Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Zentrum für Innovation in der Prävention und Behandlung von Atemwegserkrankungen, NINDS Grant (NS052574), und von der Sandler-Programm für Asthma-Forschung finanziert.

1. Ausrüstung Die Hauptkomponenten einer Kontraktion Messvorrichtung sind schematisch in 2A gezeigt). <ol><li> Ein Bad Gewebe. Das Gewebe Bad unterhält ein sauerstoffreiches physiologischen Lösung bei warmen Temperaturen. Bei Mäusen Trachea Ringe, verwenden wir ein 10 ml Gewebe Bad, das einen Wassermantel enthält zum Zirkulieren eines Erwärmung Lösung, eine Glasfritte Einlaß zu sprudeln Sauerstoff (95% / 5% O 2 / CO 2-Gemisch) und Einlass und Auslassöffnungen zum Ändern Lösungen. Ein Reservoir PSS-Lösung mit konstanter Durchblasen von 95% / 5% O 2 / CO 2-Gemisch bei 37 ° C Wasserbad (nicht gezeigt). Gespeicherten Zur Lösung Austausch, wird PSS-Lösung von dem Reservoir zu dem Gewebe Wanneneinlauf (Ausrichtung) bei etwa 100 ml pro Minute gepumpt wird, um relativ schnelle Lösung Austausch zu ermöglichen. Die Lösung-Auslass ist durch einen Überlauf (obere Öffnung), die mit konstantem Volumen (~ 10 ml) ermöglicht im Gewebe Schlägerh während der Lösung Austausch. Wir verwenden eine Haake Umwälzthermostat zu warmes Wasser durch das Gewebe zu pumpen Bad Jacke (bis 37 ° C zu halten). Tissue Bäder können aus einer Reihe von Lieferanten bezogen werden und kommen in einer Vielzahl von Größen und Stile, um die experimentellen Bedürfnisse der Ermittler passen. </li><li> Ein Kraftaufnehmer. Um isometrische Spannung zu messen, wird die Luftröhre Rohr über L-förmigen Enden von zwei Edelstahl-Stangen (Abbildung 2A) eingefädelt. Es sollte darauf geachtet, eine Edelstahl-Typ, die kompatibel mit biologischem Material ist zu verwenden. Die obere Stange wird über einen Clip mit einem isometrischen Kraftaufnehmer verbunden. Die untere Stange hält die Trachea an einer festen Position, und auf einem Mikrometer zur Einstellung der passive Spannung und / oder Muskellänge montiert. Die Kontraktion der Trachea eine Spannung auf den Kraftaufnehmer, was zu einer Spannung an die Vorverstärker umgewandelt wird. Die untere Stange kann auch so konfiguriert, dass zwei rechteckige Platten Platin (4 mm voneinander entfernt) t erweitert werden<html> Hut flankieren die Luftröhre (Abbildung 2B). Die Platin-Platten sind an einem Grass S88 Stimulator, die Abgabe eines elektrischen Feldes über die Trachea ermöglicht verdrahtet. Offene Drähte und löten sind mit Sylgard (Sylgard 184 Silikon-Elastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI) beschichtet, um die Auslaugung von Metallen in der Badlösung zu verhindern. </li><li> A / D-Wandler, Computer und Software zur Erfassung. Signale von den Vorverstärker auf einer MacLab 8 A / D-System aufgezeichnet. Dies ist eine ältere Version der aktuellen ADInstrument Powerlab Hardware. Wir verwenden das Programm Diagramm (ADInstruments), die kontinuierliche Aufzeichnung der Spannung ermöglicht während des gesamten Experiments. Tension Generation der Luftröhre Muskel ist ziemlich langsam, und deshalb finden wir, dass die Akquisition von 100 Punkten pro Sekunde ist ausreichend. Die Spannung Messung wird unter Verwendung bekannter Gewichte (bis zu 5 Gramm) vor jedem Experiment. Ähnliche Systeme sind von anderen Verkäufern (zB Biopac, GW Instruments). </li></ol>Titel &quot;&gt; 2. Trachea Isolation <ol><li> Vor dem Gewebe isoliert Der Kraftaufnehmer ist mit bekannten Gewichten kalibriert, und das Gewebe Bad ist mit normalen PSS gefüllt (siehe Tabelle I). Der Lufteinlass ist eingestellt, um einen Lichtstrom von O 2 / CO 2 zu erhalten. </li><li> Luftröhre aus 2 Monate oder älter Mäuse sind optimal. Jüngere Tiere können verwendet werden, aber Luftröhren von diesen erhalten mehr Geschick erfordern, um auf den Kraftaufnehmer Drähte wegen ihrer geringen Größe zu montieren. Vor der Präparation werden die Mäuse mit Isofluran tief sediert. Das richtige Maß an Sedierung ist erreicht, wenn eine Zehe-Pinch mit einer Pinzette ist nicht in der Lage, eine Reaktion auszulösen. Mäuse werden sofort durch Genickbruch getötet Ein wichtiger Hinweis:. Wir haben beobachtet, dass Avertin (Tribromethanol), ein Beruhigungsmittel häufig bei Mäusen eingesetzt, starke Beruhigungsmittel Auswirkungen auf die glatte Muskulatur der Atemwege hat und sollte daher nicht für die Luftröhre Kontraktion Studien verwendet werden. </li><li> Die Haut (und Pelz) von Thorax an Hals entfernt. Ribs sind von der Basis des Brustbeins, seitlich (auf beiden Seiten) an die Spitze des Herzens zu schneiden. Das Brustbein und die Rippen sind dann nach vorne auf den Hals, um das Herz / Lunge, Thymus, Luftröhre (ventral) und Speiseröhre (- und dorsal Luftröhre an) zeigen gezogen. </li><li> Die Luftröhre wird durch Schneiden unter dem bronchiale Bifurkation und vor dem Pharynx herausgeschnitten. Die Luftröhre wird in einem eiskalten Sauerstoff (95/5) PSS-Lösung (Zusammensetzung in Tabelle I angegeben) platziert. </li><li> Die Luftröhre wird seziert sauberen des umgebenden Gewebes. Während der Reinigung kann die Luftröhre in den Rachen oder unterhalb der Bifurkation statt. Allerdings sollte mit Vorsicht vorgegangen werden nicht zur direkten Anwendung der Zange an der Luftröhre selbst werden. Einer feinen Schere verwendet werden, um abgeschnitten umgebenden Gewebe werden, aber der Schnitt immer vor parallel zu der Trachea werden, um Schäden zu vermeiden. Dieser Teil des Verfahrens wird erleichtert, wenn die Luftröhre Zubereitung unter der Bifurkation und oberhalb des Pharynx auf eine Sylgard-beschichteten Schale gemerkt (Sylgard 184 SiliconelastomerElastomer-, Dow Corning Corp, Midland, MI). </li><li> Nach dem Entfernen umliegenden Gewebes, wird die Luftröhre unterhalb des Rachens und der Bronchien Bifurkation oben geschnitten und vorsichtig auf den Kraftaufnehmer Drähte montiert. </li><li> Die Trachea wird über zwei L-förmigen Metallstäben (2A) geschraubt. Ein Stift ist mit einem Kraft-Weg-Wandler für die kontinuierliche Aufzeichnung der isometrischen Spannung verbunden. Ein weiterer Stift ist zu einem Mikrometer verbunden. Das Gewebe Bad wird dann angehoben, so dass die Luftröhre in PSS eingetaucht ist. Montage der Luftröhre sollte so schnell wie möglich erfolgen, um die Zeit, die Luftröhre von außen PSS gehalten zu minimieren. Mit etwas Übung können Montage der Luftröhre innerhalb einer Minute durchgeführt werden, aber wir generell mal länger als 3 Minuten, um zu vermeiden Verlust der Lebensfähigkeit zu vermeiden. </li><li> Das Mikrometer eingestellt langsam auf eine passive Spannung von ~ 10 mN (~ 1 g-force) zu erhalten. Die optimale Ruhespannung wurde empirisch bestimmt und wir haben diese passive Spannung von ~ 5 gefunden - 10 mN Ergebnisse in einer äquivalenten, maximale Reaktion auf hohe Kalium-Stimulation. Dies steht im Einklang mit einer Reihe von anderen Studien, die eine passive Spannung in diesem Bereich 16,17,18 nutzen. In den ersten 5-10 Minuten, neigt Trachea passive Spannung leicht zurückgehen (Spannungsrelaxation Phänomen) und das Mikrometer verwendet wird, um die passive Spannung auf ~ 10 mN während der Äquilibrierung einzustellen. Die Luftröhre ist berechtigt, für mindestens 1 Stunde vor der experimentellen Herausforderungen Gleichgewicht zu bringen. </li></ol> 3. Hohe Kalium-Stimulation Nach der Äquilibrierung wird die Trachea zweimal mit einer hohen Kalium-PSS-Lösung (67 mM KCl, Tabelle I) herausgefordert. Die Kontraktion erfordert im Allgemeinen ~ 5-10 Minuten zu erreichen stationären Zustand, in dem Bad wird das Gewebe mehrfach mit normalen PSS gespült, um vollständig zu entspannen die Luftröhre. Das Kalium Kontraktion ein zweites Mal wiederholt, und ein drittes Mal (falls nötig) bis reproduzierbare Kontraktionen erhalten. <pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Kontraktion durch elektrische Stimulation evozierte Die Luftröhre wird von zwei rechteckigen Platin Platten (Elektroden), die elektrische Feld-Stimulation (EFS) ermöglicht die Herstellung flankiert. Die kontraktile Antwort auf EFS ist eine Funktion der Frequenz und Spannung. Es wird auch durch physikalische Parameter, wie die Fläche der Elektroden und der Abstand zwischen ihnen betroffen sind. Die Leistungscharakteristik des Stimulators auch Auswirkungen auf Antworten, so dass bei höheren Spannungen und Stromausgänge der Stimulator kann ihr Maximum erreicht. Die Eigenschaften eines EFS-System sollte durch die Untersuchung der Muskel kontraktile Antworten bei unterschiedlichen Laufzeiten Reiz, Frequenzen, Spannungen und Pulsdauern bestimmt werden. Für unseren experimentellen Aufbau haben wir gefunden, dass sich die Elektroden von ~ 4 mm abgetrennt und Stimulationsamplitude von 44 V (0,5 ms Impulse) und 30 Hz optimal reproduzierbare annähernd maximalen kontraktilen Antworten zu erreichen. 5. Die Kontraktion Evoked durch cholinerge Stimulation Das Ansprechverhalten der Trachea auf exogen aufgebrachten Verbindungen erfolgt entweder durch Zugabe einer Einzeldosis des Arzneimittels von Interesse bewertet oder durch mehrfache Zugaben des Arzneimittels in einer kumulativen Dosis Mode. Für die Luftröhre, unserem Labor routinemäßig Carbachol verwendet werden, um cholinerge Rezeptoren aktivieren, denn anders als Acetylcholin, Carbachol ist nicht abgebaut durch Acetylcholinesterase. Eine vernünftige Dosis-Wirkungs-Bereich reicht von 10 -8 bis 10 -5 M Carbachol. Montage des Log [Carbachol]-kontraktilen Antwort-Kurve mit einer Hill-Typ-Gleichung erlaubt eine Abschätzung der EC 50 (halbmaximale effektive Konzentration), die ein Maß für die Empfindlichkeit des trachealen Kontraktion der cholinerge Agonist 19 ist. Es ist bemerkenswert, dass eine bestimmte Dosis von Carbachol wird eine etwas stärkere Reaktion als eine einzelne Dosis als im Rahmen einer kumulativen Dosis-Wirkungs-Kurve geben. 6. Repräsentative Ergebnisse </p&gt; Ein Beispiel für eine Kontraktionsreaktion zu hohen Kalium in 3A gezeigt. Die Kontraktion erreicht ein Maximum innerhalb von ca. 10 Minuten, kann aber einen kleinen Rückgang danach zeigen. Während der frühen Auswaschung der hohe Kalium, kann der Muskel zeigen ein vorübergehender Anstieg der Kontraktion, die durch eine Absenkung der Temperatur als die kleinen Volumen von unbeheizten PSS-Lösung in den Zeilen-Lösung perfundiert vorübergehend die Vorbereitung ist. Dies kann durch eine minimale Totvolumen in der Röhre, die das erwärmte PSS Reservoir und Gewebebad minimiert werden, und auch durch Austausch Lösung relativ schnell (in der Regel pumpen wir Lösungen bei 100 ml / min). Jedes Präparat wird einige Unterschiede in der kontraktile Reaktion auf Unterschiede in der Muskelmasse oder der Beschädigung während der Präparation entstanden sind. 3B zeigt zwei Luftröhren von verschiedenen Muskelmasse mit hohen Kalium-und Carbachol in Frage gestellt. Obwohl die cholinerge evozierten Kontraktionen unterscheiden, diey sind ähnlich wie nach der Normalisierung der Reaktion mit hohem Kalium-Lösung (3C). 4 zeigt ein Beispiel eines Carbachol (cholinergen) hervorgerufene Kontraktion mit Einzeldosen (A) und eine kumulative Erhöhung (B). Die Lösungen werden direkt Carbachol dem Bad zugegeben und die Blasen Gas hilft bei der ein rasches Mischen. Es ist erwähnenswert, dass die Zugabe einer Einzeldosis (dh 1 uM, 4A) hat einen etwas größeren Reaktion als die entsprechende Konzentration während einer kumulativen Dosis-Wirkungs-Kurve (1 uM, 4B). 4C zeigt ein Diagramm der Kontraktionskraft in Abhängigkeit von Carbachol-Konzentrationen unter Verwendung von Daten aus 4B. Auswirkungen von Carbachol bei 10 -5 M Konzentration zu sättigen. Obwohl cholinergen Agonisten initiiert Kontraktion durch Calcium-Freisetzung Mechanismen, ist ein wesentlicher Bestandteil der Kontraktion auch durch Depolarisation vermittelt undAktivierung der spannungsabhängige Calciumkanäle Kanäle 20. 5A zeigt ein Beispiel für die EFS-evozierten Kontraktionen. Luftröhren stimuliert werden unter Verwendung von 0,5 Millisekunde Dauer, 40-Volt-Impulse bis Kontraktionen ein Plateau (siehe Kasten A1) zu erreichen. Eine Erhöhung der Stimulationsfrequenz bewirkt eine erhöhte kontraktile Reaktion (Frequenz-Antwort-Kurve ist in Abbildung 5B dargestellt). Elektrofeldstimulation wurde gezeigt, dass Kontraktionen überwiegend durch Aktivierung hervorzurufen präsynaptischen Nerven. Dies wird durch die Wirkung von Botulinumtoxin, einem Blocker der Freisetzung von Neurotransmittern, die die Mehrheit der EFS-evozierten Kontraktionen der Luftröhre blockiert 21 belegt. Darüber hinaus Tetrodotoxin, ein Mittel, das Blöcke Na +-Kanäle hemmt auch Nervenaktivität und beseitigt die Reaktion der Luftröhre zu EFS. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der ter den wichtigsten Signalwegen in einer isolierten Luftröhre Vorbereitung. Dargestellt ist ein cholinerger Axonendigung innervieren eines trachealen glatte Muskelzelle ist. Die wichtige Signalwege sind M3 und M2-Muscarin-Acetylcholin-Rezeptor-Aktivierung (mAChR), die Calcium-Freisetzung durch IP3-Rezeptoren (M3) und die Reduktion des cAMP (M2) zu bewirken. M2-Rezeptoren (und einige Beiträge von M3-Rezeptoren) auch dazu führen, cholinerge evozierten Depolarisation, die L-Typ spannungsabhängigen Calcium-Kanäle und Calcium-Einstrom aktiviert. Gemeinsame kontraktilen Agenten und ihre Effektoren sind 1. hohe Kalium (depolarisieren glatter Muskelzellen und cholinerge Axone), 2. elektrisches Feld Stimulation (EFS, depolarisiert cholinerge Axone) und 3. exogene Anwendung von Anticholinergika wie Acetylcholin oder Carbachol (aktiviert muskarinischen Rezeptoren direkt). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der verwendeten Geräte zu messen tracheale Kontraktionen. A. Der Kraftaufnehmer, Mikro-und Gewebe-Bad auf Stützstangen über Schraubklemmen befestigt. Die Trachealring über den oberen und unteren Stangen geschraubt. In dem Diagramm wird das Gewebe Bad unter Herstellung positioniert ist (dh bei der Montage der Trachea auf den Kraftaufnehmer). Während der Kontraktion Studien, wird das Gewebe Bad vertikal, um die Herstellung zu baden bewegt. B. Für Elektrofeldstimulation die untere Stange ist modifiziert, um zwei Platinplatten, die seitlich in die Luftröhre Haltedraht angebracht sind. Die Platin-Platten sind durch elektrische Drähte mit einem Stimulator verbunden sind. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> Abbildung 3. Beispiele für hohe Kalium (67 mM) kontraktile Reaktion der Luftröhre. (A) zeigt doppelte, reproduzierbare Reaktionen auf eine hohe Kalium. (B) Beispiele für kontraktile Reaktion auf Carbachol von zwei verschiedenen Luftröhre. (C) Antworten auf die Luftröhre in B sind ähnlich, wenn normalisierend des hohen Kalium-Reaktion. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiele für Carbachol-induzierte Kontraktionen. (A) Carbachol-induzierte Kontraktionen mit Einzeldosen gefolgt von Auswaschung. (B) Beispiel kumulative Dosis-Wirkungs-Kurve für Trachea in A. (C) Peak Kontraktionen von B als eine Funktion der Carbachol-Konzentration aufgetragen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiele von Kontraktionen durch elektrische Feld Stimulation hervorgerufen. (A) Elektrisches Feld Stimulation der Luftröhre Kontraktion mit 0,5 ms Puls, 40 Volt, und verschiedene Frequenzen Stimulation, wie angegeben. Inset ist zeitexpandierten Kontraktion bei 30 Hz. (B) Peak Kontraktionen von A sind plotted als eine Funktion der Stimulationsfrequenz. Normale PSS <table border="1"><tbody><tr><td> Salz </td><td> Conc. (MM) </td><td> Menge (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 119 </td><td> 13,91 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 4,7 </td><td> 0,7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,18 </td><td> 0,32 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 1,17 </td><td> 0,58 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 18 </td><td> 3,02 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 0,026 </td><td> 0,1 ml 0,5 M </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 11 </td><td> 3,96 </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 12,5 </td><td> 8,56 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 400 ml 10 mM </td></tr></tbody></table> Hohe K + PSS (NaCl KCl und Anpassungen) <table border="1"><tbody><tr><td> Salz </td><td> Conc. (MM) </td><td> Menge (g / 2 L) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 56,7 </td><td> 6,628 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 67 </td><td> 9,991 </td></tr></tbody></table> . Tabelle 1 Rezept für PSS-Lösungen. Hinweis: Die Lösungen werden wöchentlich frisch hergestellt, mit Reinstwasser Qualität Wasser, und werden im Kühlschrank nicht länger als 5 Tage, um Vermeidung einer Kontamination des Wachstums gespeichert.

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T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle.">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li><li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP,+and+PGE2.">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li><li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+(ET(B))+receptor+knockout+mice.">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li><li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M(3)-receptor+knockout+mice:+muscarinic+receptor+function+in+atria,+stomach+fundus,+urinary+bladder,+and+trachea.">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li><li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder.">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li><li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction.">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li><li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"classical"+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice.">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine physiologische Vorbereitung der Atemwege Muskelfunktion zu beurteilen. Wir arbeiten in der Regel 3-4 Organbad Präparate gleichzeitig aber sind vorgefertigte Systeme aus einer Reihe von Anbietern, die simultane Messung von bis zu 8 Zubereitungen (ADInstruments, World Precision Instruments, und Harvard Apparatus) erlauben verfügbar. Wir haben eine Reihe von Kraftaufnehmern und Gewebe Organbäder mit gleichwertigen Ergebnissen genutzt. Allerdings finden wir, dass elektrische Fe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Analog-Digital-Wandler </td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 4/35 </td><td></td></tr><tr><td> Carbachol (Carbamoylcholin Chloride) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C4832 </td><td> 10 -2 M in Wasser (Aliquote können bei -20 ° C gelagert werden) </td></tr><tr><td> Charting Software </td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> Umwälzthermostat </td><td> Haake </td><td> Schwingmühle MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Isometrische Kraftaufnehmer </td><td> Kent Scientific </td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td> Stimulator </td><td> Grass Technologies </td><td> S88 Dual-Ausgang SquPulse sind Stimulator </td><td></td></tr><tr><td> Gewebebad </td><td> WPI </td><td> 47264 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro measurements of tracheal constriction using mice

Transgene und Knockout-Mäusen wurden leistungsfähige Werkzeuge für die Untersuchung der Physiologie und Pathophysiologie der Atemwege 1,2. In-vitro-tensometry von isolierten trachealen Vorbereitungen hat sich als nützlich Assay von glatten Muskelzellen der Atemwege (ASM) kontraktilen Antwort in gentechnisch veränderten Mäusen zu sein. Diese In-vitro tracheale Vorbereitungen sind relativ einfach, bieten eine robuste Antwort, und bewahren Sie sowohl funktionale cholinerge Nervenenden und Muskeln Antworten, auch nach langen Inkubationen. Tracheale tensometry sowie als funktionelle Assays, um eine Vielzahl von Second-Messenger-Signalwege, die Kontraktion der glatten Muskulatur betreffen studieren. Kontraktion in der Luftröhre ist in erster Linie durch parasympathische, cholinerge Nerven, dass Acetylcholin freisetzen auf ASM (1) vermittelt. Die wichtigsten ASM Acetylcholin-Rezeptoren sind muskarinischen M2 und M3, G i / o und Gq gekoppelten Rezeptoren, die jeweils sind <sup&gt; 3,4,5. M3-Rezeptoren hervorrufen Kontraktion durch Kopplung an Gq an Phospholipase C, Anstieg IP3 Produktions-und IP3-vermittelte Calcium-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 3,6,7 aktivieren. M2 / G i / o-Signalisierung wird angenommen, dass Kontraktionen durch Hemmung der Adenylatcyclase, was zu einer Abnahme der cAMP-Spiegel 5,8,9,10 erweitern. Diese Wege bilden die so genannten &quot;Pharmako-Kopplung Kontraktion&quot; der glatten Muskulatur der Atemwege 11. Darüber hinaus beinhaltet cholinergen Signalisierung durch M2-Rezeptoren (und moduliert durch M3-Signalisierung) Wege, die die ASM, die wiederum aktivieren L-Typ, spannungsabhängige Kalziumkanäle (Abbildung 1) und Calcium-Einstrom (so genannte &quot;Erregung und Kontraktion&quot; depolarisieren ) 4,7. Detailliertere Bewertungen auf Signalwege steuern Verengung der Atemwege können 4,12 gefunden werden. Die obigen Wege scheinen zwischen Maus und anderen Spezies konserviert werden. Allerdings unterscheiden sich Maus Luftröhre aus anderen Spezies in einige Signalwege. Am bekanntesten ist ihr Mangel an kontraktilen Antwort auf Histamin und Adenosin 13,14, beide bekannte ASM-Modulatoren in Menschen und anderen Spezies 5,15. Hier stellen wir Protokolle für die Isolierung von murinen Trachealringe und die in vitro-Messung ihrer kontraktilen ausgegeben. Enthalten sind Beschreibungen der Geräte-Konfiguration, Luftröhre Ring Isolation und kontraktilen Messungen. Es werden Beispiele für evozieren Kontraktionen indirekt mit hohem Kalium-Stimulation von Nerven und direkt durch Depolarisation von ASM Muskel zu spannungsabhängigen Calcium-Einstrom aktivieren gegeben (1. Hohe K +, Abbildung 1). Darüber hinaus werden Methoden zur Stimulation von Nerven allein mit elektrischen Feldes Stimulation (2. EFS, Abbildung 1), oder für eine direkte Stimulation der Muskulatur ASM mit exogenen Neurotransmitter, die auf die Badewanne (3. Exogene ACH, Abbildung 1) vorgestellt. Dieses flexibilität und Leichtigkeit der Herstellung macht das isolierte Trachea Ring-Modell eine robuste und funktionelle Assays für eine Vielzahl von Signalwegen in den Atemwegen Kontraktion der glatten Muskulatur beteiligt.

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgene Mäuse sind äußerst nützlich bei der Zuschreibung physiologischen Funktion von Genen. Als solcher Forschung im Allgemeinen und funktionelle Untersuchungen der Atemwege, insbesondere, haben eine bemerkenswerte Verschiebung hin zu Mausmodellen unterzogen. Hier bieten wir Protokolle zur<em&gt; In-vitro-</em&gt; Luftröhre Verengung Studien zur Bewertung der Funktion der glatten Muskulatur in murinen Atemwegen.

In-vitro-Messungen des Tracheal Zusammenziehen mit Mäusen

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

in-vitro-measurements-of-tracheal-constriction-using-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

20.7K Aufrufe.  UT Health Science Center, San Antonio. Transgene Mäuse sind äußerst nützlich bei der Zuschreibung physiologischen Funktion von Genen. Als solcher Forschung im Allgemeinen und funktionelle Untersuchungen der Atemwege, insbesondere, haben eine bemerkenswerte Verschiebung hin zu Mausmodellen unterzogen. Hier bieten wir Protokolle zur In-vitro- Luftröhre Verengung Studien zur Bewertung der Funktion der glatten Muskulatur in murinen Atemwegen.

Serie: In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of the population1,2. Symptoms include spontaneous (tingling, burning, electric-shock like) pain, dysaesthesia, paraesthesia, allodynia (pain resulting from normally non-painful stimuli) and hyperalgesia (an increased response to painful stimuli). The sensory symptoms are co-morbid with behavioural disabilities, such as insomnia and depression. To study chronic neuropathic pain several animal models mimicking peripheral nerve injury have been developed, one of the most widely used is Bennett and Xie's (1988) unilateral sciatic nerve chronic constriction injury (CCI)3 (Figure 1). Here we present a method for performing CCI and testing pain hypersensitivity.
CCI is performed under anaesthesia, with the sciatic nerve on one side exposed by making a skin incision, and cutting through the connective tissue between the gluteus superficialis and biceps femoris muscles. Four chromic gut ligatures are tied loosely around the sciatic nerve at 1 mm intervals, to just occlude but not arrest epineural blood flow. The wound is closed with sutures in the muscle and staples in the skin. The animal is then allowed to recover from surgery for 24 hrs before pain hypersensitivity testing begins.
For behavioural testing, rats are placed into the testing apparatus and are allowed to habituate to the testing procedure. The area tested is the mid-plantar surface of the hindpaw (Figure 2), which falls within the sciatic nerve distribution. Mechanical withdrawal threshold is assessed by mechanically stimulating both injured and uninjured hindpaws using an electronic dynamic plantar von Frey aesthesiometer or manual von Frey hairs4. The mechanical withdrawal threshold is the maximum pressure exerted (in grams) that triggers paw withdrawal. For measurement of thermal withdrawal latency, first described by Hargreaves et al (1988), the hindpaw is exposed to a beam of radiant heat through a transparent glass surface using a plantar analgesia meter5,6. The withdrawal latency to the heat stimulus is recorded as the time for paw withdrawal in both injured and uninjured hindpaws. Following CCI, mechanical withdrawal threshold, as well as thermal withdrawal latency in the injured paw are both significantly reduced, compared to baseline measurements and the uninjured paw (Figure 3). The CCI model of peripheral nerve injury combined with pain hypersensitivity testing provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to modify chronic neuropathic pain. In our laboratory, we utilise CCI alongside thermal and mechanical sensitivity of the hindpaws to investigate the role of neuro-immune interactions in the pathogenesis and treatment of neuropathic pain.

Due to the simplicity of surgery and the robust behavioural outcome, chronic constriction of the sciatic nerve is one of the pre-eminent animal models of neuropathic pain. Within 24 hrs following surgery, pain hypersensitivity is established and can be quantitatively measured using a von Frey aesthesiometer (mechanical test) and plantar analgesia meter (thermal test).

Chronische Verengung des Ischiasnerv und Schmerzen Überempfindlichkeit Testing in Ratten

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of ...

Forschung

Medizin

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart failure. Here, we describe a detailed surgical procedure for creating pressure overload and cardiac hypertrophy in rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. After anesthesia, the trachea is intubated by inserting a cannula through a half way incision made between two cartilage rings of trachea. Then a skin incision is made at the level of the second intercostal space on the left chest wall and muscle layers are cleared to locate the ascending portion of aorta. The ascending aorta is constricted to 50&#8211;60% of its original diameter by application of a small sized titanium clip. Following aortic constriction, the second and third ribs are approximated with prolene sutures. The tracheal cannula is removed once spontaneous breathing was re-established. The animal is allowed to recover on the heating pad by gradually lowering anesthesia. The intensity of pressure overload created by constriction of the ascending aorta is determined by recording the pressure gradient using trans-thoracic two dimensional Doppler-echocardiography. Overall this protocol is useful to study the remodeling events and contractile properties of the heart during the gradual onset and progression from compensated cardiac hypertrophy to heart failure stage.

We describe a stepwise procedure for creating pressure overload and left ventricular hypertrophy in Wistar rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. This model is extensively used for studying remodeling changes during cardiac hypertrophy and for identifying and evaluating strategies for regression of such changes.

Aufsteigend Aortakonstriktion bei Ratten zur Erstellung von Drucküberlast Herzhypertrophie Modell

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Halsschlagader Infusionen für pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Analyse von Taxanen in Mäusen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound and aortic blood pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is raised then lowered incrementally by intravenous infusion of vasoactive drugs phenylephrine and sodium nitroprusside. Aortic diameter is measured for each pressure step to characterize the pressure-diameter relationship of the ascending aorta. Stiffness indices derived from the pressure-diameter relationship can be calculated from the data collected. Calculation of arterial compliance is described in this protocol.
This technique can be used to investigate mechanisms underlying increased aortic stiffness associated with cardiovascular disease and aging. The technique produces a physiologically relevant measure of stiffness compared to ex vivo approaches because physiological influences on aortic stiffness are incorporated in the measurement. The primary limitation of this technique is the measurement error introduced from the movement of the aorta during the cardiac cycle. This motion can be compensated by adjusting the location of the probe with the aortic movement as well as making multiple measurements of the aortic pressure-diameter relationship and expanding the experimental group size.

Measuring Ascending Aortic Stiffness In Vivo in Mice Using Ultrasound

We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.

Mess aufsteigende Aorta Steifigkeit<em&gt; In-vivo-</em&gt; In Mäuse Mit Ultraschall

We present a protocol for measuring in vivo aortic stiffness in mice using high-resolution ultrasound imaging. Aortic diameter is measured by ultrasound ...

A Model of Cardiac Remodeling Through Constriction of the Abdominal Aorta in Rats

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Ein Modell der kardialen Remodeling Durch Zusammenziehen der Bauchaorta bei Ratten

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

Minimal Invasive Quer Aortakonstriktion bei Mäusen

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Technik der minimal-invasiven quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen für Induktion der linken Ventricular Hypertrophie

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to perform a partial thoracotomy to visualize the transverse aortic arch. However, the surgical trauma caused by the thoracotomy in open-chest models changes the respiratory physiology as the ribs are dissected and left unattached after chest closure. To prevent this, we established a minimally invasive, closed chest approach via lateral thoracotomy. Herein we approach the aortic arch via the 2nd intercostal space without entering the chest cavities, leaving the mouse with a less traumatic injury to recover from. We perform this operation using standard laboratory settings for open chest TAC procedures with equal survival rates. Apart from maintaining physiological breathing patterns due to the closed chest approach, the mice seem to benefit by showing rapid recovery, as the less invasive technique appears to facilitate a fast healing process and to reduce immune response after trauma.

Here, we present a protocol of Transverse Aortic constriction (TAC) via a lateral thoracotomy. This technique is a minimally invasive, closed chest surgical procedure aiming to simulate pressure overload and heart failure in mice utilizing standard TAC laboratory settings.

Eine geschlossen Kasten Modell quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen zu induzieren

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to ...