このプロトコルは、ウェルカム·トラストの助成金の下に開発されました。私たちは、系統を維持し、年間でフライ食品を準備するために氏モーリーンシンクレアに感謝します。また、このプロトコルの開発の彼のヘルプおよび技術サポートのために氏マイケルAitchisonが感謝したい。

1。トランスジェニックハエとメンテナンス<ol><li> UBQ-GFP-Cdc20（II *）、UBQ-GFP-Cdc20（II *）; MAD2 EY（UBQ-GFP-Cdc20（II）、UBQ-RFP-His2B（X *）：トランスジェニックは、このデモで使用されているハエ III *）とUBQ-GFP-Cdc20トランスジェニックハエは、以前の研究室で標準的なP-エレメントを介したトランスジェニックアプローチ10,11を介して生成されるとUBQ-RFP-His2Bは UMR 144 CNRS /研究所キュリーでYohannsBelaïcheから親切な贈り物です。たが、パリ、フランス。それらは標準のショウジョウバエ遺伝学を経由してMAD2変異体背景に導入されました。 MAD2 EYオリジナルの変異体ラインはブルーミントンストックセンターから購入した。我々は、このプロトコルで形質転換体を持上げに使用する手順については説明しません。 注：*染色体番号を表します。 </li><li> メンテナンス：トランスジェニックハエを25℃に維持したプラスチックバイアルcontaininのCgは食べ物を飛ぶと上に追加の乾燥酵母粉末と。バイアルは、定期的にすべての3-4週間生育条件（ 図1）に応じて置き換えられました。 </li></ol> 2。 （ラボスケール）食事の準備を飛ぶ<ol><li>フライ食品·ミックスの適切な量の成分を溶解するために絶えず撹拌しながら加熱した。 </li><li>この培地の約8-10 mlをJencons科学株式会社蠕動ポンプを使用して、それぞれプラスチックバイアル（2.5 cm直径×8 cmの長さ）にスラリーとして配布されました。 </li><li>食品のスラリーが設定され、室温まで冷却したとき、バイアルは、その後綿フォームプラグで接続されている。これらの食品のバイアルは、その後ビニール袋に密封し、℃で後で使用するために4℃で保持されるトレイに配置されています。 </li></ol> 3。小規模採卵<ol><li> 2〜3日の古い成虫の約50のペアが産卵のために25℃で、その表面上に追加の乾燥酵母粉末を供給する新鮮なフライ食品バイアル°Cに移したる胚。 </li><li>ハエは、その後新鮮なバイアルに毎時間転送し、核は徐々に皮質に移行しているときに収集胚の一部は核の分裂周期8-10歳前後されていることを確認する30分間バイアル中に胚を残すとして編成されています単分子層。それは頻繁に条件が産卵に適していなかった女性の身体に保持された高齢者の胚が含まれているので最初の1時間のコレクションは、通常は破棄されます。 </li></ol> 4。カバーグラスとスライドの準備<ol><li> 50×22 mmのカバーガラスを取り出し、少し湿った微細なペンのブラシを使用して、水の非常に少量の片側に、その四隅を濡らすとカバースリップが原因毛細血管の表面張力の移動しないように顕微鏡スライド上に置く薄い液膜によって引き起こされる。 </li><li>カバースリップの中央にヘプタン接着剤の薄いストリップを適用し、ヘプタンはカバースリップに接着剤を残すために数秒で蒸発させる必要があります。 </li><li>小さ ​​な四角（〜1.5ミリメートル2）にダイヤモンドペンで別のカバースリップをカット、次のいずれかをピックアップし、接着剤ストリップの一端（これはマイクロインジェクションが必要なときに針先を開くために使用されています）の上に置き、将来のために他人を保存使用しています。 </li><li>別の顕微鏡スライドを取るとカバー紙を約2cm、それまで長いと皮両面粘着テープの部分を貼り付けます。 （ 図2A＆Bを参照してください。） </li></ol> 5。 Dechorionate胚<ol><li>生鮮食品バイアルにハエを移し、卵が広がってできるようにするために液体の適切な量のスライド上に両面粘着テープの上に約50卵を転送するために湿らせた微細なペンのブラシを使用しています。液体が蒸発したとき卵は、テープに付着します。 </li><li>解剖顕微鏡のタッチの下での長軸に​​沿って卵を数回漿膜まで静かにピンセットの半分の外側を使用すると、壊れた、オープンであるが、合唱に胚を残す急激な脱水症状を防ぐために、イオンシェル。卵の10〜20まで、このプロセスを続ける（単一の実験に必要な卵の数に応じて）処理されています。 </li><li>胚はその後ピックアップと絨毛膜のシェルから削除され、穏やかにいずれかの接着剤ストリップ1に配置することができます。卵は、それらがマイクロインジェクションされる場合には依存に置かれ、胚のパラレルまたは接着剤ストリップの長辺に反平行の長辺のいずれかで整列することができます。 </li><li>胚は、即時イメージングのための更なる乾燥を防ぐためにVoltalefの10S油の適量（Holocarbon 700オイルと27のオイルの5:1混合物、Sigma）ですぐに覆われたり、ために3-8分間乾燥チャンバー内に配置することができます部屋の湿度と実験の目的に応じて、さらにそれらを脱水する。マイクロインジェクションが必要な場合は、過乾燥を防ぐため、適切な場合脱水胚は10S油で覆われている必要があります。 （ 図を参照してください。2C、D＆E）。 </li></ol> 6。イメージング胚<ol><li>生きている胚のタイムラプスまたはシングルイメージはHCX PL APO CS 40X 1.25油浸対物レンズ（60または100×目標とライカTCS SP2共焦点倒立顕微鏡システムを用いて収集された以上、実験の目的に応じても使用できます。倍率）が発生します漂白多くの写真を使用していました。 </li><li>イメージング複数のスペクトルを重複している蛍光体と、が同じ胚に共発現されている場合、各蛍光タンパク質の発光波長が連続して採取した。ライカTCS SP2システム上で利用可能な励起および発光波長は、次のとおりです。GFP、λ 例 ：488 nmとλEM：500から600 nmである。 RFP、λ 例 ：543 nmとλEM：555から700 nmである。 </li><li>単一のイメージは一般的に2フレーム·スキャンの平均で2走査線の平均値として得られた。これは512×512 pをスキャンするために6.3秒の最小値をとるixel同時スキャンモードでのイメージ、およびシーケンシャルスキャンモードの15.44秒と良好な信号対雑音比を生成します。これらの時間は、タイムラプス画像の収集に時間枠を設定するときに考慮する必要があります。 </li><li>ピンホールは、通常1から2 AU（風通しの良いユニット）に設定されて、レーザーパワーが重要な退色を避けるために、可能な限り低いレベルに調整した。 </li></ol> 7。適切な試薬で胚をマイクロインジェクションすることでSACを引き起こす<ol><li>実験前に針を準備します。パラメータを使用して：熱= 600、= 90、VEL = 70を引く：私たちは燃える/茶色のマイクロピペットプラー（P-97サッターインストゥルメント、モデル）を使用してsiliconisedガラスキャピラリー（GC-100-10、ハーバード大学）から針を引っ張ることを好む、デル= 150。 </li><li>細かいローディングチップ（：W215818J20μlをエッペンドルフロット）を使用してインジェクション、バッファ内の試薬の適切な濃度の1〜2 mlの針のバックフィル。 </li><li>針HOに針をマウントします。エッペンドルフ噴射制御システムに接続されている圧力管と顕微鏡でlder。 </li><li> 40X目的で胚を見つけて、視野の中心に針を移動し、徐々に右側の焦点面に下げることによって、焦点面を変更することなく、針の影を見つける。 </li><li>壊れたカバースリップの接着ストリップの一方の端部にあらかじめマウントされているの小さな広場を見つけて静かに胚を移動します。それは小さな正方形のカバースリップの端に当たると静かに開いた、それを中断するまで、非常に静かに針の先端に移動します。 </li><li>ビューに戻す胚を移動し、注入に適した年齢の胚を選択します。核は大脳皮質に外側に移行する前にこれはように私は通常は5月7日に、核分裂周期で胚を注入します。核分裂サイクルのステージは、GFP-Cdc20または注射前9〜RFP-ヒストン2Bの核信号の蛍光シグナルのクイックスキャンによって決定することができる。 </li><li>慎重にエンブリーを移動O針に近く、胚と針の両方に焦点面を再調整します。針に胚を移動し、希望の位置に試薬の液滴を注入し、離れて胚を移動（またはマイクロインジェクションシステムの指示に従ってください。）胚は、その後部から、または実験の目的に応じて側から注入することができます。 </li><li>一度注入された胚は、適切なタイミングで撮像できるようになりました。 （ 図2F＆Gを参照してください） </li></ol> 8。代表的な結果<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" /> 図1。必要な材料。細かいペンのブラシA、B。小さ ​​な正方形の壊れたメガネのコンテナは、c。 22×50ミリメートルカバースリップは、d。顕微鏡スライド、 電子 。両面粘着テープは、f。蓋は、gの穴に試験管内で乾燥酵母粉末。酵母顆粒は、フライのメンテナンス、 時間に使用されます。食品バイアル、iを飛ぶ。 dechorionate胚に使用されるピンセットの半分、J。ペアピンセット、K。ヘプタン糊液容器（メスフラスコ）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" /> 図2。図は、手順4、手順5と手順7のマイクロインジェクションのための針の準備に胚dechorionationでカバーガラスとスライドの準備を示しています。 A。上の写真は、その真ん中を越えヘプタン接着剤のストリップの一端に付着し、壊れたカバースリップの小さな正方形のカバースリップを示しています。下の写真は、カバースリップを保持するために、その四隅に薄い水の層を有する顕微鏡スライドを示しています。あなたはスライド上に両面テープを持っているので、しばらくあなたのar顕微鏡をリフォーカスを避けたときにそれが見られるようにカバースリップを保持するためにスライドを使用する理由は、ほぼ同じ焦点距離を維持することですテープとカバーガラスの間に胚を解剖し、転送する電子。B。両面スコッチテープの長さが短いとスライドが胚。Cを dechorionatingに使用する、カバー紙を剥がす前に適用されます。左の写真はマークされた前部および後部末端を持つ無傷の絨毛膜のシェルで胚を示しています。それらは接着剤ストリップでカバースリップ上に転写される前に、右の写真は壊れた絨毛膜のシェルで胚を示していますD＆E図2を示す。接着剤ストリップにdechorionated胚を、転送配置し、整列させるための方法。胚は、適切な乾燥期間の後、10S油で覆われていた。F＆G.図は針の先端を開いて注入するように配置する方法を示す。 上記の実験から得られた単一またはタイムラプス画像は、直接ライカソフトウェアを使用して分析したり、開いているFOとして。TIFファイルに保存することができますこれを説明するようなイメージJは、PhotoshopおよびMetaMorph等二つの例のような他の一般的な画像解析プログラムを使用して、さらに定量化や編集の分析のために利用できるrmatは、以下に説明されています。 例1：タイムラプスムービー（ 図3）は、 ショウジョウバエシンシチウム胚を生体内でGFP-Cdc20と染色体の動きのダイナミックな動原体の動員を示しています。オリジナルのタイムラプスシーケンス画像から関心領域が決定/編集および自動バッチPhotoshopのソフトウェアを使用して変換されました。ムービーは、QuickTimeソフトウェアを使用して組み立てた。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" /> 図3。タイムラプスムービーは、 ショウジョウバエのシンシチウム胚を生体内でGFP-Cdc20と染色体の動きのダイナミックな動原体の動員を示しています。 （A）タイムラプス画像は、GFP-Cdc20（緑）の共発現するトランスジェニックシンシチウム胚から採取されたとRFP-ヒストンは、2B（赤）の融合タンパク質とは、°C核分裂サイクルの間に7月8日18歳でライカTCS SP2共焦点顕微鏡システムを用いて記録した。フレームは10秒ごとに撮影された。既に前期の細胞を持つフレームは、ゼロ時点10として扱われます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">図3Aムービーを表示するには、ここをクリック</a> 。（B）GFP-Cdc20が容 ​​易に前期及び前中期動原体（B3＆4、白矢印）で観察することができ、中期と後期キネトコア（B5＆6、白矢印）に保持されます。 GFP-Cdc20は、早期前期で核を入力し、間期核（白矢印）から除外されます。クロマチンの形態は、マーカー（B8-14）などの共発現His2BmRFPを用いて測定した。バー= 5ミリメートル。 例2：SACの機能は、マイクロインジェクション、抗体、蛍光標識したタンパク質またはchemicaで胚を操作することによって学ぶことができます。潜在的にSACを引き起こす興味lの化合物。例えば、 図4〜10に示すように、SACを刺激できるように微小管を解重合するためにコルヒチンを注入する。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" /> 図4。 MAD2は、コルヒチン、呼び出されたSAC機能 10 には不可欠です 。 GFP-cdc20、MAD2 + / +、GFP-cdc20、MAD2 EY（MAD2 - / -ヌル変異体）とGFP-MAD2、MAD2 EY胚をマイクロインジェクションによってコルヒチンで処理した。タイムラプス共焦点画像は（; 8月12日、中央のパネルは、14から18、底部パネル02から06、天板）の前（01、07＆13）、または注入後に撮影されました。 GFP-Cdc20（上部および中央のパネル）またはGFP-MAD2（下パネル）動原体の信号が細胞周期の進行のマーカーとして使用された。上部パネル、矢印は2月6日に逮捕された動原体を示しています。 01の矢印でマークされたエリアには、コルヒチン処理、GFP-Cの前にそれを示していますDC20は、故間期核から除外されます。細胞質分裂が存在する場合には、微小管を欠く胚で予想されるように、欠陥があるように見えるが、中央のパネルには、内因性MAD2の不在下で、GFP-Cdc20信号は、核の外で振動し続け、動原体のオンとオフコルヒチンの（07から12の矢印で示される）コルヒチン処理に応答して細胞を逮捕に失敗したSACの機能を示唆している。娘核の分離は、図10に失敗しました。底部パネルには、14から18に矢印が蓄積されたGFP-MAD2融合タンパク質救助にMAD2変異体胚でSAC欠陥表現型を機能的なGFP-MAD2を示唆すると逮捕された動原体を示しています。 13の矢印は遅い間期核でGFP-MAD2蓄積を示しています。バーは5mm =。胚は、1×PBSで100mg/mlコルヒチン原液〜1％の卵体積とマイクロインジェクションされた。

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	<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li><li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy,+chromosomal+missegregation,+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer's+disease.">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li><li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. 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我々は、開示することは何もありません。

ここで説明するプロトコルは、ライカTCS SP2共焦点レーザー走査顕微鏡を用いてシンシチウム胚を飛ぶと、他の顕微鏡システムに合わせて変更することができ、また、 ショウジョウバエ多核の胚を使用して、他の遺伝子の機能を研究するために適応させることができます。イメージングのための汎用的なメソッドです。我々は、スピンドル·アセンブリーのチェックポイントは、タンパク質のダイナミクスとの生活や固定サンプル4,6,12-14中のタンパク質の局在を可視化するトランスジェニックハエまたはポリクローナル抗体を用いたタンパク質のタンパク質分解の多くの側面を研究するために、このプロトコルを使用しています。 卵の - それは小さな数字（100〜10）を収集する際に、新鮮なフライ食品のバイアル中にハエを維持するのが最も簡単です。これは、製造および他の刊行物15,16に記載され追加のリンゴジュース寒天プレートと卵の収集室を準備する手間を減らすことができます。カバースリップ上の接着剤ストリップの一方の端に壊れたカバースリップガラスの小さな正方形の添加は、それは非常に簡単になります針を開いて、針が10S油に浸漬されている間マイクロインジェクションシステムの設定を調整することにより、注入量を決定します。胚の乾燥の程度は、漏れを避けるため、特に長い期間を必要としたり、注射した後、形質転換を発生させる場合、これらの実験のために胚の生存性を維持するために注射を成功させるために重要である。しかし、必要とされる正確にどのくらいの乾燥のための黄金のルールはありません。これは実験から実験に変化し、注入溶液および作業環境の湿度の量に依存します。 興味のある特定のタンパク質の機能は、モノ - 又はポリクローン抗体は、特定のタンパク質、メッセンジャーRNAまたは野生型または遺伝子変異の背景の下で蛍光標識したペプチドに対して、特定のタンパク質の阻害剤をマイクロインジェクションすることによって操作することができます。これらの変異系統またはGFPタグ付きのトランスジェニック系統の多くは公にAVです。ショウジョウバエストックセンターからailable、それらのほとんどはFlybaseに記載されています（ <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ）とオンライン検索することができます。

不可欠な機器と試薬： 共焦点イメージングシステム：このプロトコールに記載の撮像システムでは、共焦点倒立顕微鏡システムのスキャンはライカTCS SP2レーザである。記載されている方法は、他のイメージングシステムのためのいくつかのマイナーな変更で多分にも適しています。 顕微鏡解剖：我々はDF PLAPO 1X-4レンズとオリンパスSZX7を使用しています。 ニードルプラー/茶色マイクロピペットプラーを（：P-97サッター楽器、モデルからの）フレーミング。 マイクロインジェクションシステム：エッペンドルフマイクロインジェクションシステムが記載されているが、他の適切なシステムを使用することができます。 Jencons科学株式会社蠕動ポンプ：食品の販売代理店に飛ぶ 。 試薬： <table border="1"><tbody><tr><td> 材料 </td><td> 重さの</td><td> 資源 </td><td> ロットNo。 </td></tr><tr><td>トウモロコシの食事</td><td> 100.0グラム</td><td> SUMA、英国</td><td></td></tr><tr><td>ブラウンシュガー</td><td> 50.0グラム</td><td>ビリントンの、英国</td><td></td></tr><tr><td>ドライイースト</td><td> 25.0グラム</td><td> DCL酵母（株）英国</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td> 12.5グラム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 106556 </td></tr><tr><td>ソルビン酸</td><td> 0.4グラム</td><td> BDH、VWRインターナショナル株式会社英国</td><td> 8829310 </td></tr><tr><td>安息香酸</td><td> 2.9グラム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin （メチル-4 - ハイドロ xybenzoate） </td><td> 0.9グラム</td><td> BDH、VWRインターナショナル株式会社英国</td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> 1LのH 2 Oまで</td><td></td></tr></tbody></table><pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; 表1。食材をフライ。 Sigmaから購入しHolocarbon 700と27のオイル。 ドライイースト：トーマス·アリソン、英国。 ヘプタン接着剤を準備する：両面スコッチテープの約1.5メートルテイクヘプタン5mlのと15ミリリットルのファルコンチューブに入れて3-5時間または一晩回転させます。その時間が経過した後、任意の残骸を削除するには、ベンチトップ遠心機で速い速度で5分間1.5mlエッペンドルフ遠心チューブとスピンで4つの等しいアリコートに分割します。 10mlのメスフラスコにヘプタン糊液を保存して使用するために保持します。接着強度は、濃度、使用接着剤の量に応じて異なります。通常は、薄い接着剤は、共焦点顕微鏡によってスキャンされたより低い騒々しい背景を生成します。 <ul><li> カバースリップ：BDH、VWRインターナショナル株式会社英国</li><li> 顕微鏡スライド：BDH、VWRインターナショナル株式会社英国&lt;/ LI&gt; <li> Siliconisedガラスキャピラリー：GC-100-10、ハーバード大学</li><li> ファインロードのヒント：20μlのエッペンドルフロット：W215818J </li><li>ピンセット</li><li>ファインペンのブラシ</li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

スピンドル·アセンブリーのチェックポイント（SAC）機構は染色体が正しく接続されるまで、後期発症を防ぐために、染色体の動原体と紡錘体微小管との間の相互作用を監視し、アクティブな信号です。細胞が異数性やゲノム不安定性、それゆえ癌や先天性欠損症やアルツハイマー病の1のような他の人間の病気を防ぐために、このメカニズムを使用します。そのようなMad1としてSACコンポーネントの数、MAD2、Bub1、BubR1、Bub3、Mps1、Zw10、ロッドとオーロラBキナーゼを同定し、それらは2すべての動原体の動的蛋白質であるされています。証拠はSAC信号が開始されている動原体であることを示唆している。 SAC素数の規制対象はCdc20です。 Cdc20は不可欠APC / C（naphase P romoting C omplexまたはC yclosome）活性化因子3のいずれかであり、また、動原体の動的なタンパク質4月6日です。アクティブにすると、SACの活性を阻害するPC / Cそれによって転移7,8後期にかけて中期を防止するため、2つのキー基板、サイクリンBとsecurinの破壊を防ぐことができます。 SAC信号が開始され、組み立てられた動原体に、その機能はまだとらえどころのないままに阻害するためにAPC / Cに中継される方法を正確に。 ショウジョウバエは非常に扱いやすい実験系である。人間が、一般的な株式の基本的なプロセスその1に比べてはるかに単純で、より良く理解し生物。初期胚が同期して13急速な核分裂サイクル（8-10分を通過するとして、それは、特に時間と空間の分裂イベントの可視化のため、おそらく、生きた細胞内バイオイメージング研究のために使用するための最良の生物の一つである25°C）で、各サイクルごとに徐々にだけ皮質下に9つの単分子層の核を開催しています。 ここでは、トランスジェニックショウジョウバエの発現を用いたバイオイメージング法を提案する歌うGFP（緑色蛍光タンパク質）またはその変異体をターゲットとした関心とSACコンポーネントの一部のGFP融合タンパク質のイメージを示すことによって、ハエのSACの機能を研究するためにライカTCS SP2共焦点レーザー走査型顕微鏡システムのタンパク質、Cdc20とMAD2 、例として。

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Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

SACは、姉妹染色分体の有糸分裂分離を監視し、その信号を開始する場所を動原体である。方法は、染色体の動きと動原体タンパク質とその調整のいずれかの採用と離職率を可視化するために記述されている<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ライカレーザー走査共焦点顕微鏡システムを用いた胚。

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

11.3K ビュー.  University of Newcastle, United Kingdom. SACは、姉妹染色分体の有糸分裂分離を監視し、その信号を開始する場所を動原体である。方法は、染色体の動きと動原体タンパク質とその調整のいずれかの採用と離職率を可視化するために記述されているショウジョウバエライカレーザー走査共焦点顕微鏡システムを用いた胚。

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Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

発生生物学

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

に有糸分裂研究のためのマイクロインジェクション技術キイロショウジョウバエ合胞体胚

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

生物学

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

神経科学

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;精巣

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

固定における減数分裂Iのイメージング前中期および中期のための技術<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

水動紡錘摂動後のメタフェイズタイミングと細胞運命のダイナミクスを評価するライブ細胞イメージング

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強

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