aplicam diretamente a pinça para a traquéia em si. Tesoura fina pode ser utilizado para cortar os tecidos circundantes, mas o corte deve ser feita sempre paralela à traqueia para evitar danos. Esta parte do processo é facilitado se a preparação da traqueia é fixado abaixo da bifurcação e acima da faringe num prato de Sylgard revestido (Sylgard 184 SiliconeElastómero, Dow Corning Corp, Midland, MI). </li><li> Após a remoção do tecido circundante, a traqueia é cortado abaixo da faringe e acima da bifurcação brônquica e suavemente montado sobre os fios transdutor de força. </li><li> A traqueia é roscado ao longo de dois dentes em forma de L de metal (figura 2A). Um pino está ligado a um transdutor de força-deslocamento para registo contínuo da tensão isométrica. Outra pino está ligado a um micrómetro. O banho de tecido é então levantada, de modo que a traqueia é imerso em PSS. Montagem da traqueia deve ser feito tão rapidamente quanto possível para minimizar o tempo que traqueia são mantidos fora de PSS. Com a prática, a montagem da traquéia pode ser feito dentro de um minuto, mas nós geralmente evitar vezes mais do que 3 minutos para evitar a perda de viabilidade. </li><li> O micrómetro é ajustado lentamente para se obter uma tensão passiva de ~ 10 mN (~ 1 grama de força). A tensão de repouso óptima foi determinada empiricamente e nós descobrimos que a tensão passiva de ~ 5-10 resultado MN em uma resposta, equivalente à estimulação máxima de potássio de alta. Isto é consistente com um número de outros estudos que utilizam uma tensão passiva nesta gama 16,17,18. Ao longo dos primeiros minutos 5-10, traqueia tensão passiva tende a diminuir ligeiramente (tensão-relaxamento fenómeno) e do micrómetro é usado para ajustar a tensão passiva para ~ 10 mN durante equilíbrio. A traqueia é deixada a equilibrar durante pelo menos 1 hora antes de desafios experimentais. </li></ol> 3. Estimulação de potássio de alta Equilibração a seguir, a traqueia é desafiada duas vezes com uma solução de alta potássio PSS (67 mM de KCl, Tabela I). A contracção geralmente requer minutos ~ 5-10 para atingir o estado estacionário, altura em que o banho de tecido é enxaguado por várias vezes com PSS normal para relaxar completamente a traqueia. A contracção de potássio é repetido uma segunda vez, e uma terceira vez (se necessário) até que as contracções reprodutíveis são obtidos. <pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Contração evocada por estimulação elétrica A traqueia é flanqueado por duas placas de platina rectangulares (eléctrodos) que permitem que a estimulação do campo eléctrico (EFS) para a preparação. A resposta contráctil ao EFS é uma função da frequência e tensão. Também é afectada por meio de parâmetros físicos, tais como a área dos eléctrodos ea distância entre eles. As características de potência do estimulador também afetam essas respostas que a voltagens mais elevadas e saídas de corrente do estimulador alcança seu valor máximo. As características de qualquer sistema EFS deve ser determinada através da análise das respostas musculares contráteis em diferentes durações de estímulo, freqüências, tensões e durações de pulso. Para o nosso configuração experimental, descobrimos que os eléctrodos separados por ~ 4 mm, ea amplitude de estimulação de 44 V (0,5 ms pulsos) e 30 Hz são óptimas para atingir reprodutíveis perto-máximas respostas contrácteis. 5. Ev contraçãooked por Estimulação Colinérgica A capacidade de resposta da traqueia para exogenamente compostos aplicados é avaliada quer por adição de uma única dose da droga de interesse, ou, por adições múltiplas da droga de uma forma de dose cumulativa. Para a traqueia, nosso laboratório utilizado rotineiramente carbacol para activar os receptores colinérgicos, porque, ao contrário da acetilcolina, carbacol não é degradado pela enzima acetilcolinesterase. Uma gama de dose-resposta razoável é de 10 -8 a 10 -5 M carbacol. Montagem do Log [carbacol] curva de resposta-contrátil com uma equação de Hill de tipo permite uma estimativa da EC 50 (semi-máxima concentração eficaz) que é uma medida da sensibilidade da contracção da traqueia para o agonista colinérgico 19. Vale a pena notar que uma determinada dose de carbacol dará uma resposta ligeiramente maior como uma dose única do que como parte de uma curva de dose-resposta cumulativas. 6. Os resultados representativos </p&gt; Um exemplo de uma resposta contráctil de potássio de alta é mostrada na Figura 3A. A contração atinge um máximo em aproximadamente 10 minutos, mas pode mostrar um pequeno declínio em seguida. Durante washout precoce de elevado de potássio, o músculo pode mostrar um aumento transitório na contracção que é devido a uma queda na temperatura conforme o pequeno volume de solução de PSS sem aquecimento nas linhas de solução transientemente perfunde da preparação. Isto pode ser minimizado por ter um volume mínimo morto na tubagem de ligação ao reservatório PSS aquecida e banho de tecido, e também através da troca de solução de forma relativamente rápida (geralmente bombeia-soluções a 100 ml / min). Cada preparação terá algumas diferenças na resposta contráctil devido a diferenças na massa muscular ou danos efectuadas durante a dissecção. Figura 3B mostra duas traqueias de massa muscular diferente desafiados com elevado de potássio e carbacol. Embora as contrações colinérgica-evocados diferentes, oy são semelhantes após normalização para a resposta com uma solução de potássio elevada (Figura 3C). A Figura 4 mostra um exemplo de uma contracção carbacol (colinérgica) evocado utilizando doses únicas (A) e um aumento cumulativo (B). As soluções de carbacol são adicionados directamente para o banho eo gás borbulhado ajuda na mistura rápida. Vale a pena notar que a adição de uma dose única (isto é, 1 mM, a Figura 4A) tem uma resposta ligeiramente maior do que a concentração equivalente durante uma curva dose-resposta cumulativas (1 uM, a Figura 4B). 4C Figura mostra um gráfico da força de contracção como uma função das concentrações de carbacol utilizando os dados a partir da Figura 4B. Efeitos do carbacol saturar a concentração de 10 M -5. Embora os agonistas colinérgicos inicia contracção por meio de mecanismos de libertação de cálcio, um componente substancial da contração também é mediada pela despolarização eactivação de canais de cálcio dependentes de tensão 20. A Figura 5A mostra um exemplo de EFS evocadas contracções. Traquéias são estimuladas com 0,5 milissegundos de duração, de 40 pulsos volts até contrações atingir um platô (ver a1 inserção). Um aumento na freqüência de estimulação provoca um aumento da resposta contrátil (frequência de resposta curva é traçada na Figura 5B). A estimulação do campo eléctrico tem sido demonstrado para evocar contrações predominantemente através da activação dos nervos pré-sinápticos. Isto é evidenciado pelo efeito da toxina botulínica, um bloqueador de libertação de neurotransmissores que bloqueia a maioria das contracções EFS-evocados de traqueia 21. Além disso, tetrodotoxina, um agente que bloqueia canais de Na + também inibe a actividade do nervo e elimina a resposta da traqueia para o EFS. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de tAs principais vias de sinalização que em uma preparação de traquéia isolada. É mostrado um terminal axônio colinérgica inervar uma célula muscular lisa traqueal. As principais vias de sinalização são M3 e M2-muscarínico ativação do receptor de acetilcolina (mAChR) que causam a liberação de cálcio através de receptores IP3 (M3) e redução de AMPc (M2). Receptores M2 (e alguma contribuição dos receptores M3) também causar despolarização colinérgico-evocado que activa canais tipo L, dependente da voltagem de cálcio e influxo de cálcio. Comuns agentes contráteis e seus efetores são: 1. de potássio elevado (despolarizar célula muscular lisa e axónio colinérgica), 2. estimulação campo elétrico (EFS, despolariza colinérgica axônio) e 3. aplicação exógena de agentes colinérgicos, tais como acetilcolina ou carbacol (activa os receptores muscarínicos directamente). <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> Figura 2. Diagrama de equipamento utilizado para medir as contracções traqueais. A. O transdutor de força micrómetros, e banho de tecido são montados sobre o apoio hastes por meio de grampos. O anel traqueal é enfiada sobre as hastes superior e inferior. No diagrama, o banho de tecido é posicionado abaixo da preparação (isto é, durante a montagem da traqueia para o transdutor de força). No decurso dos estudos de contração, o banho de tecido é movido verticalmente para banhar a preparação. B. Para a estimulação do campo eléctrico a haste inferior é modificado para incluir duas placas de platina que são montados lateralmente para o fio de exploração traqueia. As placas de platina são ligados por fios eléctricos a um estimulador. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> Figura 3. Exemplos de potássio de alta (67 mM) de resposta contráctil de traqueia. (A) mostra duplicados, respostas reprodutível para elevado de potássio. (B) Exemplos de resposta contráctil ao carbacol de duas traqueias diferentes. (C) As respostas às traqueias em B são semelhantes quando normalizard para a resposta de alta de potássio. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de contracções induzidas por carbacol. (A) carbacol contracções induzidas por utilizando doses únicas seguido por lavagem. (B) Exemplo curva de dose-resposta cumulativas para traqueia em A. (C) contracções de pico de B estão representados como uma função da concentração de carbacol. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplos de contracções provocadas pela estimulação do campo eléctrico. (A) estimulação do campo eléctrico da traqueia contracção usando 0,5 ms de pulso, 40 volts, e as frequências de estimulação vários, como indicado. Inset é tempo de expansão da contração em 30 Hz. (B) as contrações de pico de um são plotted como uma função da frequência de estimulação. PSS normal <table border="1"><tbody><tr><td> Sal </td><td> Conc. (MM) </td><td> Quantidade (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 119 </td><td> 13,91 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 4,7 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,18 </td><td> 0,32 </td></tr><tr><td> MgSO4 x 7H 2 ó </td><td> 1,17 </td><td> 0,58 </td></tr><tr><td> De NaHCO3 </td><td> 18 </td><td> 3,02 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 0,026 </td><td> 0,1 ml de 0,5 M </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 11 </td><td> 3,96 </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> 12,5 </td><td> 8,56 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 400 ml de 10 mM </td></tr></tbody></table> Alta K + PSS (NaCl ajustes e KCl) <table border="1"><tbody><tr><td> Sal </td><td> Conc. (MM) </td><td> Quantidade (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 56,7 </td><td> 6,628 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 67 </td><td> 9,991 </td></tr></tbody></table> Tabela Receita 1 para soluções de PSS. Nota:. Solutions são feitos semanalmente fresco, com qualidade da água ultrapura, e são armazenados em um refrigerador por mais de 5 dias para evitar a contaminação de crescimento.

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T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle.">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li><li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP,+and+PGE2.">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li><li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+(ET(B))+receptor+knockout+mice.">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li><li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M(3)-receptor+knockout+mice:+muscarinic+receptor+function+in+atria,+stomach+fundus,+urinary+bladder,+and+trachea.">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li><li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder.">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li><li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction.">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li><li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"classical"+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice.">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo apresentado aqui proporciona uma preparação fisiológica para avaliar a função muscular das vias aéreas. Nós operam geralmente preparações para o banho de órgãos de 3-4 simultaneamente, no entanto, os sistemas de pré-embalados estão disponíveis a partir de um certo número de fornecedores que permitem medições simultâneas de até 8 preparações (ADInstruments, instrumentos de precisão do mundo, e Harvard Apparatus). Foi utilizado um número de transdutores de força e banhos de órgãos de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Analógico-Digital Converter </td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 4/35 </td><td></td></tr><tr><td> Carbacol (Cloreto de Carbamoylcholine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4832 </td><td> 10 M em água -2 (alíquotas pode ser armazenada a -20 ° C) </td></tr><tr><td> Software Charting </td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Circulador de aquecimento </td><td> Haake </td><td> Mixer Moinho MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Transdutor de força isométrica </td><td> Kent Scientific </td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td> Estimulador </td><td> Tecnologias da grama </td><td> S88 Squ saída duplasão de pulso Estimulador </td><td></td></tr><tr><td> Banho de tecido </td><td> WPI </td><td> 47264 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro measurements of tracheal constriction using mice

Transgênicos e camundongos têm sido ferramentas poderosas para a investigação da fisiologia e fisiopatologia das vias aéreas 1,2. Em tensometry in vitro de preparações isoladas traqueal provou ser um teste útil do músculo liso das vias aéreas (ASM) resposta contrátil em camundongos geneticamente modificados. Estes em preparações in vitro da traquéia são relativamente simples, dar uma resposta robusta e manter ambas as terminações nervosas colinérgicas funcionais e respostas musculares, mesmo após longas incubações. Tensometry traqueal também fornece um ensaio funcional para estudar uma variedade de vias de sinalização de segundo mensageiro que afectam a contração do músculo liso. Contração na traquéia é mediado principalmente pela parassimpático, nervos colinérgicos que liberam acetilcolina em ASM (Figura 1). Os principais receptores de acetilcolina ASM são M2 e M3 muscarínicos que são G i / o e receptores acoplados Gq, respectivamente <sup&gt; 3,4,5. Receptores M3 evocar a contração de acoplamento para Gq para ativar a fosfolipase C, aumentam a produção de IP3 e IP3 mediado pela liberação de cálcio do retículo sarcoplasmático 3,6,7. M2 / g de I / O de sinalização é acreditado para melhorar as contracções por inibição da adenilato-ciclase levando a uma diminuição dos níveis de cAMP 5,8,9,10. Estes percursos constituem o chamado &quot;acoplamento fármaco-contração&quot; do músculo liso das vias aéreas 11. Além disso, a sinalização através de receptores colinérgicos M2 (e modulada por M3 sinalização) envolve vias que despolarizar a ASM que por sua vez activar tipo L, canais de cálcio dependentes de tensão (Figura 1) e influxo de cálcio (o chamado &quot;acoplamento excitação-contração&quot; ) 4,7. Comentários mais detalhados sobre as vias de sinalização que controlam a constrição das vias aéreas pode ser encontrado 4,12. As vias acima parecem ser conservados entre os ratos e outras espécies. No entanto, traqueias de rato difere de outras espécies in alguns vias de sinalização. O mais proeminente é a falta de resposta contrátil a 13,14 histamina e adenosina, ambos os moduladores conhecidos ASM em seres humanos e outras espécies 5,15. Apresentamos aqui protocolos para o isolamento de murinos anéis traqueais e as medições in vitro da sua saída contráctil. Incluem-se as descrições da configuração do equipamento, traquéia isolamento anel e medições contráteis. Exemplos são apresentados para evocar contracções indirectamente, utilizando estimulação de potássio elevado de nervos e directamente por despolarização de músculo ASM para activar e dependente da voltagem influxo de cálcio (1. Alta K +, Figura 1). Além disso, os métodos são apresentados para estímulos de nervos sozinho usando estimulação do campo eléctrico (2. EFS, Figura 1), ou para a estimulação directa de músculo ASM usando neurotransmissor exógeno aplicado ao banho (3. Exógeno ACH, Figura 1). Este flexibility e facilidade de preparação processa o modelo de anel isolado da traqueia de um ensaio robusto e funcional para um número de cascata de sinalização envolvidas na contracção do músculo liso das vias aéreas.

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Camundongos transgênicos têm sido extremamente úteis em atribuir função fisiológica para genes. Como a pesquisa, tal em geral, e estudos funcionais da via aérea, em particular, têm sofrido uma mudança notável na direção modelos murinos. Aqui nós fornecemos os protocolos para<em&gt; In vitro</em&gt; Estudos de constrição da traqueia para avaliar a função do músculo liso das vias aéreas em camundongos.

Em medições in vitro de constrição traqueal Utilizando camundongos

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

in-vitro-measurements-of-tracheal-constriction-using-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

20.6K visualizações.  UT Health Science Center, San Antonio. Camundongos transgênicos têm sido extremamente úteis em atribuir função fisiológica para genes. Como a pesquisa, tal em geral, e estudos funcionais da via aérea, em particular, têm sofrido uma mudança notável na direção modelos murinos. Aqui nós fornecemos os protocolos para In vitro Estudos de constrição da traqueia para avaliar a função do músculo liso das vias aéreas em camundongos.

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Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of the population1,2. Symptoms include spontaneous (tingling, burning, electric-shock like) pain, dysaesthesia, paraesthesia, allodynia (pain resulting from normally non-painful stimuli) and hyperalgesia (an increased response to painful stimuli). The sensory symptoms are co-morbid with behavioural disabilities, such as insomnia and depression. To study chronic neuropathic pain several animal models mimicking peripheral nerve injury have been developed, one of the most widely used is Bennett and Xie's (1988) unilateral sciatic nerve chronic constriction injury (CCI)3 (Figure 1). Here we present a method for performing CCI and testing pain hypersensitivity.
CCI is performed under anaesthesia, with the sciatic nerve on one side exposed by making a skin incision, and cutting through the connective tissue between the gluteus superficialis and biceps femoris muscles. Four chromic gut ligatures are tied loosely around the sciatic nerve at 1 mm intervals, to just occlude but not arrest epineural blood flow. The wound is closed with sutures in the muscle and staples in the skin. The animal is then allowed to recover from surgery for 24 hrs before pain hypersensitivity testing begins.
For behavioural testing, rats are placed into the testing apparatus and are allowed to habituate to the testing procedure. The area tested is the mid-plantar surface of the hindpaw (Figure 2), which falls within the sciatic nerve distribution. Mechanical withdrawal threshold is assessed by mechanically stimulating both injured and uninjured hindpaws using an electronic dynamic plantar von Frey aesthesiometer or manual von Frey hairs4. The mechanical withdrawal threshold is the maximum pressure exerted (in grams) that triggers paw withdrawal. For measurement of thermal withdrawal latency, first described by Hargreaves et al (1988), the hindpaw is exposed to a beam of radiant heat through a transparent glass surface using a plantar analgesia meter5,6. The withdrawal latency to the heat stimulus is recorded as the time for paw withdrawal in both injured and uninjured hindpaws. Following CCI, mechanical withdrawal threshold, as well as thermal withdrawal latency in the injured paw are both significantly reduced, compared to baseline measurements and the uninjured paw (Figure 3). The CCI model of peripheral nerve injury combined with pain hypersensitivity testing provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to modify chronic neuropathic pain. In our laboratory, we utilise CCI alongside thermal and mechanical sensitivity of the hindpaws to investigate the role of neuro-immune interactions in the pathogenesis and treatment of neuropathic pain.

Due to the simplicity of surgery and the robust behavioural outcome, chronic constriction of the sciatic nerve is one of the pre-eminent animal models of neuropathic pain. Within 24 hrs following surgery, pain hypersensitivity is established and can be quantitatively measured using a von Frey aesthesiometer (mechanical test) and plantar analgesia meter (thermal test).

Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of ...

Medicina

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart failure. Here, we describe a detailed surgical procedure for creating pressure overload and cardiac hypertrophy in rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. After anesthesia, the trachea is intubated by inserting a cannula through a half way incision made between two cartilage rings of trachea. Then a skin incision is made at the level of the second intercostal space on the left chest wall and muscle layers are cleared to locate the ascending portion of aorta. The ascending aorta is constricted to 50&#8211;60% of its original diameter by application of a small sized titanium clip. Following aortic constriction, the second and third ribs are approximated with prolene sutures. The tracheal cannula is removed once spontaneous breathing was re-established. The animal is allowed to recover on the heating pad by gradually lowering anesthesia. The intensity of pressure overload created by constriction of the ascending aorta is determined by recording the pressure gradient using trans-thoracic two dimensional Doppler-echocardiography. Overall this protocol is useful to study the remodeling events and contractile properties of the heart during the gradual onset and progression from compensated cardiac hypertrophy to heart failure stage.

We describe a stepwise procedure for creating pressure overload and left ventricular hypertrophy in Wistar rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. This model is extensively used for studying remodeling changes during cardiac hypertrophy and for identifying and evaluating strategies for regression of such changes.

Aorta ascendente constrição em ratos para a criação de sobrecarga de pressão Cardíaca Hipertrofia Modelo

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

A Model of Cardiac Remodeling Through Constriction of the Abdominal Aorta in Rats

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Um Modelo de Cardiologia remodela Através constrição da Aorta Abdominal em Ratos

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

Minimamente Invasiva transversal aórtica constrição em Ratos

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Técnica de constrição da aorta minimamente invasiva transversal em camundongos para indução de Hipertrofia Ventricular Esquerda

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to perform a partial thoracotomy to visualize the transverse aortic arch. However, the surgical trauma caused by the thoracotomy in open-chest models changes the respiratory physiology as the ribs are dissected and left unattached after chest closure. To prevent this, we established a minimally invasive, closed chest approach via lateral thoracotomy. Herein we approach the aortic arch via the 2nd intercostal space without entering the chest cavities, leaving the mouse with a less traumatic injury to recover from. We perform this operation using standard laboratory settings for open chest TAC procedures with equal survival rates. Apart from maintaining physiological breathing patterns due to the closed chest approach, the mice seem to benefit by showing rapid recovery, as the less invasive technique appears to facilitate a fast healing process and to reduce immune response after trauma.

Here, we present a protocol of Transverse Aortic constriction (TAC) via a lateral thoracotomy. This technique is a minimally invasive, closed chest surgical procedure aiming to simulate pressure overload and heart failure in mice utilizing standard TAC laboratory settings.

Um modelo de peito fechado para induzir a constrição da aorta transversa em ratos

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Sleeve Gastrectomy in Mice using Surgical Clips

The number of people who are overweight and obese is continually increasing both in the adult and adolescent populations. This coincides with the increased universal phenomenon of type 2 diabetes (T2D) and other metabolic problems. Bariatric surgery, such as SG, is currently one of the most effective and commonly used long-term treatment for obesity and T2D, but the association between them is not completely explored yet. The mechanisms underlying the outcomes seen after bariatric surgery in humans can be investigated based on preclinical animal studies. The SG reduces body weight, glucose levels and many metabolic parameters, and is easy to perform with a low incidence of complications. The goal of this work is to provide a simple method and an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery in animals for researchers.

The prevalence of diabetes and obesity is continuously increasing worldwide. The mechanisms between diabetes, obesity and their associated mortality and co-morbidities need to be further investigated. Here, we present a protocol for sleeve gastrectomy (SG) in animals as an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery.