이 작품은 예방에서 혁신 센터와기도 질환, NINDS 교부금 (NS052574)의 치료에서와 천식 연구 샌들러 프로그램에서 교부금에 의해 재정 지원되었다.

1. 장비 수축 측정 장치의 주요 구성 요소) 그림 2A에서 간략하게 구조 표시됩니다. <ol><li> 조직 욕조가. 조직 욕조는 따뜻한 온도에서 산소 생리 솔루션을 유지 관리합니다. 생쥐기도 고리의 경우, 우리는 온난 화 솔루션 fritted 유리 거품 산소에 유입구 (95 % / 5퍼센트 O 2 / CO 2 혼합)와 유입과 변화를위한 콘센트 포트를 순환을 위해 물 재킷을 포함 10 ML 조직 목욕을 사용 솔루션. 저수지의 PSS 솔루션은 95 % 일정한 기포 37 ° C 물 목욕 (보이지 않음).에서 / 5퍼센트 O 2 / CO 2 혼합과 함께 저장됩니다 솔루션 교환의 경우 PSS 솔루션은 비교적 빠른 솔루션의 교환을 허용하도록 저수지에서 약 100 MLS 분당에서 조직 목욕탕 입구 (하단 포트)로 펌핑된다. 솔루션 콘센트는 조직 배트에 일정한 볼륨 (~ 10 ml) 쇼핑있게 오버플 포트 (상단 포트)를 통해서솔루션 교환시 H. 우리는 (37 ° C를 유지하기 위하여) 조직 목욕 자켓을 통해 온수를 공급 Haake 가열 순환 장치를 사용합니다. 조직 온천은 공급 업체의 숫자로부터 얻은 및 수사관의 실험 요구에 맞게 크기와 스타일의 다양한 올 수 있습니다. </li><li> 힘 변환기. 사시 장력을 측정하기 위해서는 기관 튜브는 두 스테인레스 스틸 막대 (그림 2A)의 L-모양의 끝에 걸쳐 스레드됩니다. 치료는 생물 학적 재료와 호환 스테인레스 스틸 유형을 사용하여 촬영해야합니다. 상단 막대는 사시 력 변환기에 클립을 통해 연결되어 있습니다. 아래 막대가 고정 위치에 호흡 관을 보유하고 수동 장력 및 / 또는 근육의 길이 조절을위한 마이크로 미터에 마운트됩니다. 기도의 수축은 preamplifier의 전압 신호로 변환되는 힘 변환기, 대한 긴장을 만듭니다. 아래 막대는 또한 두 직사각형 백금 접시 (간격 4mm) T를 포함하도록 구성되어있을 수 있습니다<html> 모자 측면기도 (그림 2B). 백금 접시는 기관 전체 전기장의 전송을 허용 잔디 S88 자극기로 입금됩니다. 오픈 와이어와 솔더는 목욕 용액에 금속의 침출을 방지하기 위해, Sylgard (Sylgard 184 실리콘 엘라스토머, 다우 코닝 사, 미들랜드, MI)에 입혀져 있습니다. </li><li> A / D 변환기, 컴퓨터 및 인수 소프트웨어. 신호 preamplifiers에서이 MacLab 8 / D 시스템에 기록됩니다. 이것은 현재 ADInstrument Powerlab 하드웨어의 이전 버전입니다. 우리는 실험을하는 동안 긴장의 연속 녹음을 허용 프로그램 차트 (ADInstruments)을 사용합니다. 기도 근육의 장력 세대는 매우 느린이며, 따라서 우리는 초당 100 포인트의 인수가 적합 찾습니다. 장력 측정은 각 실험 전에 알려진 가중치를 (최대 5g)을 사용하여 보정한다. 비슷한 시스템은 다른 venders (예 : BioPac, GW 스트 루먼트)에서 사용할 수 있습니다. </li></ol>제목 &quot;&gt; 2. 기관 격리 <ol><li> 조직 분리하기 전에 힘 변환기는 알려진 아령으로 보정하고, 조직 목욕이 (내가 표 참조) 정상 PSS으로 가득합니다. 공기 유입구는 O 2 / CO 2의 빛을 스트림을 얻기 위해 조정됩니다. </li><li> 이개월 세 이상의 생쥐의 Tracheas이 최적입니다. 어린 동물이 사용되지만 이들로부터 얻은 tracheas가 큰 스킬 때문에 그들의 작은 크기의 힘 변환기 와이어에 마운트하도록 요구받을 수도 있습니다. 해부하기 전에, 마우스는 깊이 isoflurane으로 마취합니다. 포셉과 발가락 - 핀치는 반응을 유도 수 없을 때 진정 작용의 적절한 수준에 도달하고 있습니다. 마우스가 즉시 경추 탈구에 의해 희생되는 중요 사항은 :. 우리는 Avertin (Tribromoethanol)는, 일반적으로 생쥐에 사용되는 진정제는기도 평활근에 대한 강력한 이완 효과를 가지고 있으며, 따라서기도의 수축 연구에 사용해서는 안된다는 관찰했습니다. </li><li> 피부 (및 모피)은 흉부에서 목에 제거됩니다. RIBS는 흉골의 기지에서 laterally (양면) 심장의 정상에 버렸어요. 흉골과 늑골 그러면 심장 / 폐, thymus, 호흡 관 (복부)과 식도를 (-과기도로 지느러미에 붙어) 표시하는 방법으로 목을 앞으로 가져온됩니다. </li><li> 기도는 기관지 분기점 아래와 인두 위의 절단에 의해 excised됩니다. 기도는 얼음처럼 차가운 산소 (95 / 5) PSS 용액 (표 I에서 주어진 조성)에 배치됩니다. </li><li> 호흡 관은 주변 조직의 깨끗한를 해부한다. 청소하는 동안 기관은 인두 혹은 분기점 아래 개최됩니다. 그러나,주의는 직접적으로기도 자체에 포셉을 적용하지 않기로 이동해야합니다. 좋은 가위는 주변 조직을 잘라하는 데 사용될 수 있지만, 상처는 항상 손상을 방지하기 위해 기관 평행하여야한다. 기도 준비가 Sylgard - 코팅 접시에 분기점 아래와 인두 위의 고정된 경우 프로 시저의이 부분은 (Sylgard 184 실리콘 용이합니다엘라스토머, 다우 코닝 사, 미들랜드, MI). </li><li> 주변 조직을 제거 후, ​​호흡 관이 인두 아래와 기관지 분기 위의 절단하고 부드럽게 힘 변환기 와이어에 장착된. </li><li> 호흡 관은 두 개의 L 자형 금속 접지 단자 (그림 2A)를 통해 스레드됩니다. 하나의 접지 단자가 사시 긴장의 연속 녹음 힘 - 변위 변환기에 연결됩니다. 또 다른 접지 단자가 마이크로 미터에 연결되어 있습니다. 조직 목욕탕 그러면기도가 PSS에 잠겨 있도록 증가합니다. 기도의 장착은 호흡 관은 PSS 밖에서 개최되는 시간을 최소화하기 위해 최대한 빨리 완료되어야합니다. 연습을 통해 기관의 장착은 한 분 내로 다하지만 우리는 일반적으로 생존의 손실을 피하기 위해 배 이상 삼분 이상 피할 수 있습니다. </li><li> 마이크로 미터는 천천히 ~ 10 MN (~ 1 그람 력)의 수동 장력을 얻기 위해 조정됩니다. 최적의 휴식 긴장감을 경험적으로 결정되었고 우리는 ~ 5의 수동 장력 발견 - 1높은 칼륨 자극에 상응하는, 최대한의 반응에 0 MN 결과입니다. 이것은이 범위 16,17,18의 수동적인 긴장을 활용할 다른 연구의 번호와 일치합니다. 첫 5-10분이 지남에기도 수동적 장력은 다소 거절 (응력 이완 현상)와 마이크로 미터는 평균시 ~ 10 MN에 수동 장력을 조정하는 데 사용되는 경향이있다. 호흡 관은 실험적인 도전을하기 전에 최소한 1 시간 동안 평형 수 있습니다. </li></ol> 3. 높은 칼륨 자극 같은 평형은 호흡 관은 높은 칼륨의 PSS 용액 (67 MM KCl, 표 I)와 함께 두 번 도전한다. 수축은 일반적으로 조직 목욕 완전히 호흡 관을 이완시키는 일반적인 PSS와 함께 여러 번 씻어서되어 정상 상태 어느 시점에 도달 ~ 5-10분이 필요합니다. 칼륨 수축은 두 번 반복하고, 재현성 수축까지 세 번째는 (필요한 경우)를 얻을 수 있습니다. <p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 전기적 자극에 의​​해 수축 Evoked 호흡 관은 준비에 전기장 자극 (EFS)를 허용 두 직사각형 백금 접시 (전극)의 어귀됩니다. EFS에 대한 수축성 반응은 주파수 및 전압의 함수입니다. 그것은 또한 전극의 면적과 그들 사이의 거리와 같은 물리적 매개 변수에 의해 영향을받습니다. 자극기의 전원 특성은 또한 높은 전압과 전류 출력에 자극기가 최대에 도달할 수 있도록 응답에 영향을 미칩니다. 모든 EFS 시스템의 특징은 자극 기간이, 주파수, 전압 및 펄스 기간이 서로 다른시 근육 수축성 반응을 검토하여 결정하여야한다. 우리의 실험적인 설정을 위해서는 ~ 4mm로 구분하여 전극, 44 V (0.5 MS 펄스) 30 Hz의 자극 진폭이 재현할 거의 최대한의 수축성 반응을 달성하기 위하여 최적있는 것으로 나타났습니다. 5. 수축 에버스먼Cholinergic 자극에 의​​해 oked exogenously 적용 화합물에 대한기도의 응답 속도는 누적 선량 방식으로 약물의 복합 첨가하여 관심있는 약물의 단일 복용의 추가로 중 평가를하거나합니다. 기도 내용은 저희 연구실은 정기적으로 아세틸콜린 달리 carbachol은 acetylcholinesterase에 의해 저하된 아니라, 때문에 cholinergic 수용체를 활성화 carbachol를 사용했습니다. 합리적인 선량 - 반응 범위가 10 -8에서 10 -5 M carbachol에있다. 로그 있으 힐 타입의 방정식과 [carbachol]-수축성 반응 곡선은 cholinergic 작용제 19 tracheal 수축의 감성을 측정하기위한 한 방법입니다 EC 50 (반 최대한의 효과적인 농도)의 추정이 가능합니다. 그것은 carbachol의 주어진 복용이 누적 선량 반응 곡선의 일환으로보다 단일 복용과 같은 약간 큰 응답을 줄 것이다 협조할 것입니다. 6. 대표 결과 </p&gt; 높은 칼륨의 수축성 응답의 예제는 그림 3A에 표시됩니다. 수축은 약 10 분 이내에 최대에 도달하지만, 그 이후 작은 하락을 보여주 수도 있습니다. 높은 칼륨의 초반 막가는 인생 동안 근육이 솔루션 라인에 unheated PSS 솔루션의 작은 볼륨 transiently 준비를 perfuses로의 온도 강하에 의한 수축에 과도 증가를 보여줄 수 있습니다. 이것은 온수 PSS 저장조 및 조직 목욕을 연결 튜브의 최소 죽은 볼륨을함으로써 최소화하며 비교적 신속하게 솔루션을 교환하여 (일반적으로 우리는 ML / 분 100으로 솔루션을 펌프) 할 수 있습니다. 각각의 준비는 근육량이나 절개 중에 발생한 손상의 차이로 인해 수축성 반응에 약간 차이가납니다. 그림 3B 높은 칼륨과 carbachol 맡고 다른 근육 질량의 두 tracheas를 보여줍니다. cholinergic-evoked 수축이 다를 수 있지만,y는 정상화 이후 높은 칼륨 용액 (그림 3C)와 응답과 비슷합니다. 그림 4는 단일 복용 () 및 누적 증가 (B)를 사용 carbachol (cholinergic) evoked 수축의 예를 보여줍니다. carbachol 솔루션은 목욕탕에 직접 추가되고 부풀어 오른 가스 신속한 혼합에 도움이됩니다. 단일 복용 (예 : 1 μm의 그림 4A)의 추가 협조할 누적 선량 - 반응 곡선 (1 μm의 그림 4B) 동안 이에 상응하는 농도보다 약간 큰 반응이 그것이다. 그림 4C는 수축 부대의 음모를 보여준다 그림 4B의 데이터를 사용 carbachol 농도의 함수로. carbachol의 영향은 10 -5 M 농도로 포화시키다. cholinergic agonists는 칼슘 릴리스 메커니즘을 통해 수축을 시작했지만, 수축의 실질적인 구성 요소는 탈분극에 의해 중재되고전압 의존 칼슘 채널 활성화 20. 그림 5A는 EFS-evoked 수축의 예를 보여줍니다. Tracheas은 수축 고원을 (삽입된 페이지 A1 참조)에 도달할 때까지 0.5 밀리초 기간, 40 볼트의 펄스를 사용하여 자극하고 있습니다. 자극 주파수에있는 증가는 증가 수축성 응답 (주파수 응답 곡선은 그림 5B에 꾸몄다되는)을 일으 킵니다. 전기장 자극은 presynaptic 신경을 활성화하여 주로 수축 연상을 보여줘왔다. 이것은 보톨리누스, 기관 21 EFS-evoked 수축의 대부분을 차단 신경 전달 물질 방출의 차단 효과에 의해 입증된다. 또한, 테트로도톡신, 블록 나 + 채널은 또한 신경 활동을 억제 및 EFS에 대한기도의 응답을 제거하는 요원. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> 그림 1. 전술 다이어그램그는 고립된기도 준비에서 신호 전달 경로를 전공. 표시된 것은 tracheal 평활근 세포를 innervating cholinergic 축삭 단자입니다. 주요 신호 경로는 IP3 수용체 (M3)와 캠프의 감소 (M2)를 통해 칼슘 방출을 일으킬 M3 및 M2-muscarinic 아세틸콜린 수용체 활성화 (mACHR)입니다. M2 수용체 (그리고 M3 수용체의 일부 기여)도 L-타입 전압 의존 칼슘 채널과 칼슘 유입을 활성화 cholinergic-evoked 탈분극의 원인이됩니다. 일반 수축성 대리인 및 그 effectors은 1입니다. 높은 칼륨 (평활근 세포와 cholinergic의 축삭 depolarize), 2. 전기장 자극 (EFS, cholinergic 축삭을 depolarizes) 및 3. 이러한 아세틸콜린이나 carbachol 같은 cholinergic 에이전트의 외인성 신청서 (직접 muscarinic 수용체를 활성화). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> 그림 2. tracheal 수축을 측정하는 데 사용되는 장비의 다이어그램. A. 힘 변환기, 마이크로 미터 및 조직 목욕은 나사 클램프를 통해 봉을 지원에 마운트됩니다. tracheal 고리는 상단과 하단 봉을 통해 스레드됩니다. 다이어그램에서 조직 목욕은 (힘 변환기에 호흡 관으로 장착하는 동안 IE)를 준비 아래에 위치하고 있습니다. 수축 과정 동안 조직 목욕은 준비 목욕을 수직으로 이동합니다. 전기장 자극 하단 봉의 경우 B.는 기관의 지주 와이어로 laterally 마운트된 두 개의 백금 판을 포함하도록 수정됩니다. 백금 접시는 자극기로 전기 배선으로 연결됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> 그림 3. 높은 칼륨의 예 (67 ㎜)기도의 수축성 반응. (A) 높은 칼륨에 대한 중복, 재현성 응답을 보여줍니다. (B) 두 가지 tracheas의 carbachol에 수축성 반응의 예. 정상화되면 (C) B의 tracheas에 응답 유사높은 칼륨 대응 라. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> 그림 4. carbachol 유도된 수축의 예. () 단일 썼다 Carbachol 유도된 수축이 막가는 인생으로 따라갔다. A.의기도 (C) B에서 피크의 수축을위한 (B) 예 누적 선량 - 반응 곡선은 carbachol 농도의 함수로 꾸몄다됩니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> 그림 5. 전기장 자극에 의해 evoked 수축의 예. 0.5 MS 펄스, 40 볼트, 다양한 자극 주파수를 사용하여기도의 수축 () 전기장 자극은 지적했다. 삽입된 페이지 30 Hz에서에서 시간을 확장 수축입니다. (B)에서 피크 수축이 plotte 있습니다자극 주파수의 함수로 라. 일반 PSS <table border="1"><tbody><tr><td> 소금 </td><td> Conc. (㎜) </td><td> 금액 (G / 2 패) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 119 </td><td> 13.91 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 4.7 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.18 </td><td> 0.32 </td></tr><tr><td> MgSO 4 X 7H 2 O </td><td> 1.17 </td><td> 0.58 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 18 </td><td> 3.02 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 0.026 </td><td> 0.5 M의 0.1 ML </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 11 </td><td> 3.96 </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 12.5 </td><td> 8.56 </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 </td><td> 10 MM 400 ML </td></tr></tbody></table> 하이 K + PSS (NAC리터와 KCl 조정) <table border="1"><tbody><tr><td> 소금 </td><td> Conc. (㎜) </td><td> 금액 (G / 2 패) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 56.7 </td><td> 6.628 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 67 </td><td> 9.991 </td></tr></tbody></table> . PSS 솔루션에 대한 표 1 레시피 참고 :. 솔루션은 ultrapure 품질 물로, 매주 신선한 만들어진, 그리고 성장 오염을 막기 위해 오일보다 더 이상 위해 냉장고에 저장됩니다.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+the+SERCA3+gene+alters+epithelium-dependent+relaxation+in+mouse+tracheal+smooth+muscle.">Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).</li><li>Krane, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin+5-deficient+mouse+lungs+are+hyperresponsive+to+cholinergic+stimulation.">Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).</li><li>Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle.">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li><li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP,+and+PGE2.">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li><li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+(ET(B))+receptor+knockout+mice.">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li><li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M(3)-receptor+knockout+mice:+muscarinic+receptor+function+in+atria,+stomach+fundus,+urinary+bladder,+and+trachea.">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li><li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder.">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li><li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction.">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li><li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+"classical"+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice.">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기에 제시된 프로토콜은기도 근육의 기능을 평가하는 생리적 준비를 제공합니다. 우리는 일반적으로 동시에 3-4 장기 목욕 준비를 운영하지만, prepackaged 시스템은 8 준비 (ADInstruments, 세계 정밀 계측기, 그리고 하버드 장치)까지 동시 측정을 허용 공급 업체에서 제공합니다. 우리는 이에 상응하는 결과를 강제로 트랜스 듀서 및 조직 장기 온천의 번호를 이용했습니다. 그러나 전기장 자극은 자극 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 아날로그 - 디지털 컨버터 </td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 35분의 4 </td><td></td></tr><tr><td> Carbachol (Carbamoylcholine 염화) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C4832 </td><td> 물에 10 -2 M (aliquots는 -20 ° C에 저장할 수 있습니다) </td></tr><tr><td> 차트 소프트웨어 </td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td> 난방 순환 장치 </td><td> Haake </td><td> 믹서 밀 MM400 </td><td></td></tr><tr><td> 사시 포스 트랜스 듀서 </td><td> 켄트 과학 </td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td> 자극기 </td><td> 잔디 기술 </td><td> S88 듀얼 출력 Squ펄스 자극기입니다 </td><td></td></tr><tr><td> 조직 바스 </td><td> WPI </td><td> 47,264 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro measurements of tracheal constriction using mice

유전자 변형 및 녹아웃 마우스는 항공 1,2의 생리학과 pathophysiology의 조사를위한 강력한 도구왔다. 격리된 tracheal 준비 시험 관내 tensometry에서기도 부드러운 근육 (ASM) 유전자 변형 생쥐의 수축성 응답의 유용한 분석 것으로 입증되었습니다. 체외 tracheal 준비에 이들은 비교적 간단이며, 강력한 응답을 제공하고, 기능 cholinergic 신경 엔딩과 근육 반응도 긴 incubations 후 양쪽을 유지합니다. Tracheal tensometry 또한 평활근의 수축에 영향을 미치는 두번째 메신저 신호 경로의 다양성을 공부하는 기능적 분석을 제공합니다. 기도의 수축은 주로 ASM (그림 1)에 아세틸콜린을 공개한다는 parasympathetic, cholinergic 신경에 의해 매개된다. 주요 ASM 아세틸콜린 수용체는 각각 G I / O 및 GQ 결합 수용체입니다 muscarinic M2와 M3입니다 <suP&gt; 3,4,5. M3 수용체는 포스 포 라이 페이스 C, sarcoplasmic reticulum 3,6,7의 증가 IP3 생산과 IP3-매개 칼슘 릴리스를 활성화하기 위해 GQ에 결합하여 수축을 보여주고 있습니다. M2 / G I / O 신호는 캠프 레벨 5,8,9,10의 감소로 이어지는 adenylate cyclase의 억제에 의해 수축을 향상시키기 위해 생각됩니다. 이러한 경로는기도 부드러운 근육 11 일 소위 &quot;pharmaco - 수축 결합&quot;을 구성합니다. 또한, M2 수용체를 통해 cholinergic 신호 (및 M3 신호에 의해 변조된)가 차례로 L-타입, 전압 의존 칼슘 채널 (그림 1) 그래서 &quot;여기 - 수축 결합&quot;이라는 칼슘 유입을 (활성화하는 ASM을 depolarize 경로를 포함 ) 4,7. 기도 수축을 제어 경로 신호에 대한 더 자세한 리뷰는 4,12를 찾을 수 있습니다. 위의 경로는 생쥐와 다른 종 사이에 보존되어있는 것으로 나타났습니다. 그러나 마우스 tracheas 다른 종의 차이가 나는N 일부는 경로 신호. 가장 눈에 띄는는 히스타민과 아데노신 13,14으로 수축성 반응, 인간과 다른 종의 5,15에서 모두 잘 알려진 ASM 변조기 그들의 부족이다. 여기 murine tracheal 반지의 절연을위한 프로토콜과 수축성 출력의 체외 측정에서 제시. 포함하는 장비 구성에 대한 설명이며, 호흡 관 링 절연 및 수축성 측정. 예제는 전압 의존 칼슘 유입을 활성화 높은 칼륨 신경의 자극과 직접적으로 ASM 근육의 탈분극하여 사용하여 간접적으로 수축을 evoking 위해 제공됩니다 (1. 높은 K +, 그림 1). 또한, 방법은 전기장 자극을 (2. EFS 그림 1) 외인성 신경 전달 물질을 사용하여 ASM 근육, 또는 직접적인 자극이 목욕탕 (3. 외인성 ACH, 그림 1)에 적용된 사용 혼자 신경 stimulations 위해 제공됩니다. 이 flexibility와 준비의 용이성은 절연 기관 링 모델에게기도 평활근의 수축에 관여 폭포 신호의 숫자를위한 강력하고 기능적인 분석을 렌더링.

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

형질 전환 생쥐는 유전자로 생리 기능을 ascribing에서 매우 유용한되었습니다. 일반적으로 같은, 연구하고,기도의 기능적 연구로서 특히, murine 모델 향한 놀라운 변화를받은. 여기에 대한 프로토콜을 제공<em&gt; 체외에서</em&gt;기도의 수축 연구 murine기도의 평활근 기능을 평가합니다.

마우스를 사용 Tracheal 수축의 체외 측정에서

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

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Research

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Medicine

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

20.6K 조회수.  UT Health Science Center, San Antonio. 형질 전환 생쥐는 유전자로 생리 기능을 ascribing에서 매우 유용한되었습니다. 일반적으로 같은, 연구하고,기도의 기능적 연구로서 특히, murine 모델 향한 놀라운 변화를받은. 여기에 대한 프로토콜을 제공 체외에서기도의 수축 연구 murine기도의 평활근 기능을 평가합니다.

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Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of the population1,2. Symptoms include spontaneous (tingling, burning, electric-shock like) pain, dysaesthesia, paraesthesia, allodynia (pain resulting from normally non-painful stimuli) and hyperalgesia (an increased response to painful stimuli). The sensory symptoms are co-morbid with behavioural disabilities, such as insomnia and depression. To study chronic neuropathic pain several animal models mimicking peripheral nerve injury have been developed, one of the most widely used is Bennett and Xie's (1988) unilateral sciatic nerve chronic constriction injury (CCI)3 (Figure 1). Here we present a method for performing CCI and testing pain hypersensitivity.
CCI is performed under anaesthesia, with the sciatic nerve on one side exposed by making a skin incision, and cutting through the connective tissue between the gluteus superficialis and biceps femoris muscles. Four chromic gut ligatures are tied loosely around the sciatic nerve at 1 mm intervals, to just occlude but not arrest epineural blood flow. The wound is closed with sutures in the muscle and staples in the skin. The animal is then allowed to recover from surgery for 24 hrs before pain hypersensitivity testing begins.
For behavioural testing, rats are placed into the testing apparatus and are allowed to habituate to the testing procedure. The area tested is the mid-plantar surface of the hindpaw (Figure 2), which falls within the sciatic nerve distribution. Mechanical withdrawal threshold is assessed by mechanically stimulating both injured and uninjured hindpaws using an electronic dynamic plantar von Frey aesthesiometer or manual von Frey hairs4. The mechanical withdrawal threshold is the maximum pressure exerted (in grams) that triggers paw withdrawal. For measurement of thermal withdrawal latency, first described by Hargreaves et al (1988), the hindpaw is exposed to a beam of radiant heat through a transparent glass surface using a plantar analgesia meter5,6. The withdrawal latency to the heat stimulus is recorded as the time for paw withdrawal in both injured and uninjured hindpaws. Following CCI, mechanical withdrawal threshold, as well as thermal withdrawal latency in the injured paw are both significantly reduced, compared to baseline measurements and the uninjured paw (Figure 3). The CCI model of peripheral nerve injury combined with pain hypersensitivity testing provides a model system to investigate the effectiveness of potential therapeutic agents to modify chronic neuropathic pain. In our laboratory, we utilise CCI alongside thermal and mechanical sensitivity of the hindpaws to investigate the role of neuro-immune interactions in the pathogenesis and treatment of neuropathic pain.

Due to the simplicity of surgery and the robust behavioural outcome, chronic constriction of the sciatic nerve is one of the pre-eminent animal models of neuropathic pain. Within 24 hrs following surgery, pain hypersensitivity is established and can be quantitatively measured using a von Frey aesthesiometer (mechanical test) and plantar analgesia meter (thermal test).

좌골 신경 및 쥐의 통증 과민성 시험의 만성 수축

Chronic neuropathic pain, resulting from damage to the central or peripheral nervous system, is a prevalent and debilitating condition, affecting 7-18% of ...

연구

의학

Ascending Aortic Constriction in Rats for Creation of Pressure Overload Cardiac Hypertrophy Model

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart failure. Here, we describe a detailed surgical procedure for creating pressure overload and cardiac hypertrophy in rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. After anesthesia, the trachea is intubated by inserting a cannula through a half way incision made between two cartilage rings of trachea. Then a skin incision is made at the level of the second intercostal space on the left chest wall and muscle layers are cleared to locate the ascending portion of aorta. The ascending aorta is constricted to 50&#8211;60% of its original diameter by application of a small sized titanium clip. Following aortic constriction, the second and third ribs are approximated with prolene sutures. The tracheal cannula is removed once spontaneous breathing was re-established. The animal is allowed to recover on the heating pad by gradually lowering anesthesia. The intensity of pressure overload created by constriction of the ascending aorta is determined by recording the pressure gradient using trans-thoracic two dimensional Doppler-echocardiography. Overall this protocol is useful to study the remodeling events and contractile properties of the heart during the gradual onset and progression from compensated cardiac hypertrophy to heart failure stage.

We describe a stepwise procedure for creating pressure overload and left ventricular hypertrophy in Wistar rats by constriction of the ascending aorta using a small metallic clip. This model is extensively used for studying remodeling changes during cardiac hypertrophy and for identifying and evaluating strategies for regression of such changes.

압력 과부하 심장 비대 모델의 창조를위한 쥐의 대동맥 수축 오름차순

Ascending aortic constriction is the most common and successful surgical model for creating pressure overload induced cardiac hypertrophy and heart ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

A Model of Cardiac Remodeling Through Constriction of the Abdominal Aorta in Rats

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

쥐의 복부 대동맥의 수축을 통해 심장 리모델링의 모델

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and ...

Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard open-chest transverse aortic constriction (TAC). Although transverse aortic constriction is a highly functional method for the induction of high pressure in the left ventricle, it is a more difficult and lengthy procedure due to its use of artificial ventilation with tracheal intubation. TAC is oftentimes also less survivable, as the newer method, MTAC, neither requires the cutting of the ribs and intercostal muscles nor tracheal intubation with a ventilation setup. In MTAC, as opposed to a thoracotomy to access to the chest cavity, the aortic arch is reached through a midline incision in the anterior neck. The thyroid is pulled back to reveal the sternal notch. The sternum is subsequently cut down to the second rib level, and the aortic arch is reached simply by separating the connective tissues and thymus. From there, a suture can be wrapped around the arch and tied with a spacer, and then the sternal cut and skin can be closed. MTAC is a much faster and less invasive way to induce left ventricular hypertension and enables the possibility for high-throughput studies. The success of the constriction can be verified using high-frequency trans-thoracic echocardiography, particularly color Doppler and pulsed-wave Doppler, to determine the flow velocities of the aortic arch and left and right carotid arteries, the dimension of the blood vessels, and the left ventricular function and morphology. A successful constriction will also trigger significant histopathological changes, such as cardiac muscle cell hypertrophy with interstitial and perivascular fibrosis. Here, the procedure of MTAC is described, demonstrating how the resulting flow changes in the carotid arteries can be examined with echocardiography, gross morphology, and histopathological changes in the heart.

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) conserves the essentials of regular transverse aortic constriction (TAC) while eliminating the use of a ventilator with tracheal intubation. It proves to be a highly desirable method for high-throughput studies on left ventricular overload, particularly in translational studies.

마우스의 최소 침습 가로 대동맥 수축

Minimally invasive transverse aortic constriction (MTAC) is a more desirable method for the constriction of the transverse aorta in mice than standard ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

왼쪽된 심 실 비 대의 유도 대 한 생쥐에서 최소 침 습 가로 대동맥 수축의 기술

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

A Closed-chest Model to Induce Transverse Aortic Constriction in Mice

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to perform a partial thoracotomy to visualize the transverse aortic arch. However, the surgical trauma caused by the thoracotomy in open-chest models changes the respiratory physiology as the ribs are dissected and left unattached after chest closure. To prevent this, we established a minimally invasive, closed chest approach via lateral thoracotomy. Herein we approach the aortic arch via the 2nd intercostal space without entering the chest cavities, leaving the mouse with a less traumatic injury to recover from. We perform this operation using standard laboratory settings for open chest TAC procedures with equal survival rates. Apart from maintaining physiological breathing patterns due to the closed chest approach, the mice seem to benefit by showing rapid recovery, as the less invasive technique appears to facilitate a fast healing process and to reduce immune response after trauma.

Here, we present a protocol of Transverse Aortic constriction (TAC) via a lateral thoracotomy. This technique is a minimally invasive, closed chest surgical procedure aiming to simulate pressure overload and heart failure in mice utilizing standard TAC laboratory settings.

마우스에 가로 대동맥 수축 유도를 폐쇄 가슴 모델

Research on cardiac hypertrophy and heart failure is frequently based on pressure overload mouse models induced by TAC. The standard procedure is to ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Sleeve Gastrectomy in Mice using Surgical Clips

The number of people who are overweight and obese is continually increasing both in the adult and adolescent populations. This coincides with the increased universal phenomenon of type 2 diabetes (T2D) and other metabolic problems. Bariatric surgery, such as SG, is currently one of the most effective and commonly used long-term treatment for obesity and T2D, but the association between them is not completely explored yet. The mechanisms underlying the outcomes seen after bariatric surgery in humans can be investigated based on preclinical animal studies. The SG reduces body weight, glucose levels and many metabolic parameters, and is easy to perform with a low incidence of complications. The goal of this work is to provide a simple method and an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery in animals for researchers.

The prevalence of diabetes and obesity is continuously increasing worldwide. The mechanisms between diabetes, obesity and their associated mortality and co-morbidities need to be further investigated. Here, we present a protocol for sleeve gastrectomy (SG) in animals as an uncomplicated preclinical model of bariatric surgery.