Nos gustaría agradecer al Dr. Guo-Chiuan Hung y Dr. Bharatkumar Joshi valiosos comentarios que mejoraron el manuscrito.

Todos los experimentos llevados a cabo en estos estudios fueron realizados según protocolos de actuación aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso en el centro de investigación de alimentos y drogas (FDA).
1. aislamiento y cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)
<ol><li>Aislar los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de una cepa de PP2A-B56γ-ratón y hermanos de camada de tipo salvaje por protocolo estándar 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs para 3 pasajes, congelar y almacenar hasta que se necesite para experimentos 8.</li>
</ol>2. cultivo de Mefs en pozo 2 cámaras del vidrio para vivir imágenes
<ol><li>Preparar 500 mL de medio de crecimiento de MEF con medio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM/F12) con 10% suero bovino Fetal (FBS), antibióticos de penicilina/estreptomicina X 1, L-glutamina (200 mM) y 1 X aminoácidos no esenciales (AANE) en una botella de 500 mL de media.</li>
	<li>Descongelar los frascos de MEFs congelados de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones en el paso 3 en el baño de agua precalentada a 37 ° C.</li>
	<li>Transferencia de MEFs descongeladas para tubos de 15 mL y añada lentamente gota a gota 20 mL de medio DMEM/F12 en los tubos de 15 mL con una pipeta de 10 mL.</li>
	<li>Transferencia de MEFs junto con 20 mL de DMEM/F12 medios de cultivo en matraces T75 y expandirlos hasta que las células son confluentes de 70%. Confluencia se estima usando un microscopio inverso a x 4 o 10 aumentos.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo utilizando un Potrero de vidrio pipeta conectada a un sistema de vacío en la campana, añadir 3 mL de 0.25% tripsina/EDTA e incubar a 37 ° C por 5 minutos agregar 3 mL de medio de cultivo DMEM/F12 para detener la reacción.</li>
	<li>Centrifugar las células a baja velocidad (300 x g) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de medio de cultivo DMEM/F12 calentado previamente a 37 ° C en un baño de agua.</li>
	<li>Enumerar las células mediante el método de exclusión azul de tripano u otro celular apropiado contar método 8.</li>
	<li>Aproximadamente 20.000 MEFs/pozo en un pozo de 2 cámara cristal de la semilla. Añadir 200 μL/pocillo de medio de cultivo DMEM/F12 y dejar las células a conectarles incubando toda la noche a 37 ° C y 5% CO2.</li>
</ol>3. sincronización
<ol><li>Sincronizar MEFs en fase G0/G1 por incubando las células en medios de cultivo DMEM/F12 que contiene 0.1% FBS durante 24 h, para obtener un número máximo de células en fase G0/G1. Nota: Aunque hambre de suero se utilizó como método de preferencia, varios otros métodos pueden utilizarse dependiendo de la etapa mitótica en la que las células se necesitan para ser arrestado 10.</li>
</ol>4. etiquetado
<ol><li>Prepare solución de nocodazole en DMSO con 1,5 mg/mL. Nocodazole detiene las células en fase G2/M mediante la inhibición de la formación de microtúbulos 10.</li>
	<li>Tres días post sincronización, añadir 200 μL de medio de cultivo (con 10% FCS) y 200 ng/mL nocodazole regente CL-HB (histona 2B-GFP BacMam 2.0).</li>
	<li>Calcular al regente CL-HB partículas por célula (PPC) que se añade a las células como sigue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> Donde el número de células es el número total estimado de células en el momento del etiquetado, PPC es el número de partículas por célula, y 1 × 108 es el número de partículas por mL de reactivo. Por ejemplo, a las células de etiqueta 20.000 con un PPC de 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> Nota: Regente de CL-HB funciona con más tipos de células entre 10 y 50 de la PPC. Sin embargo, PPC 30 trabajado mejor para este estudio.</li>
	<li>Incubar MEFs durante 18 h a 37 ° C y 5% CO2. Nota: Para el experimento actual, visualización de los cromosomas en las células mitotic escapar el puesto de control de ensamblaje del huso produjo 18 h después de la detención del ciclo celular con nocodazole.</li>
</ol>5. visualización de los cromosomas del revestimiento
<ol><li>Visualizar los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) utilizando un sistema de microscopio confocal spinning disco equipado con una cámara y una inmersión de aceite, 63 x objetivo.<ol>
<li>Uso de longitud de onda de excitación de 488 nm y longitud de onda 450 nm de emisión para la adquisición de imagen de canal GFP.</li>
		<li>Usar un sistema de microscopio confocal de disco giratorio con la capacidad de etapas exploración motorizadas, Z Piezo insertos, incubación de etapa superior y recuperación de fluorescencia directa tras foto blanqueo para esta técnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Un día antes de la proyección de imagen, encienda la cámara y calentar toda la cámara a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Encienda el microscopio, cámara, unidad de disco de hilatura, iluminador, láser de argón, computadora y etapa motorizada.</li>
	<li>Deje que el sistema caliente durante 3 minutos; activar el láser de argón girando en llave de encendido. El interruptor de palanca para el laser de argón de "standby" a "funcionamiento del laser".</li>
	<li>Inicie el software de adquisición y procesamiento de datos.</li>
	<li>Iniciar el controlador de CO2 para la incubadora de etapa superior y establecer la concentración de CO2 al 5%. Esto debe hacerse antes del comienzo de la proyección de imagen.</li>
	<li>Quitar el vidrio de cubierta de cámara de la incubadora y el lugar en el escenario para la visualización. Visualizar las células por medio de un aceite inmersión 63 x objetivo (NA1.4).</li>
	<li>Ve a través de las lentes oculares, enfocar la imagen e identificar una célula en etapa de descomposición (NEBD) envoltura nuclear.</li>
	<li>Iniciar el láser apropiado (488 nm láser de argón para visualizar Histone2B-GFP).</li>
	<li>Abrir la ventana de control de adquisición y establecer el tiempo de exposición para el canal GFP. Identificar una célula que se encuentra en NEBD.<ol>
<li>Manualmente determinar la parte superior de la celda objetivo y plano focal inferior y entrar en el sección configuración óptico xyz.</li>
		<li>Observar durante 20 min; Si la célula no procede a través de la división celular, deje de adquisición de imágenes después de 20 minutos y pasar a la siguiente celda que se encuentra en NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aproximadamente 1 h por celda es necesario para los cromosomas de revestimiento de la imagen durante la mitosis en PP2A-B56γ-células que escaparon de la SAC. Para obtener datos de una película, tomar fotos cada 3 minutos. Nota: las células de tipo salvaje arrestaron y no avanzar más allá de NEBD cuando se tratan con nocodazole.</li>
	<li>Guardar imágenes en formato de archivo de zvi para su posterior análisis.</li>
</ol>6. procesamiento y análisis de imágenes
Nota: Ejecutar el procesamiento de imagen tridimensional y análisis utilizando cualquier software disponible como Axiovision versión 4.8.2 o Imaris versión 8.2. Para este estudio el ImageJ se utilizó el software.
<ol><li>Abra la secuencia de imágenes. Si las imágenes ya están en un formato apilado, proceder al siguiente paso. Si no, combinar todas las imágenes relevantes en un pila utilizando ' imagen > pilas > pila de imágenes ' en la barra de menús.</li>
	<li>Realizar cualquier ajuste necesario a brillo/contraste y niveles.</li>
	<li>Para agregar un sello de tiempo a la película:<ol>
<li>Vaya a ' imagen > pilas > etiqueta...' en la barra de menús.</li>
		<li>Seleccione el formato adecuado, el valor inicial de tiempo y el intervalo de tiempo entre cada imagen.</li>
		<li>Marque la casilla 'Vista previa' y ajustar la configuración de la ubicación y formato. Pulse 'Aceptar' para aplicar la marca de tiempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para agregar una barra de escala a la película:<ol>
<li>La imagen escala bajo ' Analyze > Set escala ' en la barra de menús.</li>
		<li>En el campo de la 'Distancia en píxeles', introduzca un número de píxeles que se conoce la distancia y en el campo de la 'Distancia de la conocida' ingrese la distancia. Establece la unidad correcta de la longitud de la distancia, por ejemplo, en μm. Pulse 'Aceptar' para aplicar la escala a la pila.</li>
		<li>Ir a ' Analyze > Herramientas > escala bar... ' para agregar la barra de escala. El tamaño de la barra como 'En μm de ancho' y ajuste el resto de opciones según sea el caso de formato. Marque la casilla 'Todos los sectores de la etiqueta' para agregar la barra de escala a toda la pila.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Previsualizar la película haciendo clic en el botón play triangular en la parte inferior izquierda el borde de la ventana de imagen. Ajustar la tasa de marco con ' imagen > pilas > Animación > animación opciones en la barra de menús.</li>
	<li>Exportar el archivo de película seleccionando ' archivo > Guardar como > AVI...' y seleccione la velocidad de fotogramas y la compresión.</li>
	<li>Pulse 'Aceptar' para seleccionar el guardar ubicación y nombre de archivo. Pulse 'Guardar' para guardar el archivo de película.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li><li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+and+cancer:+cutting+through+the+mystery.">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis.">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li><li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer.">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li><li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+phosphatase+2A+B56&#947;+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development.">The protein phosphatase 2A B56&#947; regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).</li><li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP2A-B56&#947;+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint.">PP2A-B56&#947; is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites.">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).</li><li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Puestos de control del ciclo celular que garanticen la segregación cromosómica precisa evitar aneuploide y celular transformación 1,2,3. En el presente estudio, encontramos que la inactivación de PP2A-B56γ resultó en un puesto de control de montaje de husillo debilitado. Celular directo imágenes nos permitieron observar la segregación errores cromosómica durante la mitosis en la MEFs de PP2A-B56γ tratados con nocodazol...

En el siguiente protocolo, describimos un método conveniente para visualizar la segregación cromosómica y la progresión mitótica durante el ciclo celular en fibroblastos embrionarios de ratón usando histona 2B-GFP, etiquetado BacMam 2.0 y proyección de imagen de células vivas.
Puestos de control de ciclo celular monitor segregación cromosómica y juegan un papel importante en el mantenimiento de la integridad genética de la célula 1,2,3. Acumulación de los cromosomas segregados mal puede llevar a aneuploidía, que es una característica de los tumores sólidos más 4. Por lo tanto, la detección de los cromosomas del revestimiento puede utilizarse como un método para el estudio de inestabilidad cromosómica.
Etiquetado fluorescente proteínas pueden ser utilizado para visualizar segregación cromosómica vivo y cromosomas rezagados pero la generación de etiquetas mCherry o proteína H2B-GFP etiquetado requiere conocimiento substancial del gene entrega y biología molecular 5. Aquí describimos el uso del reactivo de CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0, regente de CL-HB, por simplicidad en lo sucesivo. Este reactivo puede utilizarse inmediatamente y elimina así las preocupaciones sobre la integridad y calidad de vector. Además, este reactivo no requiere el uso de tratamientos potencialmente dañinos o lípidos y productos químicos del colorante de carga. A diferencia de las etiquetas fluorescentes convencionales, el regente de la CL-HB manchas independientemente de la función (es decir., potencial de membrana). El regente CL-HB puede ser simplemente añadido a las células y se incubó toda la noche para la expresión de la proteína. El regente de la CL-HB no se replica en células de mamíferos y puede ser utilizado en la configuración de nivel de bioseguridad (BSL) 1 laboratorio. También, se puede detectar esta transfección transitoria después de la incubación durante la noche durante 5 días, tiempo suficiente para llevar a cabo análisis celulares más dinámico.
Por otra parte, anomalías cromosómicas podrían ser estudiados por varias técnicas como la citometría de flujo, inmunohistoquímica o fluorescencia in situ hibridación (pescado) 6. Citometría de flujo puede utilizarse para el estudio de la aneuploidía, que puede ser medido basado en contenido de ADN y la fase de células en ciclo celular. Aunque citometría de flujo puede utilizarse para medir aneuploidía, no proporciona información sobre segregación de errores cromosómica. PESCADO con técnicas de inmunohistoquímica utilizan sondas fluorescentes para obligar a ADN o los cromosomas. Mientras que estas técnicas proporcionan una instantánea de la situación de una población de células, no permiten el vivo de la célula de tal modo que falta cualquier información obtenida a través de la visualización espaciotemporal de citocinesis en células específicas durante un período de tiempo.
Este protocolo fue utilizado para estudiar los cromosomas de revestimiento o segregación errónea cromosómica en fibroblastos embrionarios de nocodazole tratado ratón (MEFs) aislado de PP2A-B56γ-ratones. Además de la anterior aplicación, este protocolo proporciona una herramienta sencilla para marcar y visualizar la segregación cromosómica en diversos tipos celulares que pueden utilizarse para estudiar la regulación del ciclo celular o inestabilidad cromosómica en las células del tumor. Además, también puede utilizado para el estudio de inestabilidad cromosómica causada por varios tratamientos con fármacos o para estudiar los efectos del gen golpee hacia fuera dando por resultado la segregación cromosómica de mal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:128px;">11320082</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered saline</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>MX 1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryogenic vial storage boxes</td>
			<td style="width:135px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">10-500-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cryogenic vials</td>
			<td style="width:135px;">Corning/costar</td>
			<td align="right">431416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:135px;">Cellstar</td>
			<td align="right" style="width:128px;">658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">2 well chambered cover glass</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td style="width:128px;">155380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cellometer Vision Cell Profiler</td>
			<td style="width:135px;">Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td style="width:128px;">Cellometer Vision Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:128px;">C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td>
			<td style="width:135px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td style="width:128px;">Zeiss Cell Observer SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Water Bath</td>
			<td style="width:135px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:128px;">280 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Incubator</td>
			<td style="width:135px;">Sanyo commercial solutions</td>
			<td style="width:128px;">MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Class II Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:135px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:128px;">SterilGard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Axiovision software</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:128px;">Ver.4.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:135px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:128px;">Ver. 1.51r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

Los cromosomas deben ser fiable y uniforme separados en células de la hija durante la división celular mitótica. Fidelidad de la segregación cromosómica es controlado por múltiples mecanismos que incluyen el eje montaje puesto de control (SAC). El saco es parte de un sistema complejo que es responsable para la prevención de un progreso de la célula por mitosis salvo los cinetocoros cromosómicos se han unido para huso de microtúbulos. Cromosomas anormales y retraso cromosómico segregación es un indicador de puntos de control de ciclo celular disfuncional y pueden utilizarse para medir la estabilidad genómica de dividir las células. Desregulación del saco puede resultar en la transformación de una célula normal en una célula maligna a través de la acumulación de errores en la segregación cromosómica. Implementación del saco y la formación de los cinetocoros complejo están estrictamente regulados por interacciones entre quinasas y fosfatasas como proteína fosfatasa 2A (PP2A). Este protocolo describe la proyección de imagen de células vivas de los cromosomas en fibroblastos embrionarios de ratón aislados de ratones que tenían un nocaut de la subunidad reguladora de la PP2A-B56γ del revestimiento. Este método supera las deficiencias de otros ciclo celular control técnicas de imagen como la citometría de flujo o inmunocitoquímica que sólo proporcionan una instantánea de un estado de citocinesis de la célula, en lugar de una visualización dinámica espaciotemporal de los cromosomas durante la mitosis.

MEFs de tipo salvaje y PP2A-B56γ-ratones fueron sembradas en un vidrio de cubierta de la cámara 2-bien y permitidos para fijar. En el día 2, MEFs se sincronizaron con 0.1% FBS para 24 h. El día 3, MEFs en medios con 200 ng/mL nocodazole y 30 regentwere de PPC CL-HB se incubaron durante 18 h a 37° C y 5% CO2. El día 4, las células fueron fotografiadas utilizando un sistema de microscopio confocal de disco giratorio (figura 1). En v...

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted reproduction also allows for the production of embryos from high performers without interrupting their sports career and contributes to an increase in the number of foals from mares of high genetic value. The present manuscript describes the procedures used for collecting immature and mature oocytes from horse ovaries using ovum pick-up (OPU). These oocytes were then used to investigate the incidence of aneuploidy by adapting a protocol previously developed in mice. Specifically, the chromosomes and the centromeres of metaphase II (MII) oocytes were fluorescently labeled and counted on sequential focal plans after confocal laser microscope scanning. This analysis revealed a higher incidence in the aneuploidy rate when immature oocytes were collected from the follicles and matured in vitro compared to in vivo. Immunostaining for tubulin and the acetylated form of histone four at specific lysine residues also revealed differences in the morphology of the meiotic spindle and in the global pattern of histone acetylation. Finally, the expression of mRNAs coding for histone deacetylases (HDACs) and acetyl-transferases (HATs) was investigated by reverse transcription and quantitative-PCR (q-PCR). No differences in the relative expression of transcripts were observed between in vitro and in vivo matured oocytes. In agreement with a general silencing of the transcriptional activity during oocyte maturation, the analysis of the total transcript amount can only reveal mRNA stability or degradation. Therefore, these findings indicate that other translational and post-translational regulations might be affected.
Overall, the present study describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize the horse oocyte, a cell type that is extremely challenging to study due to low sample availability. However, it can expand our knowledge on the reproductive biology and infertility in monovulatory species.

This manuscript describes an experimental approach to morphologically and biochemically characterize horse oocytes. Specifically, the present work illustrates how to collect immature and mature horse oocytes by ultrasound-guided ovum pick-up (OPU) and how to investigate chromosome segregation, spindle morphology, global histone acetylation, and mRNA expression.

Análisis de la segregación cromosómica, acetilación de histonas y morfología de huso en ovocitos de caballo

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

Imágenes de células vivas de citoesqueleto de microtúbulo y manipulación micromecánica del Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

Imágenes Intranuclear Actin Rods en vivo calor estresado Drosophila Embriones

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

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Live-proyección de imagen de la