Este protocolo fue desarrollado gracias a una subvención del Wellcome Trust. Agradecemos a la Sra. Maureen Sinclair para el mantenimiento de las poblaciones de moscas y preparar la comida con mosca en los últimos años. También nos gustaría dar las gracias al Sr. Michael Aitchison por su ayuda y apoyo técnico en el desarrollo de este protocolo.

1. Las moscas transgénicas y Mantenimiento <ol><li> El moscas transgénicas que se utiliza en esta demostración: UBQ-GFP-Cdc20 (II), UBQ-RFP-His2B (X *); UBQ-GFP-Cdc20 (II *), UBQ-GFP-Cdc20 (II *); MAD2 EY ( III *) y UBQ-GFP-Cdc20 moscas transgénicas se han generado previamente en el laboratorio a través de un enfoque estándar mediada por P-elemento transgénico 10,11 y UBQ-RFP-His2B es una especie de regalo Yohanns Belaïche en UMR 144 CNRS / Instituto Curie, París, Francia. Se introdujeron en un fondo Mad2 mutante vía estándar Genética de Drosophila. El MAD2 EY mutante línea original fue comprado en el centro de Bloomington de valores. No vamos a discutir el procedimiento utilizado para elevar los transformantes en este protocolo. Nota: * representa el número de cromosomas. </li><li> Mantenimiento: las moscas transgénicas que se mantuvieron a 25 ° C en frascos de plástico containing volar alimentos y con polvo de levadura seca adicional en la parte superior. El vial se sustituye rutinariamente cada 3-4 semanas, dependiendo de las condiciones de crecimiento (Figura 1). </li></ol> 2. Fly Preparación de Alimentos (escala de laboratorio) <ol><li> Una cantidad apropiada de la mezcla de alimentos mosca se calentó con agitación constante para disolver los componentes. </li><li> Acerca de 8-10 ml de este medio se distribuye como suspensión en cada vial de plástico (2,5 cm de diámetro x 8 cm de longitud) utilizando un Jencons Scientific Ltd. bomba peristáltica. </li><li> Cuando la suspensión de alimentos se fijó y se ha enfriado a temperatura ambiente, el vial es entonces conectado con un tapón de espuma de algodón. Estos viales se colocan los alimentos en una bandeja que luego se sella en una bolsa de plástico y se mantuvo a 4 ° C para uso posterior. </li></ol> 3. En pequeña escala de recolección de huevos <ol><li> Alrededor de 50 pares de moscas adultas 2-3 días de edad se transfirieron a un vial de mosca alimento fresco suministrado con polvo adicional levadura seca sobre su superficie a 25 ° C durante laicoIng embriones. </li><li> Las moscas son luego transferidos a un vial nuevo cada hora y dejar los embriones en el vial durante 30 minutos para asegurar algunos de los embriones recogidos se envejecen en torno a 8-10 nucleares división del ciclo cuando los núcleos están migrando gradualmente a la corteza y organizada como una monocapa clave. La colección de primera hora normalmente se desecha, ya que a menudo contiene embriones de edad que fueron retenidos en los cuerpos femeninos, cuando las condiciones no eran adecuadas para la colocación. </li></ol> 4. Preparación Cubreobjetos y diapositivas <ol><li> Sacar un 50 x 22 mm cubreobjetos y ligeramente húmedo de sus cuatro esquinas, por un lado con una cantidad muy pequeña de agua con un pincel húmedo pluma fina y ponerla en un portaobjetos para que el cubreobjetos no se mueve debido a la tensión de la superficie capilar causada por la película líquida delgada. </li><li> Aplicar una tira delgada de cola heptano a través del centro del cubreobjetos, el heptano debe evaporarse en segundos para dejar que el pegamento sobre el cubreobjetos. </li><li>Corte otro cubreobjetos con una pluma de diamantes en pequeños cuadrados (~ 1,5 mm 2), recoge una y colocarla en un extremo de la línea de cola (esto se usa para abrir la punta de la aguja cuando la microinyección se requiere) y salvar a los demás para el futuro utilizar. </li><li> Tome otro portaobjetos de microscopio y pegar un trozo de cinta de doble cara adhesiva de aproximadamente 2 cm de largo a la misma y retire la cubierta de papel. (Ver Figura 2 A y B). </li></ol> 5. Los embriones Dechorionate <ol><li> Transferir las moscas a un vial de alimentos frescos y utilizar un cepillo humedecido pluma fina para transferir alrededor de 50 huevos sobre la cinta adhesiva de doble cara en el portaobjetos con una cantidad adecuada de líquido para permitir que los huevos que se extendió a cabo. Cuando el líquido se haya evaporado los huevos se adhieren a la cinta. </li><li> Bajo un microscopio de disección toque los huevos varias veces a lo largo de su eje longitudinal utilizando el lado exterior de una media de un par de pinzas suavemente hasta el corion es rota y abierta, pero deja el embrión en el anclaiones de depósito para evitar una rápida deshidratación. Continuar este proceso hasta 10-20 de los huevos ha sido tratado (dependiendo del número de los huevos necesarios para un solo experimento). </li><li> Los embriones puede entonces ser recogidos y retirados de la cáscara corion y coloca suavemente sobre la tira de pegamento una por una. Los huevos pueden ser colocados y alineados ya sea con el lado largo del paralelo embrión o anti-paralelo al lado largo de la tira de pegamento dependerá de si han de ser microinyectados. </li><li> Los embriones o bien puede ser cubierto inmediatamente con una cantidad apropiada de aceite Voltalef 10S (una mezcla 5:1 de Holocarbon 700 y aceite 27, Sigma) para evitar la desecación adicional para obtener imágenes de inmediato o se colocan en una cámara de desecación durante 3-8 minutos a deshidratar ellos más dependiendo de la humedad del ambiente y el propósito del experimento. Los embriones deshidratados se deben cubrir con aceite de 10S, cuando proceda, para impedir el exceso de deshidratación si la microinyección se requiere. (Ver Figura. 2C, DY E). </li></ol> 6. Los embriones de imagen <ol><li> Imágenes de Time-lapse o individual de embriones vivos se recopilaron mediante un Leica TCS SP2 invertida sistema de microscopía confocal con un HCX PL APO CS 40X 1,25 objetivo de inmersión en aceite (60 u objetivos 100X se puede utilizar también en función del propósito del experimento, la más alta el aumento que se usa la foto más blanqueo se producirá). </li><li> Cuando fluoróforos imágenes múltiples, que se superponen y los espectros son co-expresados ​​en el embrión mismo, cada longitud de onda proteína emisión fluorescente se recogió secuencialmente. Las longitudes de onda de excitación y emisión disponibles en el sistema Leica TCS SP2 son: las buenas prácticas agrarias, λ Ejemplo: 488 nm y λ Em: 500-600 nm. RFP, λ Ejemplo: 543 nm y λ Em: 555-700 nm. </li><li> Una sola imagen se obtuvo comúnmente como un promedio de 2 líneas de exploración con un promedio de 2 marco de exploraciones. Esto requiere un mínimo de 6,3 segundos para escanear una página 512x512imagen Ixel en un modo de exploración simultánea, y segundo 15.44 para un modo de exploración secuencial y produce una buena relación señal-ruido. Estos tiempos deben ser tenidos en cuenta al establecer los plazos para la recolección de la imagen de lapso de tiempo. </li><li> El agujero se fijó normalmente a 1-2 UA (unidad aireado), y la potencia del láser se ajustó al nivel más bajo posible para evitar cualquier fotoblanqueo significativa. </li></ol> 7. Provocar el SAC por microinyección de los embriones con los reactivos adecuados <ol><li> Preparar la aguja antes del experimento. Nosotros preferimos tirar de la aguja de capilares de vidrio siliconado (GC-100-10, la Universidad de Harvard), utilizando el flamante / marrón micropipeta extractor (Instrumento de Sutter, Modelo: P-97) con los parámetros: calor = 600, tire = 90, vel = 70 , del = 150. </li><li> Rellene la aguja con 1-2 ml de una concentración apropiada del reactivo en tampón de inyección utilizando una punta fina de carga (20 l lote de Eppendorf: W215818J). </li><li> Monte la aguja en la aguja de hoLDER en el microscopio con el tubo de presión conectado al sistema de control de Eppendorf inyección. </li><li> Encontrar un embrión bajo el objetivo 40X y encontrar la sombra aguja sin cambiar el plano focal moviendo la aguja en el centro del campo de visión y gradualmente bajando hasta el plano focal derecha. </li><li> Mueva el embrión lejos suavemente para encontrar el pequeño cuadrado de la cubreobjetos roto pre-montado en un extremo de la tira de pegamento. Con mucho cuidado retire la punta de la aguja hasta que llegue al borde del cubreobjetos pequeña plaza y rompe suavemente abrirla. </li><li> Mueva los embriones de nuevo en la vista y seleccionar el embrión de la edad adecuada para la inyección. Normalmente me inyecte el embrión en el ciclo de división nuclear en el 5-7 ya que esto es antes de migrar hacia el exterior del núcleo a la corteza. Las etapas del ciclo de división nuclear puede ser determinada por un análisis rápido de las señales fluorescentes de la GFP-Cdc20 o la señal nuclear de la RFP-2B histona antes de la inyección 9. </li><li> Cuidadosamente mueva la Embryo cerca de la aguja y reajustar el plano focal, tanto para el embrión y la aguja. Mueva el embrión en la aguja e inyectar una gota del reactivo en la posición deseada y mover el embrión de distancia (o siga las instrucciones para el sistema de microinyección). El embrión puede ser inyectado desde su posterior o desde el lado dependiendo de la finalidad del experimento. </li><li> Una vez inyectado el embrión está listo para ser reflejado en el momento apropiado. (Ver Figura 2F &amp; G) </li></ol> 8. Los resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" /> Figura 1. Materiales necesarios: a. cepillo de pluma fina, b. plazoleta de contenedores rotos los vidrios, c. 22 x 50 mm cubreobjetos, d. portaobjetos de microscopio, e. cinta de doble cara adhesiva, f. levadura en polvo seco en tubo de ensayo con los orificios en la tapa, g. levaduragránulos utilizados para el mantenimiento de la mosca, h. volar vial alimentos, i. un medio de unas pinzas utilizadas para los embriones dechorionate, j. unas pinzas par, k. heptano pegamento recipiente de líquido (matraz aforado). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" /> Figura 2. Los diagramas muestran la preparación de los cubreobjetos y diapositivas en el paso 4, dechorionation embrión en el paso 5 y los preparativos para la microinyección de agujas en el paso 7. Una. La imagen superior muestra un cubre con una tira de pegamento heptano a través de su centro y un pequeño cuadrado de un cubreobjetos roto pegado a un extremo. La imagen inferior muestra un portaobjetos de microscopio con una delgada capa de agua en sus cuatro esquinas para sostener un cubreobjetos. La razón para usar una diapositiva para mantener el cubreobjetos es mantener aproximadamente la misma distancia focal que la que se encuentra cuando se tiene cinta de doble cara en las diapositivas y así evitar la reorientación del microscopio mientras are disección y la transferencia de los embriones entre la cinta y el cubreobjetos. B. Una diapositiva con una longitud corta de cinta adhesiva de doble cara aplicarse antes de despegar el papel de la cubierta utilizada para dechorionating el embrión. C. La imagen de la izquierda muestra los embriones con conchas de corion intactos marcados con extremos anterior y posterior, la imagen de la derecha muestra los embriones en las conchas rotas corion antes de que fueran transferidos en el cubreobjetos con la tira de cola de D &amp; E diagramas que muestran dos.. maneras de transferir, la colocación y la alineación de los embriones dechorionated en tiras de pegamento. Los embriones fueron cubiertos por aceite 10S después de un período de desecación adecuada. Diagramas F y G. que muestran cómo se abre la punta de la aguja y la posición de modo como para inyectar. Las imágenes individuales o lapso de tiempo obtenidos de los experimentos descritos anteriormente pueden ser directamente analizados mediante el software Leica o se guardan en los archivos TIF como un proceso abierto fodisponibles para la cuantificación más o análisis con otros programas de edición comunes de análisis de imagen como la imagen J, Photoshop y MetaMorph etc Dos ejemplos para ilustrar este rmat se discuten a continuación: Ejemplo 1: Una película de lapso de tiempo (Figura 3) muestra la dinámica de contratación cinetocoro GFP-Cdc20 y el movimiento de los cromosomas en los embriones vivos Drosophila sincicial. La región de interés por parte de las imágenes originales de la secuencia de time-lapse se determinó / editar y convertir por lotes automatizado utilizando el software Photoshop. La película fue ensamblada utilizando el software QuickTime. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" /> Figura 3. Una película de lapso de tiempo muestra la dinámica de contratación cinetocoro GFP-Cdc20 y el movimiento de los cromosomas en los embriones vivos Drosophila sincicial. (A) Time-lapse imágenes fueron tomadas de un embrión transgénico sincitial co-expresión de GFP-Cdc20 (en verde)y el PP-2B histona (en rojo) las proteínas de fusión y se registraron con una Leica TCS SP2 confocal sistema a 18 ° C durante los ciclos de la división nuclear 8.7. Los marcos fueron tomadas cada 10 segundos. El marco con las células que ya están en la profase se trata como el punto cero del tiempo 10. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película de la figura 3A</a> . (B) las buenas prácticas agrarias-Cdc20 se puede observar fácilmente en la profase y prometafase cinetocoros (B3 y 4, flechas blancas) y persiste en la metafase y anafase cinetocoros (B5 y 6, flechas blancas). GFP-Cdc20 se excluye de la interfase núcleo (punta de flecha blanca), en el núcleo por la profase temprana. Morfologías cromatina se determinaron utilizando co-expresó His2BmRFP como marcadores (B8-14). Barras = 5 mm. Ejemplo 2: Las funciones del SAC puede ser estudiado mediante la manipulación de los embriones por los anticuerpos, proteínas microinyección de la etiqueta fluorescente o Chemical compuestos de interés que potencialmente dar lugar a la SAC. Por ejemplo colchicina inyección para despolimerizar los microtúbulos así provocar la SAC como se indica en la Figura 4 10. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" /> Figura 4. Mad2 es esencial para la colchicina invocada por la función SAC 10. GFP-Cdc20, MAD2 + / +, GFP-Cdc20, MAD2 EY (MAD2 - / - mutante nulo) y las buenas prácticas agrarias MAD2; MAD2 EY embriones fueron tratados con colchicina por microinyección. Time-lapse confocal de imágenes fueron tomadas antes (01, 07 y 13) o después de la inyección (02-06, 08-12, paneles superiores, los paneles centrales, 14-18, paneles inferiores). GFP-Cdc20 (paneles superiores y medios) o GFP-Mad2 (panel inferior) señales kinetochore fueron utilizados como marcadores de progresión del ciclo celular. El panel superior, las flechas indican los cinetocoros detenidos en 02-06. El área marcada por una flecha en 01 indica que antes del tratamiento con colchicina, GFP-CDC20 está excluido del núcleo en interfase tarde. Panel central, en ausencia de endógeno Mad2, GFP-Cdc20 señales siguen a oscilar dentro y fuera del núcleo, y dentro y fuera de los cinetocoros, aunque citocinesis parece ser defectuoso, como se esperaría en embriones que carecen de los microtúbulos, en presencia de colchicina (indicado por flechas en 07-12) que sugiere una función SAC fallado en la detención de las células en respuesta al tratamiento colchicina. La separación de núcleo hijo no en la foto 10. Panel inferior, puntas de flecha en 14-18 indican cinetocoros arrestados junto con las buenas prácticas agrarias MAD2 acumulada proteínas de fusión para sugerir la GFP-funcional Mad2 en el rescate del fenotipo defecto de SAC en Mad2 embrión mutante. Punta de flecha en el 13 indica las buenas prácticas agrarias Mad2 acumulación en un núcleo en interfase tarde. Bar = 5 mm. Los embriones se microinyectaron con ~ volumen del huevo 1% de una solución stock de colchicina 100mg/ml en 1 x PBS.

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E., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+element+mediated+germ+line+transformation+of+Drosophila.">P element mediated germ line transformation of Drosophila.</a> DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).</li><li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos.">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li><li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC/C:+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised.">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo.">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos.">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El protocolo se describe aquí es un método genérico para obtener imágenes de volar embriones sincitiales utilizando una Leica TCS SP2 microscopio confocal de barrido láser y puede ser modificado para adaptarse a otros sistemas de microscopio y también se puede adaptar para estudiar otras funciones de genes utilizando embriones de Drosophila sincitiales. Hemos utilizado este protocolo para estudiar muchos aspectos del puesto de control conjunto del eje, la dinámica de proteínas y la proteólisis de proteínas utilizando moscas transgénicas o anticuerpos policlonales para visualizar la localización de la proteína en muestras de vida o fijo 4,6,12-14. Lo más simple es mantener a las moscas en los alimentos frescos viales mosca en la recogida de pequeñas cantidades (~ 10 - 100) de los huevos. Esto reduce la molestia de hacer y la preparación de manzanas adicionales placas de agar jugo y las cámaras de recolección de huevos como se ha descrito en otras publicaciones 15,16. La adición de un pequeño cuadrado de vidrio cubreobjetos rota en un extremo de la tira de pegamento sobre el cubreobjetos hace mucho más fácilpara abrir la aguja y determinar el volumen de inyección mediante el ajuste de la configuración del sistema de microinyección, mientras que la aguja se sumerge en el aceite de 10S. El grado de desecación del embrión es importante para el éxito de la inyección para evitar fugas y mantener la viabilidad embriones especialmente para aquellos experimentos que requieren un largo período de tiempo o cuando elevar transformantes después de la inyección. Sin embargo, no existe una regla de oro para exactamente el tiempo desecación se requiere. Esto varía de experimento a experimento y depende de la cantidad de la solución inyectada y la humedad del ambiente de trabajo. Las funciones de una proteína específica de interés pueden ser manipulados por microinyección de inhibidores específicos de la proteína, mono o poli-clonales anticuerpos contra una proteína específica, el ARN mensajero o péptidos marcados con fluorescencia en fondos de tipo salvaje o de mutación genética. Muchas de estas líneas mutantes o GFP-etiquetados líneas transgénicas son públicamente avhay una disponible de Drosophila centros de población y la mayoría de ellos están listados en Flybase ( <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) y se pueden buscar en línea.

Equipo esencial y reactivos: Sistema de imagen confocal: El sistema de imagen se describe en este protocolo es una Leica TCS SP2 de escaneo láser confocal sistema de microscopio invertido. El método descrito es también adecuado tal vez con algunas modificaciones menores para otros sistemas de imagen. Microscopio de disección: Utilizamos un SZX7 Olympus con DF PLAPO 1X-4 de la lente. Aguja extractor: Flaming / marrón micropipeta extractor (Instrumento de Sutter, Modelo: P-97). Sistema de microinyección: Un sistema de microinyección Eppendorf se describe pero cualquier otro sistema apropiado puede ser utilizado. Fly distribuidor de alimentos: Jencons Scientific Ltd bomba peristáltica. Reactivos: <table border="1"><tbody><tr><td> Ingredientes </td><td> Pesos </td><td> Recursos </td><td> Lote N º </td></tr><tr><td> La harina de maíz </td><td> 100,0 g </td><td> SUMA, el Reino Unido </td><td></td></tr><tr><td> El azúcar moreno </td><td> 50,0 g </td><td> Billington, Reino Unido </td><td></td></tr><tr><td> La levadura seca </td><td> 25,0 g </td><td> DCL LEVADURA Ltd. del Reino Unido </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 12,5 g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> El ácido sórbico </td><td> 0,4 g </td><td> BDH, VWR International Ltd. del Reino Unido </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> El ácido benzoico </td><td> 2,9 g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin (Metil-4-Hydro xybenzoate) </td><td> 0,9 g </td><td> BDH, VWR International Ltd. del Reino Unido </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> H 2 O hasta 1 litro </td><td></td></tr></tbody></table><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Cuadro 1. Fly ingredientes alimentarios. Holocarbon 700 y 27 aceites comprados en Sigma. De levadura seca: Allison Thomas, del Reino Unido. Preparación de la cola de heptano: Tomar alrededor de 1,5 metros de cinta adhesiva de doble cara, lo puso en un tubo de 15 ml Falcon con 5 ml de heptano y gire durante 3-5 horas o toda la noche. Después de ese tiempo se dividió en 4 partes alícuotas iguales en tubos de 1,5 ml de centrífuga eppendorf y centrifugar durante 5 minutos a una velocidad rápida en una centrífuga de mesa para eliminar los residuos. Guarde la solución del pegamento heptano en un matraz aforado de 10 ml y guardar para su uso. La fuerza pegamento variará de acuerdo con la concentración y las cantidades de la cola utilizada. Normalmente, la cola más fina produce menos fondo ruidoso cuando se escanea con un microscopio confocal. <ul><li> Cubreobjetos: BDH, VWR International Ltd. del Reino Unido </li><li> Portaobjetos de microscopio: BDH, VWR International Ltd. del Reino Unido &lt;/ Li&gt; <li> Capilares de vidrio siliconizado: GC-100-10, la Universidad de Harvard </li><li> Punta de carga Fina: 20ul muchos eppendorf: W215818J </li><li> Pinzas </li><li> Cepillo de pluma fina </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

El conjunto del eje puesto de control (SAC) el mecanismo es una señal activa, que controla la interacción entre los cinetocoros de los cromosomas y los microtúbulos del huso para prevenir la aparición de la anafase hasta que los cromosomas están correctamente conectados. Las células utilizan este mecanismo para evitar la inestabilidad genómica o la aneuploidía, y por lo tanto, los cánceres y otras enfermedades humanas tales como defectos de nacimiento y la enfermedad de Alzheimer 1. Varios de los componentes del SAC como Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, ZW10, Rod y Aurora quinasa B han sido identificados y que son todas las proteínas dinámicas kinetochore 2. La evidencia sugiere que el cinetocoro es donde la señal de SAC se inicia. El objetivo del SAC es el primer regulador Cdc20. Cdc20 es uno de los esenciales de APC / C (A naphase P romoción C omplejo o yclosome C) activadores 3 y es también una proteína cinetocoro dinámico 4-6. Cuando se activa, el SAC inhibe la actividad de la UnPC / C para evitar la destrucción de dos sustratos clave, la ciclina B y securin, evitando así la metafase a anafase transición de 7,8. Exactamente cómo la señal de SAC se inicia y montados en los cinetocoros y se informará sobre el APC / C para inhibir su función sigue siendo difícil de alcanzar. Drosophila es un sistema experimental extremadamente tratable; un organismo mucho más simple y mejor entendida en comparación con la humana, pero una que comparte procesos fundamentales en común. Es, quizás, uno de los mejores organismos a utilizar para los estudios de bio-imágenes de células vivas, especialmente para la visualización de los eventos mitóticos en el espacio y el tiempo, ya que el embrión temprano va a través de 13 ciclos rápidos de la división nuclear de forma sincrónica (8-10 minutos para cada ciclo a 25 ° C) y gradualmente organiza los núcleos en una sola monocapa justo debajo de la corteza 9. Aquí, presentamos un método bio-imágenes con expresión transgénica de Drosophilacantan las buenas prácticas agrarias (Green Fluorescent Protein) o de sus dirigidos variante de las proteínas de interés y una Leica TCS SP2 confocal de barrido láser sistema de microscopio para estudiar la función del SAC en las moscas, mostrando imágenes de las proteínas de fusión GFP de algunos de los componentes SAC, Cdc20 y Mad2 , como el ejemplo.

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Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

El cinetocoro es donde el SAC inicia su señal de control de la segregación mitótica de las cromátidas hermanas. Se describe un método para visualizar la contratación y la rotación de una de las kinetochore proteínas y su coordinación con el movimiento de los cromosomas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones utilizando un sistema láser de Leica confocal de barrido.

El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

studying-mitotic-checkpoint-illustrating-dynamic-kinetochore-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

11.3K vistas.  University of Newcastle, United Kingdom. El cinetocoro es donde el SAC inicia su señal de control de la segregación mitótica de las cromátidas hermanas. Se describe un método para visualizar la contratación y la rotación de una de las kinetochore proteínas y su coordinación con el movimiento de los cromosomas en Drosophila Embriones utilizando un sistema láser de Leica confocal de barrido.

Video: Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicación de curado con luz Resina Adhesivo Dental para los electrodos de montaje o sondas de microdiálisis en experimentos crónica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Investigación

Biología

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

En vivo-La centrifugación de embriones de Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

RNAi interferencia por inyección de dsRNA en Drosophila Los embriones

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

La identificación de la interacción proteína-proteína en<em&gt; Drosophila</em&gt; Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo Enfoque de reticulación para aislar Complejos de Proteína Desde Drosophila Los embriones

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Estudiar mitocondrial Estructura y función en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovarios

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...