Bu protokol, Wellcome Trust hibe kapsamında geliştirilmiştir. Biz sinek stoklarının muhafaza edilmesi ve yıl içinde sinek yemek pişirirken Bayan Maureen Sinclair teşekkür ederim. Biz de bu protokolün gelişmekte onun yardım ve teknik destek için Sayın Michael Aitchison teşekkür etmek istiyorum.

1. Transgenik Sinekler ve Bakım <ol><li> Transjenik Bu tanıtım kullanılan sinekleri: Ubq-gfp-Cdc20 (II), Ubq-RFP-His2B (X *); Ubq-gfp-Cdc20 (II *), Ubq-gfp-Cdc20 (II *); mad2 EY ( III *) ve Ubq-gfp-Cdc20 transgenik sinekler önce, standart bir P-eleman aracılı transgenik yaklaşım 10,11 ve Ubq-rfp-His2B UMR 144 CNRS / Enstitü Curie de Yohanns Belaïche bir tür hediye yoluyla laboratuarda üretildi Paris, Fransa. Onlar standart Drosophila genetiği üzerinden Mad2 mutant arka plan girmiştir. Mad2 EY orijinal mutant hattı Bloomington stok merkezi satın alındı. Bu protokolde transformantlar yükseltmek için kullanılan prosedür ele olmayacaktır. Not: * kromozom sayısını temsil eder. </li><li> Bakım: Transgenik sinekler 25 tutuldu plastik şişeler containin ° Cg gıda sinek ve üstüne ek kuru maya tozu ile. Flakon rutin yetişme koşulları (Şekil 1) bağlı olarak her 3-4 haftada değiştirildi. </li></ol> 2. (Laboratuar ölçekli) Gıda Hazırlama Fly <ol><li> Uçucu gıda karışımı, uygun bir miktarda bileşenleri çözünmesi için sürekli karıştırılarak ısıtıldı. </li><li> Bu orta yaklaşık 8-10 ml Jencons Bilimsel Ltd peristaltik pompa kullanarak her bir plastik şişeye (2.5 cm çap x 8 cm uzunluğunda) içine bulamaç olarak dağıtıldı. </li><li> Gıda bulamaç ayarlandı ve oda sıcaklığına kadar soğuduktan sonra, şişe bir pamuk köpük fişli takılı. Bu besinler şişeleri sonra plastik bir torbaya mühürlü ve ° C daha sonra kullanılmak üzere 4 tutulur bir tepsiye yerleştirilir. </li></ol> 3. Küçük ölçekli Yumurta Toplama <ol><li> 2-3 günlük ergin sinek yaklaşık 50 çift lay için 25 yüzeyinde ek kuru maya tozu ile birlikte taze bir sinek gıda flakon ° C aktarılmıştırembriyolar ing. </li><li> Sinekler sonra taze bir şişeye her saat aktarılır ve çekirdekler yavaş yavaş kortekse göç zaman toplanan embriyoların bazı nükleer bölünme döngüsü 8-10 yaş civarındaki emin olmak için 30 dakika şişe içinde embriyo bırakıp olarak düzenlenen Tek tek tabakalı. Genellikle koşulları döşenmesi için uygun olmadığı zaman erkek vücudunda tutuldu yaşlı embriyolar içerdiğinden ilk bir saat koleksiyonu normal atılır. </li></ol> 4. Lameller ve Slaytlar hazırlanması <ol><li> 50 x 22 mm coverslip dışarı atın ve hafif nemli bir ince kalem fırça ve bir mikroskop lamı üzerine koydu kullanarak suyun çok küçük bir miktar ile bir tarafında dört köşe ıslak böylece coverslip çünkü kılcal yüzey gerilimi hareket etmiyor ince sıvı film tarafından neden oldu. </li><li> Lameller ortasında boyunca heptan tutkal ince bir şerit uygulayın, heptan coverslip üzerine tutkal bırakmak saniye içinde buharlaşmasına gerekir. </li><li>Küçük kareler (~ 1.5 mm 2) bir elmas kalemle başka coverslip Kes, bir pick up ve tutkal şeridin bir ucunu (bu mikroenjeksiyon gerektiğinde iğne ucu açmak için kullanılır) üzerine yerleştirin ve gelecek için diğerleri kaydetmek kullanın. </li><li> Başka bir mikroskop lamı alın ve kapak kağıdı kapalı yaklaşık 2 cm ona uzun ve soyma çift taraflı yapışkan bir bant yapıştırın. (Şekil 2A ve B bakınız). </li></ol> 5.. Dechorionate Embriyolar <ol><li> Bir taze gıda şişeye aktarın ve sinekler yumurta yaymak izin vermek için uygun bir sıvı miktarı ile slayt üzerinde çift taraflı yapışkan bant üzerine yaklaşık 50 yumurta transferi için nemlendirilmiş ince kalem fırça kullanın. Sıvı buharlaşmış erdiğinde yumurta bandı sadık olacaktır. </li><li> Bir mikroskop altında dokunmatik uzun ekseni boyunca yumurta birkaç kez koryon kadar yavaşça cımbız yarısı dış tarafına kullanılarak kırık ve açık olan fakat Chor içinde embriyo terkHızlı su kaybını önlemek için iyon kabuk. Yumurta 10-20 (tek bir deney için gerekli olan yumurta sayısına bağlı olarak) muameleye tabi tutulmuş olan kadar bu işlemi devam eder. </li><li> Embriyolar daha sonra kaldırdım ve koryon kabuk kaldırılır ve yavaşça tek yapıştırıcı şerit birine yerleştirilebilir. Yumurta yerleştirilir ve embriyo paralel ya da bunların mikroenjeksiyon edilecekse bağlıdır tutkal şeridinin uzun yan, anti-paralel uzun kenarı ile ya uyum edilebilir. </li><li> Embriyosu ya hemen görüntüleme için daha da kurumaya önlemek için Voltalef 10S yağı, uygun bir miktarda (Holocarbon 700 yağ ve 27 bir yağ 05:01 karışım, Sigma) ile hemen kapalı veya 3-8 dakika boyunca kurumaya haznesi yerleştirilebilir daha fazla oda ve deney amacı neme bağlı olarak bunları kurutmak. Mikroenjeksiyon gerekli ise aşırı su kaybını önlemek için uygun olduğunda kurutulmuş embriyolar 10S yağı ile kaplanmış olmalıdır. (Bkz: Şekil. 2C, D&amp; E). </li></ol> 6. Görüntüleme Embriyolar <ol><li> Yaşayan embriyoların Time-lapse veya tek görüntüleri HCX PL APO CS 40X 1.25 immersiyon yağı objektif (60 veya 100X hedefleri çok yüksek, deney amacına bağlı olarak kullanılabilecek bir Leica TCS SP2 ters konfokal mikroskop sistemi kullanılarak toplanan büyütme meydana gelecek beyazlatma fazla fotoğraf) kullanılır. </li><li> Görüntüleme birden spektrumları örtüşen florofor ve aynı embriyo içinde bir arada ifade edilir, her floresan proteini emisyon dalgaboyu sırayla toplanmıştır. Leica TCS SP2 sisteminizde bulunan eksitasyon ve emisyon dalga boyları şunlardır: GFP, λ Ex: 488 nm ve λ Em: 500-600 nm. TÇD, λ Ex: 543 nm ve λ Em: 555-700 nm. </li><li> A tek görüntü genellikle çerçevenin 2-taramalar ortalama ile 2 scanlines bir ortalama olarak elde edildi. Bu 512x512 p taramak için 6.3 saniye minimum alırsıralı tarama modu için eşzamanlı bir tarama modu, 15.44 saniye ve artış görülebilir görüntü iyi bir sinyal-gürültü oranı üretir. Bu kez hızlandırılmış görüntü toplama için zaman çerçeveleri kurarken dikkate alınması gerekir. </li><li> Iğne deliği normalde 1-2 AU (havadar birim) kuruldu ve lazer güç önemli photobleaching önlemek için mümkün olan en düşük seviyede ayarlandı. </li></ol> 7. Uygun reaktifler ile Embriyolar Microinjecting tarafından SAC provoke <ol><li> Deneyden önce iğne hazırlayın. Parametreleri ile: ısı = 600, = 90, vel = 70 çekin: Biz alev / kahverengi mikropipet çektirmenin (P-97 Sutter Enstrüman, Modeli) kullanılarak silikonlu cam kapilerleri (GC-100-10, Harvard) gelen iğne çekmek için tercih , del = 150. </li><li> Enjeksiyon tampon içinde, uygun bir reaktif konsantrasyonu 1-2 ml ince bir yükleme ucu (: W215818J 20 ul Eppendorf çok) kullanılarak iğne Dolgu. </li><li> İğne Ho iğne monteEppendorf enjeksiyon kontrol sistemine bağlı basınçlı boru ile mikroskop lder. </li><li> 40X objektif altında bir embriyo bulun ve görüş alanının ortasına iğne hareket eden ve yavaş yavaş sağ odak düzlemi onu düşürerek odak düzlemi değiştirmeden iğne gölge bulabilirsiniz. </li><li> Kırık coverslip yapıştırıcı şerit bir ucunda önceden monte edilmiş küçük kare bulmak için nazikçe uzak embriyo taşıyın. Bu küçük kare lameller kenarına vurur ve yavaşça açın kalıncaya kadar çok nazikçe iğne ucu hareket ettirin. </li><li> Görünümüne geri embriyolar taşıyın ve enjeksiyon için doğru yaş embriyo seçin. Çekirdekler kortekse dışarıya göç önce bu gibi normalde 5-7 nükleer bölünme döngüsünde embriyo enjekte edin. Nükleer bölünmesi döngüsü aşamaları GFP-Cdc20 veya önceden enjeksiyon için 9 RFP-histon 2B Nükleer sinyalinin flüoresan sinyalleri hızlı bir tarama ile tespit edilebilir. </li><li> Dikkatle Embry hareketo iğne yakın ve embriyo ve iğne hem de odak düzlemi tekrar ayarlayın. Iğne içine embriyo hareket ettirin ve istenilen pozisyon içine reaktif bir damla enjekte ve uzak embriyo hareket (veya mikroenjeksiyon sistemi için yönergeleri izleyin). Embriyo posterior veya deney amacına bağlı taraftan enjekte edilebilir. </li><li> Bir kez embriyo uygun zamanda yansıması hazır enjekte edilir. (Şekil 2F &amp; G&#39;ye bakınız) </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig1.jpg" /> Şekil 1.. Gerekli malzemeler: a. ince kalem fırça, b. küçük kare kırık gözlük kabı, c. 22 x 50 mm coverslip, d. mikroskop lamı, e. çift ​​taraflı yapışkan bant, f. kapağı, g delikli test tüpünde kuru maya toz. mayaGranül sineği bakım, s için kullanılır. gıda flakon, ben uçuyorum. dechorionate embriyosu için kullanılan bir cımbız bir buçuk, j. bir çift cımbız, k. heptan tutkal sıvı kabı (ölçülü balona). <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig2.jpg" /> Şekil 2. Diyagramları adım 4 adım 5 ve 7. adımda mikroenjeksiyon için iğne hazırlıklarına embriyo dechorionation yılında lamelleri ve slaytların hazırlanması göstermektedir. A. Üst resmi ortasından arasında heptan tutkal bir şerit ve bir ucuna yapışmış kırık lameller küçük bir kare ile bir coverslip gösterir. Alt resim coverslip tutmak için dört köşesine ince bir su tabakası ile bir mikroskop lamı gösterir. Coverslip tutmak için bir slayt kullanma nedeni slaytlar üzerinde çift taraflı bant var ve böylece mikroskop refocusing kaçınarak zaman bulundu kabaca aynı odak mesafesi tutmak size ar isee Anatomi ve teyp ve kapak arasında embriyo transferi. B. Çift taraflı bant kısa bir uzunluğu ile slayt embriyo. C dechorionating için kullanılan kapağı kağıt soyulmuştu önce uygulanır. Soldaki resimde işaretlenmiş ön ve arka uçları sağlam koryon kabukları ile embriyoları gösterir, onlar yapıştırıcı şerit ile coverslip üzerine transfer edilmeden önce sağdaki resim kırık koryon kabuklarında embriyoların gösteren D &amp; E Diyagramları iki gösteriyor.. , transfer yerleştirerek ve tutkal şeritlerin üzerine dechorionated embriyolar hizalamak için yollar. Embriyoların uygun bir kuruma süresinden sonra 10S yağı ile örtülmüştür. Bu şekilde enjekte etmek için iğne ve pozisyon ucu nasıl açılacağını gösteren F &amp; G. Diyagramları. Yukarıda açıklanan deneylerde elde Tek veya zaman atlamalı görüntüleri doğrudan Leica yazılımı kullanılarak analiz ya da açık bir fo olarak. TIF dosyalarını kaydedilebilirBu göstermek için böyle Görüntü J, Photoshop ve Metamorph vb iki örnek gibi diğer genel görüntü analiz programları kullanarak daha fazla miktar ya da düzenleme analizler için kullanılabilir rmat aşağıda tartışılmıştır: Örnek 1: Bir kez-lapse (Şekil 3) GFP-Cdc20 ve Drosophila sinsityal embriyolar yaşayan kromozom hareket dinamik kinetochore işe gösterir. Orijinal time-lapse dizisi görüntülerden ilgi Bölgede tespit / Saat ve otomatik-toplu Photoshop yazılımı kullanılarak dönüştürülür. Film QuickTime yazılımı kullanılarak toplandı. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig3.jpg" /> Şekil 3. Bir zaman-lapse GFP-Cdc20 ve Drosophila sinsityal embriyolar yaşayan kromozom hareket dinamik kinetochore işe gösterir. (A) Zaman aralıklı görüntüleri GFP-Cdc20 (yeşil) co-ifade eden bir transgenik sinsityal embriyo alındıve TTT-Histon 2B (kırmızı) füzyon proteinleri ve ° C nükleer bölünmede döngüleri sırasında 7-8 18 Leica TCS SP2 konfokal sistemi kullanılarak kaydedildi. Çerçeveler her 10 saniyede çekildi. Zaten profaz hücreleri ile çerçeve sıfır zaman noktası 10 olarak kabul edilir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3763/3763movie3A.mov" target="_blank">Şekil 3A için filmi görmek için buraya tıklayın</a> . (B) GFP-Cdc20 kolayca profaz ve prometafaz çekirdek zarı (B3 &amp; 4, beyaz oklar) gözlenen ve olabilir metafaz ve anafaz çekirdek zarı (B5 ve 6, beyaz oklar) devam etmektedir. GFP-Cdc20 erken profaz tarafından çekirdeği girerek, interfaz çekirdeği (beyaz ok) çıkarılmıştır. Kromatin morfolojileri belirteçleri (B8-14) gibi ortak dile getirdikleri His2BmRFP kullanılarak belirlenmiştir. Barlar 5mm =. Örnek 2: SAC fonksiyonları microinjecting antikorlar, floresan ile işaretlenmiş proteinler veya kimya tarafından embriyoların manipüle ederek ele alınabilirPotansiyel SAC tetikleyecek bu ilgi l bileşikleri. Örneğin enjekte kolşisin için mikrotübüllerin depolymerize Şekil 4. 10 belirtildiği gibi SAC provoke öyle. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3763/3763fig4.jpg" /> Şekil 4. Mad2 kolşisin-çağrılan SAC fonksiyonu 10 için gereklidir. gfp-cdc20; mad2 + / +, gfp-cdc20; mad2 EY (mad2 - / - boş mutant) ve gfp-mad2; mad2 EY embriyolar mikroenjeksiyon tarafından kolşisin ile tedavi edildi. Time-lapse konfokal görüntüleri (; 08-12, orta panelleri; 14-18, alt paneller 02-06, üst paneller) önce (01, 07 ve 13) veya enjeksiyon sonrasında alındı. GFP-Cdc20 (üst ve orta panelleri) veya GFP-Mad2 (alt panel) kinetochore sinyalleri hücre döngüsü ilerleme işaretleri olarak kullanılmıştır. Üst panel, oklar 02-06 yılında tutuklandı çekirdek zarı göstermektedir. 01 yılında bir okla işaretli alan kolşisin, GFP-C önce olduğunu gösterirDC20 geç interfaz çekirdeği çıkarılmıştır. Orta paneli varlığında, endojen Mad2 yokluğunda, GFP-Cdc20 sinyalleri çekirdek içinde ve dışında gidip gelmeye devam ve sitokinez arızalı olduğunu ancak çekirdek zarı açıp, gibi mikrotübüllerin yoksun embriyolarda beklenir kolşisin (07-12 yılında oklarla gösterilen) Kolşisin tedavisine yanıt hücreleri yakalamada başarısız bir SAC fonksiyonu düşündürmektedir. Kızı çekirdeğin ayrılması resim 10 başarısız oldu. Alt panel, 14-18 içinde ok uçları Mad2 mutant embriyo kurtarma SAC defekti fenotipi fonksiyonel GFP-Mad2 önermek birikmiş GFP-Mad2 füzyon proteinleri ile tutuklanan çekirdek zarı göstermektedir. 13 Arrowhead geç bir interfaz çekirdeğinde GFP-Mad2 birikimi gösterir. = 5mm Bar. Embriyolar 1 x PBS bir 100mg/ml kolşisin stok solüsyonu ~% 1 yumurta hacmi ile mikroenjeksiyon yapıldı.

<ol>
	<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-4787 (2009).</li><li>Zekanowski, C., Wojda, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy,+chromosomal+missegregation,+and+cell+cycle+reentry+in+Alzheimer's+disease.">Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease.</a> Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-253 (2009).</li><li>Buffin, E., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+a+spindle+checkpoint.">Flies without a spindle checkpoint.</a> Nat. Cell Biol. 9, 565-572 (2007).</li><li>Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Cdc20+by+Bub1+provides+a+catalytic+mechanism+for+APC/C+inhibition+by+the+spindle+checkpoint.">Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint.</a> Mol. Cell. 16, 387-397 (2004).</li><li>Huang, J., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disappearance+of+cyclin+B+at+the+end+of+mitosis+is+regulated+spatially+in+Drosophila+cells.">The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells.</a> EMBO Journal. 18, 2184-2195 (1999).</li><li>Xia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation-specific+binding+of+p31(comet)+antagonizes+the+function+of+Mad2+in+the+spindle+checkpoint.">Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint.</a> Embo. J. 23, 3133-3143 (2004).</li><li>Lorca, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fizzy+is+required+for+activation+of+the+APC/cyclosome+in+Xenopus+egg+extracts.">Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts.</a> Embo. J. 17, 3565-3575 (1998).</li><li>Howell, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+dynein/dynactin+drives+kinetochore+protein+transport+to+the+spindle+poles+and+has+a+role+in+mitotic+spindle+checkpoint+inactivation.">Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation.</a> J. Cell Biol. 155, 1159-1172 (2001).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).</li><li>Li, D., Morley, G., Whitaker, M., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Cdc20+to+the+kinetochore+requires+BubR1+but+not+Mad2+in+Drosophila+melanogaster.">Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster.</a> Mol. Cell Biol. 30, 3384-3395 (2010).</li><li>Karess, R. E., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P+element+mediated+germ+line+transformation+of+Drosophila.">P element mediated germ line transformation of Drosophila.</a> DNA cloning: A practical approach. 2, 121-141 (1985).</li><li>Wakefield, J. G., Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomes+have+a+role+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+early+Drosophila+embryos.">Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos.</a> Current Biology. 10, 1367-1370 (2000).</li><li>Huang, J. Y., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+localisation+of+the+Drosophila+APC/C:+evidence+for+the+existence+of+multiple+complexes+that+perform+distinct+functions+and+are+differentially+localised.">The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised.</a> Journal of Cell Science. 115, 2847-2856 (2002).</li><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> Journal of Cell Biology. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+Techniques+for+Studying+Mitosis+in+the+Drosophila+melanogaster+Syncytial+Embryo.">Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo.</a> J. Vis. Exp. (31), e1382 (2009).</li><li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cell+Shape+Change+in+Living+Drosophila+Embryos.">Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos.</a> J. Vis. Exp. (49), e2503 (2011).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada açıklanan protokol görüntüleme Leica TCS SP2 konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak sinsityal embriyo sinek ve diğer mikroskop sistemleri uygun modifiye edilebilir ve aynı zamanda Drosophila sinsityal embriyoları kullanılarak diğer gen fonksiyonlarını incelemek için adapte edilebilir için genel bir yöntemdir. Biz mili montaj kontrol noktasında, protein dinamiği ve yaşam veya sabit örnekleri 4,6,12-14 protein yerelleştirme görselleştirmek için transgenik sinekleri ya da poliklonal antikorları kullanarak protein proteolizin birçok açıdan incelemek için bu protokolü kullandık. Yumurta - Küçük numaraları (100 ~ 10) alırken taze sinek gıda flakonlarda sinekler tutmak kolay olandır. Bu verme ve diğer yayınlar 15,16 açıklandığı gibi ek elma suyu agar ve yumurta toplama odaları hazırlanması gereksinimini azaltır. Coverslip üzerine yapıştırıcı şeridinin bir ucunda kırık coverslip cam küçük bir kare Ayrıca bu çok daha kolay hale getirirİğne açmak ve iğne 10S yağı daldırma iken mikroenjeksiyon sistemi ayarları ayarlayarak enjeksiyon hacmi belirlenmesi. Embriyonun kuruma derecesi kaçaklarının önlenmesi ve özellikle uzun bir süre gerektiren veya enjeksiyon sonrasında transformantlar kaldırırken bu deneyler için embriyo canlılığı sürdürmek enjeksiyon başarısı için önemlidir. Ancak, kuruma gerekli tam olarak ne kadar süre için bir altın kural yoktur. Bu deneyden deney değişir ve enjekte çözüm ve çalışma ortamının nem miktarına bağlıdır. Ilgi belirli bir proteinin işlevlerini mono-veya poli-klonal antikor yabani tip ya da genetik mutasyon arka altında belirli bir proteinin, mesajcı RNA veya floresan ile işaretlenmiş peptidler karşı, spesifik protein inhibitörleri microinjecting tarafından manipüle edilebilir. Bu mutant hatları veya GFP-etiketli transgenik hatlarının çoğu kamuya av vardırDrosophila stok merkezleri ve bunların çoğundan ailable Flybase (listelenmiştir <a href="http://flybase.org/" target="_blank">http://flybase.org/~~V</a> ) ve online olarak aranabilir.

Temel ekipman ve reaktifler: Konfokal görüntüleme sistemi: Bu protokolün açıklanan görüntüleme sistemi konfokal inverted mikroskop tarama sistemi sayesinde Leica TCS SP2 lazer. Açıklanan yöntemin başka bir görüntüleme sistemleri için bazı küçük değişikliklerle belki de uygundur. Mikroskop Kesme: Biz DF PLAPO 1X-4 lens ile Olympus SZX7 kullanın. İğne çektirmesi: / kahverengi mikropipet çektirmenin (: P-97 Sutter Enstrüman, Model itibaren) Flaming. Mikroenjeksiyon sistem: bir Eppendorf mikroenjeksiyon sistemi tarif edilmektedir fakat herhangi bir diğer uygun sistemi kullanılabilir. Jencons Bilimsel Ltd peristaltik pompa: gıda distribütörü Fly. Reaktifler: <table border="1"><tbody><tr><td> Malzemeler </td><td> Ağırlıks </td><td> Kaynaklar </td><td> Lot No </td></tr><tr><td> Mısırda yemek </td><td> 100.0g </td><td> SUMA, Birleşik Krallık </td><td></td></tr><tr><td> Esmer şeker </td><td> 50.0g </td><td> Billington s, Birleşik Krallık </td><td></td></tr><tr><td> Kuru maya </td><td> 25.0g </td><td> DCL MAYA Ltd Birleşik Krallık </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> 12.5g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 106556 </td></tr><tr><td> Sorbik asit </td><td> 0.4g </td><td> BDH, VWR International Ltd Birleşik Krallık </td><td> 8829310 </td></tr><tr><td> Benzoik asit </td><td> 2.9g </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1019599 </td></tr><tr><td> Nipagin (Metil-4-Hydro xybenzoate) </td><td> 0.9g </td><td> BDH, VWR International Ltd Birleşik Krallık </td><td> K35969015 </td></tr><tr><td colspan="3"> 1L H 2 O kadar </td><td></td></tr></tbody></table><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Tablo 1. gıda maddeleri Fly. Holocarbon 700 ve Sigma satın alınan 27 yağlar. Kuru maya: Thomas Allison, Birleşik Krallık. Heptan tutkal hazırlama:, çift taraflı bant yaklaşık 1.5 metre atın heptan 5ml ile 15 ml Falcon tüp içine koyup 3-5 saat veya gece boyunca döndürün. O zaman 1,5 ml Eppendorf santrifüj tüpleri içinde 4 eşit kısma bölünerek ve herhangi bir enkaz kaldırmak için bir masaüstü santrifüj hızlı bir hızda 5 dakika sonra dönerler. Bir 10 ml ölçülü balonda heptan tutkal çözüm saklayın ve kullanım için saklayınız. Tutkal mukavemeti konsantrasyonu ve kullanılan tutkal miktarlarına göre değişecektir. Normalde, ince tutkal konfokal mikroskop ile taranarak daha az gürültülü arka plan üretir. <ul><li> Coverslip: BDH, VWR International Ltd Birleşik Krallık </li><li> Mikroskop slayt: BDH, VWR International Ltd Birleşik Krallık &lt;/ Li&gt; <li> Silikonlu cam kapilerleri: GC-100-10, Harvard </li><li> Güzel yükleme ipucu: 20μl eppendorf lot: W215818J </li><li> Cımbız </li><li> Güzel kalem fırça </li></ul>

studying mitotic checkpoint by illustrating dynamic kinetochore protein behavior and chromosome motion in living drosophila syncytial embryos

Mili montaj kapısı (SAC) mekanizması kromozomlar düzgün bağlanana kadar anafaz başlangıcını önlemek için kromozom çekirdek zarı ve iğ mikrotübüller arasındaki etkileşimi izler aktif bir sinyali vardır. Hücreler anöploidi veya genomik kararsızlığa ve dolayısıyla kanser ve doğum kusurları ve Alzheimer 1 gibi diğer insan hastalıkları önlemek için bu mekanizmayı kullanın. Gibi Mad1 gibi SAC birçok parça, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Çubuk ve Aurora B kinaz tespit ve 2 tüm kinetochore dinamik proteinlerdir edilmiştir. Kanıt SAC sinyal başlatılan nerede kinetochore olduğunu göstermektedir. SAC ana düzenleyici hedef Cdc20 olduğunu. Cdc20 esansiyel APC / C (A naphase P romoting C omplex veya C yclosome) aktivatörleri 3 biridir ve aynı zamanda bir kinetochore dinamik bir protein olduğu 4-6. Aktive edildiğinde, SAC A aktivitesini inhibePC / C böylece geçiş 7,8 metafaz için metafaz engelleyen iki temel yüzeyler, siklin B ve securin yıkımı önlemek için. SAC sinyal başlatılan ve monte çekirdek zarı ve onun işlevini hala sürüncemede kalır inhibe APC / C üzerine aktarılır tam olarak nasıl. Drosophila son derece uysal deneysel sistemi; çok daha basit ve daha iyi anlaşılmış organizmanın insan ama bir oranla ortak hisse temel süreçler. Erken embriyo eşzamanlı 13 hızlı nükleer bölünmede döngüleri (8-10 dakika geçer gibi, özellikle uzay ve zaman içinde mitotik olayların görüntülenmesi için, belki de, canlı hücreler biyo-görüntüleme çalışmaları için kullanılacak en iyi organizmalardan biri olduğu 25 ° C) her döngü için ve yavaş yavaş sadece korteks 9 altında tek tek tabaka içinde çekirdekleri düzenler. Burada, transgenik Drosophila ekspresyonist kullanarak biyo-görüntüleme yöntemi sunmaksing GFP (Yeşil floresan proteini) veya faiz ve SAC bileşenlerin bazı GFP füzyon proteinleri, Cdc20 ve Mad2 görüntüleri göstererek, sinekler de SAC işlevini incelemek için bir Leica TCS SP2 konfokal lazer tarama mikroskop sistemi onun türevi hedefli proteinler , örnek olarak kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos at JoVE.com

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif edilmektedir<em&gt; Drosophila</em&gt; Leica lazer tarama konfokal sistemi kullanılarak embriyo.

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

studying-mitotic-checkpoint-illustrating-dynamic-kinetochore-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

11.3K Görüntüleme.  University of Newcastle, United Kingdom. SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif edilmektedir Drosophila Leica lazer tarama konfokal sistemi kullanılarak embriyo.

Video: Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Gelişim Biyolojisi

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Biyoloji

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Nörobilim

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler