Para las muestras de Arabidopsis y los interesados ​​cebadores de PCR que agradecer al profesor Jaakko Kangasjarvi y su grupo, el Grupo de Estrés Vegetal, Biología Vegetal, Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Helsinki. Los experimentos con el método tradicional se llevaron a cabo por la Sra. Airi Lamminmäki. Muestras de ratones transgénicos fueron proporcionadas por el Dr. Jaana Vesterinen, Instituto de Biomedicina / Bioquímica de la Universidad de Helsinki. Harris Uni-Core y Mat Harris Cutting son marcas comerciales de Shunderson Communications Inc. Todas las demás marcas comerciales son propiedad de Thermo Fisher Scientific Inc. y sus filiales.

1. El genotipado de individuos de plantas de Arabidopsis con Direct Protocol <ol><li> Para comenzar el ensayo de genotipado dCAPS directamente en la hoja de la planta Arabidopsis, primero formular 20 o 50 mu l reacciones de PCR utilizando el Phire Plant Direct Kit de PCR como se describe en la Tabla 1. </li><li> A continuación, corte un golpe de 0,50 mm a partir de una hoja de la planta Arabidopsis mediante el Harris Uni-Core y Mat Harris Cutting. Sosteniendo el pegador con firmeza, presione el borde de corte en el tejido y gire el pegador de ida y vuelta. </li><li> Pulsar el émbolo para expulsar el disco punzón en una mezcla de reacción PCR. Asegúrese de que la muestra cae dentro de la solución de PCR y no se pegue a las paredes del tubo. </li><li> Limpie el borde de corte de la perforadora entre cada muestra para evitar la contaminación cruzada por inmersión en solución al 2% NaClO. Presione el émbolo hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces y limpie la punta con una toalla de papel limpia. La estera de corte también debe estarenjuagarse entre muestras. </li><li> A continuación, emplean un Thermo Scientific Piko 24-así Thermal Cycler y Thermo Scientific Plate Piko PCR para llevar a cabo las reacciones de PCR usando las condiciones de ciclos descritas en la Tabla 2. Las reacciones de PCR también se puede realizar en termocicladores de PCR convencionales. </li><li> Después de la PCR, centrifugar el material vegetal. Transferir 5 l del sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Añadir 4 l de agua y 1 l de enzima de restricción, SspI. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo. Incubar la mezcla de reacción durante una hora a 37 ° C. Inactivar la enzima de restricción por incubación a 65 ° C durante 20 min. </li><li> Cuando amplificando el ADN directamente a partir de tejidos vegetales, los productos de PCR incluyen componentes de la planta y de PCR derivados-que pueden interferir con la enzima de digestión de restricción. Por lo tanto, puede ser necesario diluir o bien (por ejemplo, 1:02 o 1:03 en agua) o purificar el producto de PCR antes de tque la digestión posterior, por ejemplo mediante el uso de un kit comercial adecuado tal como Thermo Scientific kit de purificación de PCR GeneJET. </li><li> Después de la digestión con enzimas de restricción, analizar los fragmentos resultantes en un gel de agarosa. Añadir 2,5 l de 5x tampón de carga a la reacción y realizar la electroforesis en gel de agarosa con 10 l de la mezcla resultante. </li></ol> 2. Amplificar fragmentos específicos de ADN de Oak 15-años de edad, hojas usando el protocolo de dilución <ol><li> Para empezar, cortar un punzón de 2 mm de hoja de roble. </li><li> Coloque la muestra en 20 l de tampón de dilución se suministra con la Planta Phire Kit PCR directa. Limpie el borde de corte de la perforadora y una base como antes. </li><li> Triturar la muestra de hoja con una punta de pipeta 100 l pulsando brevemente contra la pared del tubo. Dependiendo del material de la planta, el protocolo de dilución a veces funciona mejor sin aplastar la muestra. </li><li> Haga girar las muestras brevemente en una microcentrífuga hasta tél reacciones son en el fondo de los tubos. </li><li> El sobrenadante puede ser utilizado directamente en la PCR, o puede ser diluido 1:10 o 1:100 en agua estéril, dependiendo del tipo de muestra. Usar 0,5 l a 1 l del sobrenadante o dilución como una plantilla para una reacción de 20 l de PCR. Preparar la reacción como se describe en la Tabla 1. </li><li> Una vez que las reacciones se preparan, emplear un Thermo Scientific Piko 24-así Thermal Cycler y Thermo Scientific Plate Piko PCR para llevar a cabo las reacciones de PCR usando las condiciones de ciclos descritas en la Tabla 2. Las reacciones de PCR también se puede realizar en termocicladores de PCR convencionales. </li><li> Después de la PCR, añadir 5 l de 5x tampón de carga a la reacción y realizar la electroforesis en gel de agarosa con 15 l de la mezcla resultante. </li></ol> 3. Genotipado de ratones transgénicos utilizando el protocolo de dilución <ol><li> Empezar el protocolo de dilución en ratones transgénicos mediante la colocación de un punzón de 2 mm de la mouse oreja en 20 l de tampón de dilución que contiene 0,5 l de aditivo DNARelease suministrado con el kit de Animal Tissue Phire directo PCR. </li><li> Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 2 min, seguido de una incubación de 2 minutos a 98 ° C. </li><li> Girar las muestras brevemente en una microcentrífuga hasta que las reacciones son en el fondo de los tubos. </li><li> Usar 1 l de sobrenadante como molde para una reacción de 20 l de PCR, preparado como se describe en la Tabla 3. Cualquier sobrenadante que no se va a utilizar de inmediato puede ser transferido a un nuevo tubo y se almacenó a -20 ° C. </li><li> A continuación, emplean un Thermo Scientific Piko 24-así Thermal Cycler y Thermo Scientific Plate Piko PCR para llevar a cabo las reacciones de PCR usando las condiciones de ciclos descritas en la Tabla 4. Una vez más, las reacciones de PCR también se puede realizar en cicladores PCR convencionales. </li><li> Tras la PCR, añadir 5 l de 5x tampón de carga a la reacción y realizar la electroforesis en gel de agarosa with 15 l de la mezcla resultante. </li></ol> 4. Los resultados representativos En la técnica de dCAPS el sitio de restricción en el SNP de interés o bien se introduce o se destruye usando un cebador de PCR con uno o más desajustes en el ADN diana. La genotipificación de los individuos de plantas de Arabidopsis se realizó con la técnica de dCAPS directamente de golpes hoja. Los productos amplificados se digirieron los fragmentos resultantes y revelando el genotipo de cada individuo se analizaron por electroforesis en gel (Figura 2). En este ejemplo, los 160 pb productos PCR que contienen el sitio de SNP de interés (G o alelo A) en el genoma de Arabidopsis fueron amplificados de golpes hoja de la planta con la planta de Phire Kit PCR directa. El cebador directo contenía un error de emparejamiento en el extremo 3 &#39;, la creación de un sitio de restricción SspI-específico en el ADN diana, que incluye el SNP de interés (alelo A), pero noen el otro alelo del SNP (Figura 2B). Protocolos de dilución son necesarias para material vegetal difíciles, como la hoja de roble, debido a su alta concentración de compuestos fenólicos. Usando el protocolo de dilución descrito aquí, el fragmento de 297 pb de ADN cloroplástico se amplificó utilizando el protocolo 3-paso. Especímenes de hoja de roble con diferentes diluciones se muestra en la Figura 3, además de los controles positivos y negativos. El Animal Tissue Phire Direct Kit de PCR se empleó con un protocolo de desafío en el que se utiliza sólo un conjunto de cebadores para la amplificación de dos fragmentos con una diferencia de tamaño grande, resultando en rendimientos abundantes de ambos productos del tamaño correcto de 1.500 pb para ratones transgénicos y 200 pb para los los ratones de tipo salvaje (Figura 4). La banda más débil superior con ratones heterocigotos es debido a la competencia de las dos plantillas (alelos) para el mismo primer par, sin embargo, la genotypción los resultados son ambiguos. La estabilidad de las muestras preparadas usando el protocolo de dilución también fue probado. Los resultados muestran que las muestras de dilución se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos un año. Además, repetidos ciclos descongelación / congelación no afectó significativamente la reacción (Figura 5). También se muestra la amplificación robusta de las muestras de tejido de la oreja de ratón usando la polimerasa de ADN Phire y el método de PCR directo en comparación con arranque en caliente polimerasa Taq y el ADN purificado (Figura 6). <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componentes </td><td fo:width=".75in"> 20 l de reacción </td><td fo:width=".75in"> 50 l de reacción </td><td fo:width=".75in"> Conc. final. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> añadir hasta 20 l </td><td> agregar a 50 l </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Plant PCR Buffer </td><td> 10 l </td><td> 25 l </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Un cebador </td><td> X l </td><td> X l </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> cebador B </td><td> X l </td><td> X l </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA Polymerase </td><td> 0,4 l </td><td> 1 l </td><td></td></tr><tr><td> Muestra / Direct Protocol </td><td></td><td> 0,50 mm ponche </td><td></td></tr><tr><td> Muestra / dilución protocolo </td><td> 0.5-1 l </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1.<html> Las condiciones de reacción para la Planta de PCR utilizado en este protocolo. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Ciclo de Paso </td><td fo:width=".5in"> Temperatura </td><td fo:width=".5in"> Tiempo </td><td fo:width=".4in"> Ciclos </td></tr><tr><td> La desnaturalización inicial </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> La desnaturalización Recocido * Extensión </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Extensión Final </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min mantener </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Ciclismo condiciones para la Planta de PCR utilizado en este protocolo. * La Tm calculadora enoscientific.com / pcrwebtools &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools se recomienda para determinar la Tm de los cebadores que se utilizarán con Phire Hot Start ADN polimerasa II. La temperatura recomendada de recocido para primers ≤ 20 nt es igual a la Tm más baja dada por la herramienta web. Para cebadores&gt; 20 nt, utilizar una temperatura de recocido 3 ° C más alta que la Tm más baja dada por la herramienta web. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componentes </td><td fo:width=".75in"> 20 l de reacción </td><td fo:width=".75in"> Conc. final. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> añadir hasta 20 l </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Animal Tissue PCR Buffer </td><td> 10 l </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Un cebador </td><td> X l </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> cebador B </td><td> X l </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Phira Hot Start II ADN polimerasa </td><td> 0,4 l </td><td></td></tr><tr><td> Muestra / dilución protocolo </td><td> 1 l </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Las condiciones de reacción para la PCR tejido animal utilizado en este protocolo. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Ciclo de Paso </td><td fo:width=".5in"> Temperatura </td><td fo:width=".5in"> Tiempo </td><td fo:width=".4in"> Ciclos </td></tr><tr><td> La desnaturalización inicial </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> La desnaturalización Recocido * Extensión </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Extensión Final </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min Mantener </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Ciclismo condiciones para la PCR de tejidos animales utilizados en este protocolo. * La calculadora Tm en <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> se recomienda cuando la determinación de la Tm de los cebadores para ser utilizados con Phire Hot Start ADN polimerasa II. La temperatura recomendada de recocido para cebadores ≤ 20 nt es igual a la menor Tm propuesta por la herramienta web. Para cebadores&gt; 20 nt, utilizar una temperatura de recocido 3 ° C mayor que la Tm más baja dada por la herramienta web. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. PCR directa de flujo de trabajo. Directo PCR se puede realizar utilizando dos protocolos alternativos. En el protocolo directa de una pequeña cantidad de muestra se añade directamente a la PCR reacción. El protocolo de dilución emplea una breve preincubación antes de la etapa de PCR para liberar el ADN de la muestra de material. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. El genotipado de individuos de plantas de Arabidopsis con la técnica dCAPS directamente de golpes hoja. A) La Figura 2A muestra el principio del ensayo realizado dCAPS. El sitio de restricción en el SNP de interés está bien introducido o eliminado por PCR utilizando un cebador con uno o más desajustes en el ADN diana. Los productos de PCR se digieren y los fragmentos resultantes revelan el genotipo de cada individuo cuando se analizó por electroforesis. B) 0,50 mm punzones de hojas de las plantas se colocaron directamente en 50 mu l reacciones de PCR. Los 160 bp productos de PCR que contiene el sitio SNP (G o alelo A) se amplificaron con los cebadores introduciendo un único sitio SspI para el alelo A-. Los productos de PCR fueron purificados digestiónTed con enzima de restricción SspI. Fragmentos resultantes se analizaron en un gel de agarosa al 3%. Carril M es el marcador de tamaño; carriles A y G corresponden a los alelos de SNP de cada muestra. Los resultados obtenidos fueron confirmados por análisis convencional de extracción de ADN seguido de PCR y digestión de restricción (datos no mostrados). Las reacciones de control negativo sin ADN molde se incluyeron en la prueba de configurar y ejecutar en un gel de agarosa separado en paralelo con las reacciones reales de PCR antes de realizar las digestiones (datos no mostrados). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Figura 3. Protocolo de dilución utilizando muestras de hoja de roble. El protocolo de dilución se utilizó para amplificar el fragmento de 297 pb de ADN cloroplástico en muestras de hoja de roble (3-paso protocolo, hibridación a 62 ° C) a diferentes diluciones (1:100, 1:10, 1 : 1 y 2:1) y con positivo y negativocontroles [C +: control positivo de ADN purificado (Arabidopsis), C-: control negativo sin ADN plantilla]. La nomenclatura de la muestra representa el punto de recogida de la muestra (las ciudades en Finlandia) y la muestra de numeración. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Genotipado de los ratones transgénicos con par de cebadores uno utilizando el protocolo de dilución. Tejidos del oído de nueve ratones individuales (carriles 1-9) se colocaron en 20 l de tampón de dilución incluyendo Aditivo DNARelease. Después de las incubaciones a temperatura ambiente y 98 ° C, 1 l de sobrenadante se utilizó como plantilla en la reacción de 20 l de PCR. Tamaños de los fragmentos: 1.500 pb (transgénicos) y 200 pb (tipo salvaje). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Muestras preparadas de acuerdo con el protocolo de dilución son estables durante el almacenamiento a largo plazo. Las muestras de los tejidos del oído de ratón fueron inc<html> ubated en 20 l de tampón de dilución incluyendo Aditivo DNARelease y se sometieron a congelación repetida / descongelación (carril 1), almacenados a -20 ° C durante un año (carril 2), o se utiliza inmediatamente para la PCR (carril 3). Los tamaños de los fragmentos amplificados fueron 900 pb, 1.500 pb y 3.200. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="La figura 6" /> Figura 6. Phire Animal Tissue Kit de PCR directo supera a un sistema de purificación de ADN comercial combinado con una polimerasa de ADN Taq de arranque en caliente. Cuatro amplicones (0.5-1.5 kb) se amplificaron a partir de los tejidos del oído de ratón utilizando el protocolo de dilución de Animal Phire Tissue Kit PCR directa. Para la comparación, el ADN se purificó primero utilizando un kit de extracción de ADN comercial y los mismos fragmentos se amplificaron usando un arranque en caliente, la ADN polimerasa Taq de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Sólo con la Phire Animal Tissue PCR Kit Direct fueron amplificados con éxito los cuatro amplificados. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Comparación universal del flujo de trabajo con la estimación de tiempos / reactivos consumidos. Thermo Scientific directo enfoque de PCR se compara con el enfoque de aislamiento de ADN, el enfoque de tampón de extracción, y el enfoque de tampón de PCR. El tiempo estimado para cada método antes de la etapa de PCR se muestra en rojo. El Thermo Scientific enfoque directo PCR tarda sólo 0-4 minutos para la preparación de muestras antes de la PCR. Debajo de cada método, los reactivos consumidos se enumeran. El Thermo Scientific enfoque directo PCR utiliza la menor cantidad de reactivos en comparación con los otros métodos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> .

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La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Thermo Fisher Scientific, Inc.

El enfoque directo PCR demostró aquí permite la amplificación PCR directamente a partir de pequeñas cantidades de muestras no purificadas, reduciendo el tiempo necesario y simplificar el flujo de trabajo para la planta y el genotipo de animales (Figura 7). También se ha demostrado aquí es el uso del protocolo de dilución en combinación con el enfoque directo de PCR (Figura 3). El protocolo de dilución se recomienda con muestras difíciles (por ejemplo, hojas de plantas de edad, especies de plantas que contienen compuestos de interferencia) o largos (con o ricos en GC) amplicones. Este protocolo es particularmente útil cuando se inicia un nuevo experimento PCR directa, lo que permite la optimización de la reacción. El protocolo puede servir como una herramienta para abordar las dificultades ocasionales, tales como bajos rendimientos del producto debido a diferencias en el material tejido y / o iniciadores utilizados. Además, cuando se ejecuta múltiples reacciones de la misma muestra, el uso del protocolo de dilución garantiza toda la muestra no se consume en un soloreacción. Con el fin de purificar el ADN de las plantas de la PCR, la convención fue realizar la lisis celular, seguido por el aislamiento de ADN utilizando diversos componentes que potencialmente podrían interferir con el análisis de PCR 8. En particular, las plantas desafiante con alto contenido de compuestos fenólicos, además de polivinilpirrolidona se ha utilizado tradicionalmente para eliminar los compuestos que se unen al ADN tras la lisis celular 2,5. Como es evidente aquí, estos complicados, intensivas en tiempo pasos se pueden evitar mediante el uso de la Phire Plant Direct Kit de PCR para detectar el ADN diana. La lisis celular y los pasos de aislamiento de ADN se puede omitir utilizando las técnicas dCAPS sensibles directamente a partir de hojas de plantas de Arabidopsis (Figura 2). Como se demuestra aquí, el protocolo de dilución administra de manera eficaz la presencia de componentes problemáticos que pueden interferir con PCR (Figura 3). Tradicionalmente, un requisito previo para la determinación del genotipo de animales era isolatien el ADN genómico a partir de tejido animal a través de un tóxico, proceso que consume tiempo caracterizado por una incubación prolongada con proteinasa K para digerir el tejido conectivo y la piel, seguido por extracción con disolvente orgánico, precipitación con alcohol, y las etapas de centrifugación 6,9,10. Como se ha demostrado aquí, la simplificación de este proceso se logra a través del uso de la Phire Animal Tissue Kit de PCR directo, permitiendo que los ratones transgénicos para determinar el genotipo de ADN sin purificación previa (Figura 4). En el ejemplo mostrado en este artículo es particularmente difícil ya que sólo un conjunto de cebadores se utilizó para la amplificación de dos fragmentos con una diferencia de tamaño grande. A pesar de dificultad innata del protocolo, el uso del enfoque de PCR directo en conjunción con el protocolo simple dilución dio lugar a altos rendimientos de los dos productos de PCR (Figura 4). PCR basado en la detección de ADN de destino tiene muchas aplicaciones en la investigación, incluyendo el análisis del genotipo para identificarlas funciones de los genes en el desarrollo, la fisiología y la enfermedad. Debido a la tolerancia inhibidor de las polimerasas de DNA especializados, los protocolos se puede completar en un tiempo mínimo sin purificación de ADN antes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Phire Plant Direct PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 reacciones (50 l cada uno) </td></tr><tr><td> Phire Animal Tissue PCR Kit Direct </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 l cada uno) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,35 mm (rosa) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Cantidad: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,50 mm (azul) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Cantidad: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Cutting Mat 6,4 x 7,6 cm </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Cantidad: 5 </td></tr><tr><td> SspI </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 l (100 reacciones) </td></tr><tr><td> Piko 24-Bueno Thermal Cycler </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Bueno Piko placas PCR </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Purificación Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

El enfoque de PCR directo facilita la amplificación por PCR directamente a partir de pequeñas cantidades de muestras no purificadas y se demuestra aquí por varias plantas y tejidos animales (Figura 1). PCR directa se basa en el diseño especial Phusion Thermo Scientific y polimerasas Phire de ADN, que incluyen un dominio de ADN de doble hebra de unión que les da características únicas, tales como una alta tolerancia de los inhibidores. PCR basado en la detección de ADN diana tiene numerosas aplicaciones en la investigación de plantas, incluyendo análisis de plantas genotipo y la verificación de los transgenes. PCR de tejidos de la planta tradicionalmente implica una etapa inicial de aislamiento de ADN, que puede requerir reactivos caros o tóxicos. El proceso requiere mucho tiempo y aumenta el riesgo de contaminación cruzada 1, 2. A la inversa, mediante el uso de Thermo Scientific Phire Plant Direct Kit de PCR del ADN diana se puede detectar fácilmente, sin extracción previa de ADN. En el modelo se demuestra aquí, unaejemplo de derivado troceados análisis de secuencia polimórfica amplificada (dCAPS) 3,4 se realiza directamente a partir de hojas de plantas de Arabidopsis. dCAPS ensayos de genotipificación se puede utilizar para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) por SNP específico de alelo digestión con endonucleasa de restricción 3. Algunas muestras de plantas tienden a ser más difícil cuando se utilizan métodos de PCR directos, ya que contienen componentes que interfieren con la PCR, tales como compuestos fenólicos. En estos casos, una etapa adicional para eliminar los compuestos se requerido tradicionalmente 2,5. Aquí, este problema se supera mediante el uso de un protocolo de dilución rápida y fácil seguido por amplificación por PCR directa (Figura 1). Quince años de edad, las hojas del roble se utilizan como modelo para las plantas desafiantes como la muestra contiene altas cantidades de compuestos fenólicos incluyendo taninos. La transferencia de genes en ratones se utiliza ampliamente para estudiar las funciones de los genes en desallo, la fisiología y la enfermedad humana. El uso de estos animales requiere la detección de la presencia del transgén, por lo general con PCR. Tradicionalmente, esto implica una pérdida de tiempo etapa de aislamiento de ADN, durante la cual el ADN para el análisis de PCR se purificó a partir de los tejidos del oído, la cola o del pie 6,7. Sin embargo, con el Thermo Scientific Phire tejido animal directos ratones transgénicos Kit de PCR se puede genotipo sin purificación previa del ADN. En este protocolo de ratón transgénico genotipificación se consigue directamente de los tejidos del oído de ratón, como se demuestra aquí para un ejemplo desafiante donde solamente se utiliza un conjunto de cebadores para la amplificación de dos fragmentos diferentes mucho en tamaño.

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Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification | Biology | Video

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

El enfoque directo de PCR que aquí se presenta facilita la amplificación por PCR directamente a partir de pequeñas cantidades de planta no purificado y el tejido animal.

El genotipado de muestras de plantas y animales, sin previa purificación del ADN

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

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Video: Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

Purificación simplificada de ADN plásmido de las Culturas procariotas

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Una basada en PCR genotipificación método para distinguir entre las variedades de tipo silvestre y ornamental de Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

La purificación de todo el genoma de ADN circular Extracromosómica a partir de células eucariotas

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Híbrido-Cut: un método de seccionamiento mejorada para muestras de tejido de la planta recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Escaneado de Protocolos de Microscopía Electrónica (SEM) para la Problemática de la planta, Oomycete, y muestras de hongos

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...