Questo protocollo è stato sviluppato nell&#39;ambito di un Wellcome Trust sovvenzione. Ringraziamo la signora Maureen Sinclair per il mantenimento degli stock mosca e preparare il cibo volo nel corso degli anni. Vorremmo anche ringraziare il Sig. Michael Aitchison per il suo aiuto e il supporto tecnico nello sviluppo di questo protocollo.

1. Mosche transgeniche e manutenzione <ol><li> Il transgenico mosche usato in questa dimostrazione: UBQ-GFP-Cdc20 (II), UBQ-RFP-His2B (X *); UBQ-GFP-Cdc20 (II *), UBQ-GFP-Cdc20 (II *); Mad2 EY ( III *) e UBQ-GFP-Cdc20 mosche transgeniche sono state precedentemente generato in laboratorio attraverso una norma P-element approccio mediato transgenico 10,11 e UBQ-RFP-His2B è un gentile dono da Yohanns Belaïche a 144 UMR CNRS / Istituto Curie, Parigi, Francia. Essi sono stati introdotti in uno sfondo Mad2 mutante attraverso standard Drosophila genetica. La linea di Mad2 EY originale mutante è stato acquistato dal magazzino Bloomington centro. Non discutere la procedura utilizzata per l&#39;allevamento dei trasformanti in questo protocollo. Nota: * rappresenta il numero dei cromosomi. </li><li> Manutenzione: mosche transgeniche sono state mantenute a 25 ° C in fiale di plastica containing volare il cibo e con l&#39;aggiunta di lievito in polvere secca sulla parte superiore. La fiala è stata regolarmente sostituiti ogni 3-4 settimane a seconda delle condizioni di crescita (figura 1). </li></ol> 2. Vola Preparazione del cibo (scala Lab) <ol><li> Una quantità appropriata di miscela alimentare mosca è stata riscaldata con agitazione costante per sciogliere i componenti. </li><li> A proposito di 8-10 ml di questo mezzo è stato distribuito come impasto in ogni fiala di plastica (2,5 cm di diametro x 8 cm di lunghezza) con un Jencons Scientific Ltd pompa peristaltica. </li><li> Quando l&#39;impasto alimentare è stato impostato e si è raffreddata a temperatura ambiente, la fiala viene poi tappato con un tappo di cotone schiuma. Queste fiale alimenti sono collocati in un vassoio che viene quindi confezionato in un sacchetto di plastica e mantenuto a 4 ° C per un uso successivo. </li></ol> 3. Piccola Egg Collection <ol><li> Circa 50 coppie di 2-3 mosche adulte giorno vecchi sono stati trasferiti in una fiala di alimenti freschi fly fornito con altra polvere di lievito secco sulla sua superficie a 25 ° C per layIng embrioni. </li><li> Le mosche sono poi trasferiti in una fiala fresca ogni ora e lasciare gli embrioni nel flacone per 30 minuti per garantire alcuni degli embrioni raccolti sono di età compresa tra circa 8-10 nucleari ciclo di divisione, quando i nuclei sono migrando gradualmente verso la corteccia e organizzata come una monostrato singolo. La collezione prima ora viene normalmente scartato in quanto spesso contiene embrioni di età che sono stati conservati nei corpi femminili quando le condizioni non erano adatte per la posa. </li></ol> 4. Preparazione Coprivetrini e diapositive <ol><li> Estrarre uno x 50 22 mm e coprioggetto leggermente bagnare suoi quattro angoli su un lato con una quantità molto piccola di acqua utilizzando una spazzola umida penna fine e messo su un vetrino da microscopio in modo che il vetrino non muoversi a causa della tensione superficiale capillare causato dalla pellicola sottile di liquido. </li><li> Applicare una sottile striscia di colla eptano in tutto il centro del vetrino, l&#39;eptano dovrebbe evaporare in pochi secondi per lasciare la colla su vetrino. </li><li>Tagliare un altro vetrino con una penna di diamante in piccoli quadrati (~ 1,5 mm 2), prendere uno e appoggiarla su una delle estremità della striscia di colla (questo è utilizzato per aprire la punta dell&#39;ago microiniezione quando è necessario) e salvare gli altri per il futuro utilizzare. </li><li> Prendete un altro vetrino da microscopio e bastone un pezzo di nastro biadesivo adesivo di circa 2 cm ad esso e staccare la carta della copertina. (Vedi Figura 2A &amp; B). </li></ol> 5. Embrioni Dechorionate <ol><li> Trasferire le mosche in una fiala di cibi freschi e utilizzare un pennello inumidito penna sottile di trasferire circa 50 uova sul nastro biadesivo adesivo sul vetrino con una quantità appropriata di liquido per permettere alle uova di essere distribuiti. Quando il liquido è evaporato le uova si attacchi al nastro. </li><li> Sotto un tocco microscopio da dissezione le uova più volte lungo il loro asse lungo usando il lato esterno di una metà di un paio di pinzette delicatamente fino corion è rotto e lasciare aperta ma l&#39;embrione in Choragli ioni di shell per prevenire la disidratazione rapida. Continuare questo processo finché 10-20 delle uova è stato trattato (a seconda del numero delle uova richieste per un singolo esperimento). </li><li> Gli embrioni possono essere raccolte e rimossi dal guscio corion e delicatamente posto sulla striscia di colla uno per uno. Le uova possono essere posizionati e allineati sia con il lato lungo parallelo dell&#39;embrione o anti-parallelo al lato lungo della striscia di collante dipende se devono essere microiniettati. </li><li> Gli embrioni possono essere coperto immediatamente con una quantità appropriata di olio Voltalef 10S (una miscela 05:01 di Holocarbon 700 olio e olio 27, Sigma) per prevenire l&#39;essiccamento ulteriormente per l&#39;imaging immediato o collocato in una camera di essiccazione per 3-8 minuti fino disidratare ulteriormente a seconda dell&#39;umidità della camera e lo scopo dell&#39;esperimento. Gli embrioni disidratati dovrebbero essere coperti con olio 10S, se del caso per evitare eccessiva disidratazione se microiniezione è richiesto. (Vedi Figura. 2C, D&amp; E). </li></ol> 6. Imaging embrioni <ol><li> Time-lapse o singole immagini di embrioni viventi sono raccolti utilizzando una Leica TCS SP2 sistema invertito microscopia confocale con un PL APO HCX CS 40X 1,25 obiettivo a immersione in olio (60 o obiettivi 100X può essere utilizzato anche a seconda dello scopo dell&#39;esperimento, maggiore l&#39;ingrandimento utilizzato la foto più sbiancamento si verificherà). </li><li> Quando immagini fluorofori multipli, che hanno spettri sovrapposti e sono co-espressi nell&#39;embrione stesso, ogni lunghezza d&#39;onda di emissione fluorescente proteina è stata prelevati sequenzialmente. Le lunghezze d&#39;onda di eccitazione e di emissione disponibili sul sistema Leica TCS SP2 sono: GFP, λ Ex: 488 nm e λ Em: 500-600 nm. RFP, λ Ex: 543 nm e λ Em: 555-700 nm. </li><li> Una singola immagine era comunemente ottenuto come media di 2 linee di scansione con una media di 2 telaio-scan. Questo richiede un minimo di 6,3 secondi per la scansione di un p 512x512Ixel immagine in una modalità di scansione simultanea e 15.44 secondi per una modalità di scansione sequenziale e produce un buon rapporto segnale-rumore. Questi tempi devono essere presi in considerazione nel fissare i tempi per la time-lapse raccolta di immagini. </li><li> Il foro stenopeico è stato normalmente impostato a 1-2 AU (unità arioso), e la potenza del laser è stata regolata a livello più basso possibile per evitare qualsiasi photobleaching significativo. </li></ol> 7. Provocare la SAC da Microinjecting degli embrioni con reagenti appropriati <ol><li> Preparare l&#39;ago prima dell&#39;esperimento. Noi preferiamo estrarre l&#39;ago dal vetro siliconato capillari (GC-100-10, Harvard) utilizzando il fiammeggiante / marrone micropipetta estrattore (Instrument Sutter, Modello: P-97) con parametri: il calore = 600, tirare = 90, vel = 70 , del = 150. </li><li> In sostegno degli l&#39;ago con 1-2 ml di una concentrazione appropriata del reagente in tampone iniezione usando una punta fine di caricamento (20 pl lotto Eppendorf: W215818J). </li><li> Montare l&#39;ago nel Ho agolder sul microscopio con il tubo di mandata collegato al sistema di controllo dell&#39;iniezione Eppendorf. </li><li> Trova un embrione sotto obiettivo 40X e trovare l&#39;ombra dell&#39;ago senza modificare il piano focale spostando l&#39;ago nel centro del campo visivo e gradualmente si abbassa al piano focale destra. </li><li> Spostare l&#39;embrione dolcemente per trovare la piccola piazza del vetrino rotto pre-montato ad una estremità della striscia di colla. Molto delicatamente spostare la punta dell&#39;ago fino a raggiungere il bordo del vetrino piazzetta e si rompe delicatamente aperto. </li><li> Spostare gli embrioni di nuovo in vista e selezionare l&#39;embrione l&#39;età giusta per l&#39;iniezione. Io di solito iniettare l&#39;embrione al ciclo di divisione nucleare a 5-7 come questo è prima di migrare verso l&#39;esterno i nuclei alla corteccia. Le fasi nucleare ciclo di divisione può essere determinata da una scansione rapida dei segnali fluorescenti del GFP-Cdc20 o il segnale nucleare di RFP-Histone 2B prima dell&#39;iniezione 9. </li><li> Muovere con cautela il Embryo vicino all&#39;ago e regolare nuovamente il piano focale sia per l&#39;embrione e l&#39;ago. Spostare l&#39;embrione in l&#39;ago ed iniettare una goccia del reagente nella posizione desiderata e spostare l&#39;embrione di distanza (o seguire le istruzioni per il sistema microiniezione). L&#39;embrione può essere iniettata dal suo posteriore o dal lato a seconda dello scopo dell&#39;esperimento. </li><li> Una volta iniettata l&#39;embrione è pronto per essere ripreso al momento opportuno. (Vedi Figura 2F &amp; G) </li></ol> 8. Risultati rappresentativi <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" /> Figura 1. Materiale occorrente: a. pen pennello sottile, b. piazzetta rotti gli occhiali contenitore, c. 22 x 50 mm coprioggetti, d. vetrino da microscopio, e. nastro biadesivo appiccicoso, f. lievito in polvere secca provetta con fori sul coperchio, g. lievitogranuli utilizzato per la manutenzione fly, h. volare vial cibo, i. un mezzo di una pinzetta utilizzati per embrioni dechorionate, j. una pinzetta, k. eptano colla contenitore di liquido (matraccio). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" /> Figura 2. I diagrammi mostrano la preparazione dei vetrini coprioggetto e diapositive nel passaggio 4, dechorionation embrione nel passaggio 5 e preparati ad aghi per la microiniezione al punto 7. A. L&#39;immagine in alto mostra un vetrino con una striscia di colla eptano in tutta la sua media e una piccola piazza di un vetrino rotto attaccato ad una estremità. L&#39;immagine inferiore mostra un vetrino da microscopio con un sottile strato di acqua ai suoi quattro angoli per tenere un vetrino coprioggetto. La ragione per l&#39;utilizzo di una diapositiva per tenere il vetrino è quello di mantenere o meno la stessa distanza focale che si trova quando si ha del nastro biadesivo sulle slitte e evitando ricentrare il microscopio mentre si are dissezione e trasferire gli embrioni tra il nastro e coprioggetto. B. Una diapositiva con un breve tratto di nastro biadesivo Scotch applicato prima che si staccava il suo documento di copertura utilizzato per dechorionating l&#39;embrione. C. L&#39;immagine a sinistra mostra embrioni con gusci coriali intatti contrassegnati con estremità anteriori e posteriori, l&#39;immagine a destra mostra gli embrioni coriali i gusci rotti, prima che fossero trasferiti sul vetrino con la striscia di colla D &amp; E diagrammi che mostrano due.. modi per il trasferimento, posizionamento e l&#39;allineamento degli embrioni dechorionated su strisce di colla. Gli embrioni sono stati coperti da olio 10S dopo un periodo di essiccamento appropriato. Diagrammi F e G. mostrano come aprire la punta dell&#39;ago e la posizione in modo da iniettare. Immagini singole o time-lapse ottenuti dagli esperimenti sopra descritti possono essere analizzati direttamente con il software Leica o salvati in file TIF come un open FOdisponibili per la quantificazione ulteriore o le analisi di editing con altri comuni programmi di analisi delle immagini come immagine J, Photoshop e MetaMorph, ecc Due esempi per illustrare questo MATERIALE sono discussi di seguito: Esempio 1: Un time-lapse movie (Figura 3) mostra il reclutamento dinamica cinetocoro di GFP-Cdc20 e il movimento dei cromosomi nel vivere embrioni di Drosophila sinciziale. La regione di interesse da parte originali time-lapse è stata determinata sequenza di immagini / a cura e automatizzato-lotto convertiti con il software Photoshop. Il film è stato assemblato utilizzando il software QuickTime. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" /> Figura 3. Un time-lapse filmato mostra il reclutamento dinamica cinetocoro di GFP-Cdc20 e il movimento dei cromosomi nel vivere embrioni di Drosophila sinciziale. (A) Time-lapse immagini sono state scattate da un embrione transgenico sinciziale co-esprimono GFP-Cdc20 (in verde)e RFP-Histone 2B (in rosso) e di proteine ​​di fusione sono stati registrati usando un sistema confocale Leica TCS SP2 a 18 ° C durante i cicli di divisione nucleare 7-8. I frame sono stati prelevati ogni 10 secondi. Il telaio con le cellule già in profase viene considerato come il punto di tempo zero 10. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il film per la figura 3A</a> . (B) GFP-Cdc20 può essere facilmente osservata profase e prometafase cinetocori (B3 e 4, frecce bianche) e persiste su metafase e anafase cinetocori (B5 e 6, frecce bianche). GFP-Cdc20 è esclusa dalla interfase nucleo (freccia bianca), inserendo il nucleo di profase precoce. Morfologie cromatina sono stati determinati usando co-espressi His2BmRFP come marcatori (B8-14). Bar = 5mm. Esempio 2: funzioni SAC può essere studiata attraverso la manipolazione degli embrioni da anticorpi, proteine ​​microinjecting fluorescente o Chemical composti di interesse che potenzialmente innescano il SAC. Ad esempio, l&#39;iniezione di colchicina depolimerizzano i microtubuli in modo da provocare la SAC come indicato in Figura 4 10. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" /> Figura 4. Mad2 è essenziale per la colchicina-invocato la funzione SAC 10. GFP-cdc20; Mad2 + / +, GFP-cdc20; Mad2 EY (Mad2 - / - null mutante) e GFP-Mad2; Mad2 embrioni EY sono stati trattati con colchicina con microiniezione. Time-lapse immagini confocali sono state prese prima (01, 07 e 13) o dopo l&#39;iniezione (02-06, 08-12; pannelli superiori, pannelli intermedi; 14-18, pannelli inferiori). GFP-Cdc20 (pannelli top e middle) o GFP-Mad2 (pannello inferiore) segnali cinetocoro sono state usate come marcatori di progressione del ciclo cellulare. Pannello superiore, le frecce indicano i cinetocori arrestati a 02-06. L&#39;area contrassegnato da una freccia in 01 indica che prima del trattamento colchicina, GFP-Cdc20 viene escluso dal nucleo interfase tardi. Pannello centrale, in assenza di endogeno Mad2, GFP-Cdc20 segnali continuano ad oscillare in e fuori del nucleo, e dentro e fuori le cinetocori, sebbene citocinesi presenta difetti, come ci si aspetterebbe in embrioni privi microtubuli, in presenza di colchicina (indicato dalle frecce nella 07-12) suggerendo una funzione SAC fallito arrestare cellule in risposta al trattamento colchicina. La separazione del nucleo figlia fallito in figura 10. Pannello inferiore, punte di freccia indicano in 14-18 cinetocori arrestati con GFP-Mad2 accumulato proteine ​​di fusione per suggerire funzionale GFP-Mad2 in soccorso il fenotipo difetto SAC in Mad2 embrione mutante. Arrowhead in 13 indica GFP-Mad2 accumulo in un nucleo interfase tardi. Bar = 5mm. Gli embrioni sono stati microiniettati con ~ volume di uovo 1% di una soluzione 100mg/ml magazzino colchicina in 1 x PBS.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto è un metodo generico per l&#39;imaging intero embrioni sinciziale utilizzando un Leica TCS SP2 microscopio confocale a scansione laser e può essere modificata per adattarsi altri sistemi microscopio e possono anche essere adattate per studiare le funzioni geniche altre utilizzano embrioni Drosophila sinciziale. Abbiamo usato questo protocollo per studiare molti aspetti del checkpoint di assemblaggio del mandrino, la dinamica delle proteine ​​e proteolisi delle proteine ​​con la mosca transgenici o anticorpi policlonali per visualizzare la localizzazione delle proteine ​​nei campioni viventi o fissi 4,6,12-14. E &#39;più semplice per mantenere le mosche in fiale, fresco, cibo mosca al momento del ritiro numeri piccoli (~ 10 - 100) di uova. Questo riduce il fastidio di fare e la preparazione di ulteriori piastre di agar succo di mela e le camere di raccolta delle uova, come descritto in altre pubblicazioni 15,16. L&#39;aggiunta di un piccolo quadrato coprioggetto di vetro rotto ad una estremità della striscia di colla sul vetrino rende molto più facileper aprire l&#39;ago e determinare il volume di iniezione regolando le impostazioni microiniezione di sistema, mentre l&#39;ago è immergere nell&#39;olio 10S. Il grado di essiccazione dell&#39;embrione è importante per il successo della iniezione di evitare perdite e mantenere la vitalità embrioni soprattutto per gli esperimenti che richiedono un lungo periodo di tempo durante il sollevamento o trasformanti dopo l&#39;iniezione. Tuttavia, non vi è alcuna regola d&#39;oro esattamente per quanto tempo di essiccazione è richiesto. Questo varia da esperimento a esperimento e dipende dalla quantità di soluzione iniettata e l&#39;umidità dell&#39;ambiente di lavoro. Le funzioni di una specifica proteina di interesse può essere manipolato da microinjecting inibitori della proteina specifici, mono-o poli-clonale gli anticorpi contro una proteina specifica, l&#39;RNA messaggero o peptidi fluorescente sotto wild type o sfondi mutazione genetica. Molte di queste linee mutanti o GFP-tagged linee transgeniche sono accessibili al pubblico available dalla Drosophila centri di magazzino e la maggior parte di essi sono elencati sul Flybase ( <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) e possono essere consultate online.

Attrezzature essenziali e reagenti: Sistema di imaging confocale: Il sistema di imaging descritto in questo protocollo è un Leica TCS SP2 sistema di scansione laser confocale microscopio invertito. Il metodo descritto è adatto anche forse con alcune piccole modifiche per altri sistemi di imaging. Dissezione microscopio: Usiamo un SZX7 Olympus con DF PLAPO 1X-4 lenti. Needle puller: Flaming / marrone micropipetta estrattore (da Sutter Instrument, Modello: P-97). Microiniezione sistema: Un sistema microiniezione Eppendorf è descritto ma altro sistema idoneo può essere utilizzato. Fly distributore alimentare: Jencons Scientific Ltd pompa peristaltica. Reagenti: <table border="1"><tbody><tr><td> Ingredienti </td><td> Pesos </td><td> Risorse </td><td> Lot No. </td></tr><tr><td> Farina di mais </td><td> 100.0g </td><td> SUMA, UK </td><td></td></tr><tr><td> Di zucchero di canna </td><td> 50.0g </td><td> Billington, il Regno Unito </td><td></td></tr><tr><td> Lievito in polvere </td><td> 25.0g </td><td> DCL LIEVITO Ltd. UK </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 12.5g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> L&#39;acido sorbico </td><td> 0.4g </td><td> BDH, VWR International Ltd. UK </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> Acido benzoico </td><td> 2.9g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagina (Metil-4-Hydro xybenzoate) </td><td> 0,9 g </td><td> BDH, VWR International Ltd. UK </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> H 2 O fino a 1L </td><td></td></tr></tbody></table><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Tabella 1. Fly ingredienti alimentari. Holocarbon 700 e 27 oli acquistati da Sigma. Lievito secco: Allison Thomas, UK. Preparare la colla eptano: Prendere circa 1,5 metri di nastro biadesivo Scotch, metterlo in un tubo Falcon da 15 ml con 5 ml di eptano e ruotare per 3-5 ore o durante la notte. Dopo quel tempo diviso in 4 aliquote uguali in 1,5 ml provette Eppendorf e centrifugare per 5 min a velocità elevata in una centrifuga da banco per rimuovere eventuali detriti. Conservare la soluzione di eptano colla in un pallone tarato da 10 ml e mantenere per l&#39;uso. La forza colla varierà a seconda della concentrazione e le quantità di colla utilizzata. Normalmente, la colla più sottile produce meno rumore di fondo durante la scansione al microscopio confocale. <ul><li> Coverslip: BDH, VWR International Ltd. UK </li><li> Vetrino da microscopio: BDH, VWR International Ltd. UK &lt;/ Li&gt; <li> Siliconato capillari di vetro: GC-100-10, Harvard </li><li> Caricamento a punta sottile: 20μl molto eppendorf: W215818J </li><li> Pinzetta </li><li> Pen pennello sottile </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

L&#39;assemblaggio del mandrino checkpoint (SAC) meccanismo è un segnale attivo, che controlla l&#39;interazione tra cinetocori cromosomiche e microtubuli del fuso per prevenire l&#39;insorgenza anafase fino a quando i cromosomi sono collegati correttamente. Le cellule utilizzare questo meccanismo per impedire l&#39;instabilità genomica o di aneuploidia, e quindi tumori e altre malattie umane, come difetti alla nascita e l&#39;Alzheimer 1. Un certo numero di componenti SAC come Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod e Aurora B chinasi sono stati identificati e sono tutte le proteine ​​cinetocoro dinamiche 2. L&#39;evidenza suggerisce che il cinetocore è dove il segnale SAC viene avviata. L&#39;obiettivo primario SAC normativo Cdc20. Cdc20 è uno dei principali APC / C (A naphase P ROMUOVERE omplex C o C yclosome) attivatori 3 ed è anche una proteina cinetocoro dinamico 4-6. Quando attivato, il SAC inibisce l&#39;attività di APC / C per evitare la distruzione dei due substrati chiave, ciclina B e securin, impedendo così la metafase anafase di transizione 7,8. Esattamente come il segnale SAC è avviato e montato sulle cinetocori e trasmesso sul APC / C per inibire la sua funzione rimane ancora sfuggente. Drosophila è un sistema estremamente docile sperimentale, un organismo molto più semplice e più comprensibile rispetto a quella umana, ma che condivide i processi fondamentali in comune. Si tratta, forse, uno dei migliori organismi da utilizzare per studi di bio-imaging in cellule viventi, in particolare per la visualizzazione degli eventi mitotici nello spazio e nel tempo, come l&#39;embrione precoce passa attraverso 13 cicli rapidi divisione nucleare sincrono (8-10 minuti per ogni ciclo a 25 ° C) e organizza gradualmente i nuclei in un monostrato unico appena sotto la corteccia 9. Ecco, vi presento un bio-imaging metodo che utilizza espressioni Drosophila transgenicosing GFP (Green Fluorescent Protein) o la sua variante con targeting per proteine ​​di interesse e una Leica TCS SP2 sistema di microscopio confocale a scansione laser per studiare la funzione SAC in mosche, mostrando immagini di proteine ​​di fusione GFP di alcuni dei componenti del CAS, Cdc20 e Mad2 , come esempio.

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Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni usando una Leica sistema laser confocale a scansione.

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni sinciziale

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

11.3K Views.  University of Newcastle, United Kingdom. Il cinetocore è dove il SAC inizia il suo segnale di controllo della segregazione mitotica dei cromatidi fratelli. Un metodo è descritto per visualizzare il reclutamento e il fatturato di una delle proteine ​​cinetocoro e il suo coordinamento con il movimento dei cromosomi in Drosophila Embrioni usando una Leica sistema laser confocale a scansione.

Video: Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Applicazione della Luce cured resina adesiva dentale per montaggio elettrodi o sonde Microdialisi negli esperimenti cronica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Ricerca

Biologia

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

L&#39;interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteina-proteina interazione Screening per Protein-frammento Complementation Assay (PCA) in cellule viventi

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in<em&gt; Drosophila</em&gt; ovaie

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine ​​cinetocoro e Motion cromosoma in Living

Studiare Checkpoint mitotica illustrando un comportamento dinamico delle proteine cinetocoro e Motion cromosoma in Living