Los autores desean agradecer a Michael Anderson para establecer en el laboratorio Lee estos métodos aceptados para el estudio de la espermatogénesis con asesoramiento de expertos de Karen Hales. H. Oda y Y. Akiyama-AOD ofrecida generosamente la γ-tubulina-GFP de stock volar. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH R01 a LAL (GM074044).

1. Testículos Disección <ol><li> Anestesie moscas en una botella o frasco con una corriente de CO 2 y la transferencia a una almohadilla de mosca. </li><li> Ordenar moscas bajo un microscopio de disección usando un pequeño pincel, y recoger un número apropiado (dependiendo del experimento) de los machos de Drosophila de los genotipos deseados. Los hombres jóvenes (0-2 días de edad) son ideales para el examen de las células a través de las primeras etapas de la espermatogénesis (por ejemplo espermatogonias, espermatocitos y espermátidas tempranas post-meióticas), mientras que los machos ligeramente mayores (2-5 días de edad) son ideales para el examen de las células en las últimas etapas de la espermatogénesis (en particular, maduran los espermatozoides). </li><li> Use unas pinzas para quitar las alas de cada vuelo (para evitar que las moscas que flotan en el líquido durante la disección). </li><li> Añadir ~ 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (NaCl 130 mM, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4, PBS) en una gota a una disección plato cubierto con silicona porun fondo negro. Otras soluciones acuosas se han utilizado con éxito para la disección testículos 3. </li><li> Punto fórceps hacia la parte anterior de la mosca, agarrarlo por el tórax, y sumergirlo en la gota de PBS. Mientras observa a través del microscopio de disección, utilice otro par de pinzas para agarrar y tirar de los genitales externos (estructura de color marrón oscuro situado en el extremo posterior del abdomen ventral) posteriormente hasta que se separe del abdomen. En la mayoría de los casos, los testículos, las vesículas seminales y las glándulas accesorias serán removidos del abdomen, junto con los órganos genitales externos, si fuera necesario, introduzca un solo par de pinzas en el abdomen y se burlan de los testículos. </li><li> Separe los testículos y las glándulas accesorias genitales externos utilizando dos pares de pinzas en la caída de PBS (Figura 2). Testículos de tipo salvaje se distinguen fácilmente de los tejidos blancos vecinos por su color amarillo. Proceda inmediatamente al paso 2. </li><li> Para aislar los testículos de los machos pharate (i.. E incluido dentro de la caja de pupa), un paso adicional primero se debe realizar que implica la eliminación de la marcha de la caja de pupa; este paso ha sido descrito previamente en otro lugar 31. Proceda con la disección como para los testículos adultos a partir del paso 1.2. </li><li> Para aislar los testículos de los machos de larvas, lleve a cabo una modificación de un protocolo para el aislamiento de ovarios de larvas de Drosophila 32. Brevemente, las larvas macho se puede distinguir de larvas hembra por la presencia de un par de estructuras grandes, claras ovales (testículos de larvas) incrustados en el tercio posterior de la grasa corporal. Para aislar los testículos de larvas, desollar parcialmente abierta la larva macho para aislar los testículos y el cuerpo de grasa que rodea el abdomen como se describe para el aislamiento de ovarios de larvas. Proceder inmediatamente al paso 2 del protocolo descrito en el presente documento; los testículos más tarde pueden ser eliminados del cuerpo grasa justo antes de montar (pasos 2.3 o 3.14) como se describió para los ovarios 32. </li></ol><ol><li> Use un par de pinzas para colocar suavemente 2-3 pares de testículos en una gota de 4-5 ml de PBS en una cubierta de vidrio cuadrado deslizamiento. Tenga en cuenta que puede necesitar la relación del número testículos al volumen de PBS para ajustar: el exceso de líquido evitar que las células se propaguen correctamente cuando aplastado, mientras que demasiado poco líquido hará que las células revienten cuando aplastada. Opcional: Uso cubierta siliconada desliza para minimizar la adherencia de tejido para cubrir deslizamiento en el paso 3.2. </li><li> Use un par de pinzas para rasgar cada testículo en una posición apropiada para maximizar la presencia de los tipos de células de la línea germinal deseadas en la preparación (tenga en cuenta que los contenidos de los testículos en su mayoría será la salida de la región desgarrada sobre el portaobjetos durante el aplastamiento paso.) Para enriquecer espermatogonias y espermatocitos, rasgar el testículo adyacente a su extremo apical (nivel 1, la Figura 2B). Para enriquecer espermatocitos y espermátidas, desgarro abrir los testículos a un position ligeramente basal al nivel 1 (nivel 2, la Figura 2B). Para enriquecer las células germinales más maduras, rasgar los testículos más cerca de donde comienza la curvatura (nivel 3, Figura 2B). </li><li> Con suavidad, coloque un portaobjetos de vidrio sobre la hoja de la cubierta para aplastar los testículos; no presione manualmente como el peso de la hoja de la cubierta es suficiente para obtener una muestra adecuada aplastada. Trate de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Opcional: Uso revestido de poli-L-lisina portaobjetos para promover la adhesión de tejido se deslice en el paso 3.2. </li><li> Utilice la preparación inmediata (idealmente dentro de 15 minutos de preparación) para observar células vivas por microscopía de contraste de fase, porque las moscas transgénicas con expresión de las proteínas marcadas con fluorescencia en los testículos, las células vivas pueden ser examinadas por microscopía de fluorescencia en este paso. Por otra parte, proceder a la fijación y la tinción de anticuerpos (Protocolo n º 3). </li><li> Absorber suavemente el exceso de líquido bajo el cubreobjetos usando una limpieza wipe para permitir que el aplanamiento de la preparación hasta que las células germinales son claramente enfocado. </li></ol> 3. Formaldehído La fijación y la tinción de anticuerpos <ol><li> Snap congelar cada diapositiva que contiene los testículos aplastados (del Protocolo 2) usando un par de pinzas de metal para sumergirlo brevemente en nitrógeno líquido (nitrógeno líquido hasta que se detiene el burbujeo). </li><li> Retire la hoja de la cubierta inmediatamente usando una cuchilla de afeitar. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio preenfriado lleno de etanol al 95% enfriado con hielo (grado espectrofotométrico, exento de metanol). Almacenar a -20 ° C durante 10 min. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas a un estante de portaobjetos de vidrio lleno con 4% de formaldehído en PBS más 0,1% de Triton X-100 (PBS-T). Guarde a temperatura ambiente durante 7 min. </li><li> Utilice pinzas de metal para transferir diapositivas en una parrilla corrediza de vidrio lleno de PBS. Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 1x. Realice todos los lavados descartando la solución en la parrilla corrediza de vidrio ( <em&gt; Ie. vertiendo hacia fuera) y la sustitución con solución fresca. </li><li> Desechar el PBS y sumergir los portaobjetos en PBS-T durante 30 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x. </li><li> El bloqueo de paso (opcional): Sumergir los portaobjetos en PBS más 1% de BSA durante 45 min a temperatura ambiente. </li><li> Use una barrera hidrofóbica lápiz para dibujar un círculo en la diapositiva alrededor del tejido aplastado (fácilmente visible a simple vista) con el fin de limitar las soluciones de anticuerpos (agregado en los pasos 3,9 y 3,11). El tejido debe mantenerse húmedo en todo momento durante la realización de la inmunotinción. </li><li> Añadir 30-40 ml de anticuerpo primario (diluido en PBS-T, 1:400 a 1:50, dependiendo de anticuerpo) en el tejido dentro del círculo. Si se ha realizado el bloqueo, diluir anticuerpo primario en PBS-T más 1% de BSA. El anticuerpo anti-gamma-tubulina (para la tinción de los centrosomas en la Figura 4) se diluyó 1:100. Incubar en una cámara oscura húmeda (por ejemplo. Caja de plástico cerradacon toallas húmedas de papel) durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar los portaobjetos con PBS durante 5 min a temperatura de habitación 3x. Si se realizó el bloqueo, lavar dos veces en PBS-T y una vez en PBS (5 min a temperatura ambiente, cada una). </li><li> Añadir 30-40 ml de anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (diluido 1:400 en PBS) a los tejidos y se incuba en la oscuridad durante 1-2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los portaobjetos en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Repita 2x. </li><li> Añadir 30-40 ml de solución de DAPI (0,2 mg / ml en PBS) para el tejido dentro del círculo. </li><li> Con suavidad, coloque una hoja de cubierta de vidrio sobre el tejido, teniendo cuidado de evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Si deben aparecer burbujas de aire, mueva con cuidado alrededor de la hoja de la cubierta sin destruir la calabaza hasta que las burbujas se escapan de los lados de la hoja de la cubierta. </li><li> Utilice una toallita de limpieza para borrar el exceso de DAPI de los bordes de la diapositiva. </li><li> Sellar el cubreobjetos a la diapositiva utilizando el esmalte de uñas transparente. </li><li> Utilice esta preparacióndentro de los próximos 3 a 4 horas para ver las células immunostained por microscopía fluorescente. Para el almacenamiento a largo plazo de las diapositivas (hasta por lo menos varias semanas), utilice un medio difícil montar a base de glicerol con DAPI, y almacenar a -20 ˚ diapositivas C. </li><li> Alternativamente, fijar muestras en metanol en lugar de formaldehído (dependiendo del antígeno). Después de completar todo el protocolo hasta el paso 3.2, sumerja las diapositivas de los testículos aplastados en metanol durante 10 minutos a -20 º C y continúe con el paso 3.5 en adelante. </li></ol>

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R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li><li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes.">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li><li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis.">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Aunque los testículos de los de tipo salvaje moscas pueden ser fácilmente identificados por su color amarillo (a diferencia de los tejidos blancos vecinos), los testículos de las moscas mutantes blancos son de color blanco y por lo tanto a veces se puede confundir con el intestino. Mayoría de las cepas transgénicas, que son típicamente en un fondo blanco, también tienen testículos blancos porque el gen de mini-blanco que se encuentra en P-elementos no promueve la acumulación ...

Testículos de Drosophila son un sistema modelo ideal para el estudio de muchos procesos biológicos, incluyendo la regulación de células madre, la meiosis, y el desarrollo del esperma 13-18. Los espermatocitos y sus husos meióticos son grandes y por lo tanto, conveniente para el análisis citológico, y los puntos de control del ciclo celular relajado durante la espermatogénesis facilitar el estudio de mutaciones en los genes del ciclo celular. Diferentes tipos de células se pueden observar en la progresión ordenada a lo largo de la longitud de los testículos, y cualquier interrupción de la espermatogénesis pueden conducir a cambios en esta disposición general. Estas características, combinadas con herramientas genéticas Drosophila han facilitado el análisis mutacional de la espermatogénesis 21-23. Las etapas de la espermatogénesis de Drosophila han sido bien definido. Células de la línea germinal que se desarrollan de forma sincrónica dentro de quistes progresan secuencialmente a través de las etapas de la espermatogénesis a lo largo de la longitud de los testículos. Durante boª de la mitosis y divisiones meióticas de las células germinales masculinas, la citocinesis ocurre de forma incompleta de manera que las células hijas permanecen conectadas por puentes citoplásmicos conocidas como canales de anillo (Figura 1). La punta apical del testículo contiene una población de células madre de línea germinal que da lugar a células de espermatogonias, que se someten a cuatro divisiones mitóticas con la citocinesis incompleta para generar quistes 16 de células de espermatocitos primarios. Después de la fase S premeiotic, espermatocitos primarios entran G2, un período de crecimiento prolongado de ~ 90 horas durante el cual aumenta el volumen celular ~ 25 veces. La progresión a través de la meiosis I y la meiosis II resultados en la formación de quistes 32 de células de espermatocitos secundarios y quistes 64 de células de espermátides haploides, respectivamente. Las espermátidas redondas, inmaduros experimentan una amplia remodelación celular para formar espermatozoides maduros. Células post-meióticas, en particular, los haces de alargamiento y espermátidas maduras, ocupan gran parte del volumen de los testículos. Tque el transporte de los espermatozoides éxito funcional a las moscas hembras requiere la coordinación entre las diferentes partes del sistema reproductor masculino, que se compone de varias estructuras apareadas (los testículos, las vesículas seminales y glándulas accesorias) y un único conducto eyaculador (Figura 2). Los espermatozoides se producen en los testículos y se almacenan en las vesículas seminales hasta la cópula 24. Las glándulas accesorias contienen células secretoras que producen el líquido seminal. El esperma de la migración de las vesículas seminales se mezclan con el líquido seminal dentro del conducto eyaculador, que está conectado tanto a las vesículas seminales y las glándulas accesorias. Esta mezcla de espermatozoides y fluido seminal se bombea en última instancia fuera del macho en la vagina de la hembra volar a través de la bombilla de la eyaculación situado en el extremo posterior del macho abdomen 25. Las proteínas en el líquido seminal son esenciales para el almacenamiento prolongado de espermatozoides dentro de los órganos especializados conocidos como espermatecas en el representantetracto roductiva de las hembras de Drosophila 26. Excelente métodos para el aislamiento de los testículos de Drosophila y visualización de células en diversas etapas de la espermatogénesis están disponibles en la literatura científica 3-12. Estamos aquí añadimos a este conjunto de conocimientos mediante la presentación de ejemplos de estos protocolos con una demostración en video que lo acompaña. El protocolo para la preparación de los testículos en vivo muestras para microscopía de contraste de fase se basa en un método descrito previamente 27. El protocolo para la fijación de formaldehído y la inmunotinción de testículos también se basa en un método descrito previamente 28. Los enfoques descritos en el presente documento se han utilizado en muchos estudios de Drosophila espermatogénesis (por ejemplo, para evaluar las funciones de la dineína, un motor de microtúbulos menos de extremo-dirigido, durante la espermatogénesis de Drosophila). Además de los protocolos básicos, se proporcionan sugerencias para varying la disección con el fin de enriquecer las espermatogonias, espermatocitos, o espermatozoide maduro. Diferentes métodos para el procesamiento de los testículos de tal manera que los quistes o bien permanecen intactas o se interrumpen, se describen, según sea necesario. Una ventaja en el uso de testículos de Drosophila como sistema modelo es que, en comparación con los ovocitos y embriones de Drosophila, anticuerpos y colorantes pueden penetrar fácilmente en las células después de su dispersión de los testículos, y se requieren menos etapas de lavado, por lo tanto, los protocolos se pueden realizar en un tiempo relativamente tiempo corto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:351px;">Sylgard</td>
			<td style="width:215px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:127px;">SYLG184</td>
			<td style="width:321px;">Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">PAP pen</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">NC9888126</td>
			<td style="width:321px;">Ted Pella #22309</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Clear nail protector</td>
			<td style="width:215px;">Wet n Wild</td>
			<td style="width:127px;">7780235001</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:215px;">Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6557</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td style="width:215px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-165-003</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">BP151-100</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">AC61511-0040</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Methanol</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">A412-4</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">16% Formaldehyde</td>
			<td style="width:215px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">28908</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:351px;">Sigmacote</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">SL2</td>
			<td style="width:321px;">Use according to manufacturer&#39;s directions to siliconize cover slips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">DAPI</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">D-9542</td>
			<td style="width:321px;">0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:351px;">NaCl</td>
			<td style="width:215px;">Research Products International Corp.</td>
			<td style="width:127px;">S23020</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">S9763</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:215px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">S0751</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes delicate task wipers</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S47299</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:351px;">BSA</td>
			<td style="width:215px;">Research Products International Corp.</td>
			<td style="width:127px;">A30075</td>
			<td style="width:321px;">Molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Glass Coplin staining jar, screw cap</td>
			<td style="width:215px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70315</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Single frosted microscope slides</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2948-75X25</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Poly-L-lysine coated microscope slides</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>22247-1</td>
			<td style="width:321px;">Optional (to replace untreated microscope slides )</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Square cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:127px;">2865-22</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Razor blades</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">12-640</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimax Petri dish</td>
			<td style="width:215px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">S31473</td>
			<td style="width:321px;">Kimble #23060 10015 EMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>52100-51S</td>
			<td>Pattern 5 INOX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Company</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Stemi 2000-CS stereoscope</td>
			<td style="width:215px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Eclipse 80i</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Plan-Fluor 40x objective</td>
			<td style="width:215px;">Nikon</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Axiophot</td>
			<td style="width:215px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Plan-Neofluar Ph2 40x objective</td>
			<td style="width:215px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of drosophila testes

Drosophila melanogaster es un sistema modelo de gran alcance que ha sido ampliamente utilizado para dilucidar una variedad de procesos biológicos. Por ejemplo, los estudios tanto de la mujer y las líneas germinales masculinas de Drosophila han contribuido en gran medida a la comprensión actual de la meiosis, así como la biología de células madre. Excelente protocolos están disponibles en la literatura para el aislamiento y formación de imágenes de los ovarios y los testículos 3-12 de Drosophila. En la presente memoria, los métodos para la disección y preparación de testículos de Drosophila para el análisis microscópico se describen con una demostración de vídeo adjunto. Un protocolo para el aislamiento de los testículos del abdomen de los hombres adultos y preparar diapositivas de tejido vivo para el análisis por microscopía de contraste de fase, así como un protocolo para la fijación y la inmunotinción testículos para el análisis por microscopía de fluorescencia se presentan. Estas técnicas se pueden aplicar en la caracterización de mutantes de Drosophila que exhiben defects en la espermatogénesis, así como en la visualización de localizaciones subcelulares de las proteínas.

Un ejemplo de un par adecuadamente diseccionado de los órganos reproductores masculinos de Drosophila se muestra en la Figura 2A. Testículos retirados desde el abdomen de la mosca macho adulto están típicamente unidos al conducto eyaculador (marrón, Figura 2A &#39;) y un par de glándulas accesorias (verde, Figura 2A&#39;) a través de un par de vesículas seminales (azul, Figura 2A &#39;) . Para separar los testículos de la mayor parte d...

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Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento.

Análisis citológico de espermatogénesis: Los preparativos en directo y fijas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testículos

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

25.9K vistas.  Vanderbilt University Medical Center.  Los métodos para aislar y preparar muestras de Drosophila testículos (en directo y fijo) para obtener imágenes de contraste de fase y microscopía de fluorescencia se describen en este documento. 

Video: Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

El corte delgado de los preparativos de círculo para inmunohistoquímica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Investigación

Biología

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparación Individual Drosophila Huevos Cámaras de Imágenes en directo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Teléfono directo Análisis de Ciclo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos que usan la acústica Attune Centrándose citómetro y Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...