シロイヌナズナサンプルと関係するPCRプライマーのために私達は教授試しプレーKangasjärviと彼のグループは、植物ストレス群、植物生物学、バイオサイエンス学科、ヘルシンキ大学に感謝します。伝統的な手法を用いた実験は、夫人あいりLamminmäkiによって実施された。 トランスジェニックマウスのサンプルが博士Jaana Vesterinen、生物医学/生化学研究所、ヘルシンキ大学から提供された。 ハリスユニコアとハリス·カッティングマットShundersonコミュニケーションズ株式会社の商標です。その他すべての商標は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社およびその子会社の商標です。

1。直接プロトコルを持つシロイヌナズナ植物個体のジェノタイピング<ol><li> シロイヌナズナ植物の葉の上に直接dCAPSジェノタイピングアッセイを開始するには、まず、 表1に示すようにPHIREプラントダイレクトPCRキットを用いて、20または50μlのPCR反応を定式化する。 </li><li>次に、ハリスユニコアとハリス·カッティングマットを使用して、 シロイヌナズナ植物の葉から0.50 mmのパンチをカット。しっかりとパンチャーを持って、組織の中に最先端を押すと前後にパンチャーを回転させます。 </li><li> PCR反応混合物にパンチ、ディスクを取り出すにプランジャを押してください。サンプルはPCR溶液に落下し、管壁に付着しないことを確認します。 </li><li> 2パーセント次亜塩素酸ナトリウム溶液中に浸漬して、クロスコンタミネーションを防止するために、各サンプル間のパンチャーの最先端を清掃してください。プランジ​​ャーを押して、上下に数回、清潔なペーパータオルで刃先を拭いてください。カッティングマットもあるべきサンプル間でリンスした。 </li><li>次に、 表2に記載のサイクリング条件を用いてPCR反応を実行するためのサーモサイエンティフィックピコピコ24ウェルサーマルサイクラーとサーモサイエンティフィックピコピコPCRプレートを採用しています。 PCR反応は、従来のPCRサーマルサイクラーで行うことができます。 </li><li> PCR後、植物材料をスピンダウンします。新しいマイクロチューブに上清5μlを移す。水4μlを、制限酵素、SSPIを1μl加え。穏やかに混合し、チューブの底に内容物を収集するために簡単にスピンダウンします。 37℃で1時間反応混合物をインキュベート℃に20分間65℃でインキュベートすることにより、制限酵素を不活性化する。 </li><li>植物組織から直接DNAを増幅する場合、PCR産物を制限酵素消化酵素を妨げる可能性があり、植物やPCR由来成分が含まれています。したがって、それはどちらの希釈（ 例えば 1:2または水で1:3）またはtの前にPCR産物を精製する必要があるかもしれません彼はそのようなサーモサイエンティフィックGeneJET PCR精製キットのような適当な市販のキットを用いて、例えば、その後の消化。 </li><li>制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動で得られた断片を分析します。反応液に5倍のローディングバッファー2.5μlを添加し、得られた混合物の10μlをアガロースゲル電気泳動を行う。 </li></ol> 2。 15歳のオークから特異的なDNA断片を増幅するには、希釈プロトコルを使用して葉<ol><li>開始するには、オークの葉の2mmのパンチをカット。 </li><li> PHIRE工場ダイレクトPCRキットに付属の希釈緩衝液20μlにサンプルを置きます。パンチャーの最先端をきれいにし、前のようにマットをカット。 </li><li>管の壁に簡単にそれを押すことによって、100μlのピペットの先端で葉のサンプルをつぶす。植物材料に応じて、希釈プロトコルは、時々サンプルを破砕せずにうまく動作します。 </li><li> tまで微量で簡単にサンプルをスピン彼の反応は、チューブの底にあります。 </li><li>上清をPCRに直接使用することができ、またサンプルの種類に応じて、滅菌水で1:10または1:100に希釈することができる。 20μlのPCR反応の鋳型として清または希釈液の1μlに0.5μlを使用する。 表1に記載したように反応を準備します。 </li><li>一度反応が用意されており、 表2に記載のサイクリング条件を用いてPCR反応を実行するためにサーモサイエンティフィックピコピコ24ウェルサーマルサイクラーとサーモサイエンティフィックピコピコPCRプレートを採用しています。 PCR反応は、従来のPCRサーマルサイクラーで行うことができます。 </li><li> PCR後、反応液に5倍のローディングバッファーを5μlを加え、得られた混合物の15μlをアガロースゲル電気泳動を行う。 </li></ol> 3。希釈プロトコルを使用してトランスジェニックマウスのジェノタイピング<ol><li> mの2 mmのパンチを配置することによって、トランスジェニックマウスで希釈プロトコルを開始PHIRE動物組織ダイレクトPCRキットに付属DNARelease添加剤の0.5μlを含む希釈バッファー20μlにウーズの耳。 </li><li> 98℃2分のインキュベーションに続いて2分、℃の室温でサンプルをインキュベートする</li><li>反応はチューブの底になるまで遠心で簡単にサンプルをスピン。 </li><li> 表3に記載のように調製し、20μlのPCR反応の鋳型として清1μlを使用する。すぐに使用されるためにされていない任意の上清を新しいチューブに移し、-20℃で保存することができます</li><li>次に、 表4に記載のサイクリング条件を用いてPCR反応を実行するためのサーモサイエンティフィックピコピコ24ウェルサーマルサイクラーとサーモサイエンティフィックピコピコPCRプレートを採用しています。繰り返しになりますが、PCR反応は、従来のPCRサーマルサイクラーで行うことができます。 </li><li> PCR後、反応液に5倍のローディングバッファー5μlを追加し、アガロースゲル電気泳動ワットを行う得られた混合物のi番目の15μlの。 </li></ol> 4。代表的な結果 dCAPS技術では目的のSNP内の制限部位はどちら標的DNAに1つまたはそれ以上のミスマッチを有するPCRプライマーを用いて導入するか、または破棄されます。 シロイヌナズナ植物個体の遺伝子型を直接葉のパンチからdCAPS技法を用いて行った。増幅産物を消化し ​​、各個体の遺伝子型を明らかに得られた断片をゲル電気泳動（ 図2）により分析した。 この例では、 シロイヌナズナゲノム中に目的のSNP部位（Gまたは対立遺伝子）を含む160bpのPCR産物がPHIRE工場ダイレクトPCRキットを用いた植物の葉のパンチから増幅した。フォワードプライマーは、目的のSNP（対立）ではなく、が含まれていた標的DNA中SspIで固有の制限部位を、作成、3 &#39;末端に1つのミスマッチを含んでいたSNPの他の対立遺伝子（ 図2B）インチ希釈プロトコルは、フェノール性化合物のその高い濃度のためにそのようなオークの葉のような挑戦的な植物材料、のために必要である。ここで説明する希釈プロトコルを使用して、葉緑体DNAの297塩基対の断片は、3ステップのプロトコルを用いて増幅した。様々な希釈とオークの葉の標本は、正と負の制御に加えて、 図3に示されています。 PHIRE動物組織ダイレクトPCRキットは、トランスジェニックマウス、1,500 bpおよび200 bpのための正しいサイズの製品の両方の豊かな収率で得られた、唯一つのプライマーセットが大きいサイズの差を持つ2つのフラグメントの増幅のために使用した挑戦的なプロトコルで採用された野生型マウス（ 図4）。ヘテロ接合体マウスを用いた弱い上部のバンドは、同じプライマーペアの両方のテンプレート（対立遺伝子）の競争のためであるが、genotypる結果は明白です。 希釈プロトコルを使用して調製したサンプルの安定性もテストされています。結果は希釈サンプルは、少なくとも1年間は-20℃で保存することができることを示している。さらに、繰り返し凍結/融解サイクルが大幅に反応します （ 図5）には影響しなかった。また、ホットスタートTaqポリメラーゼおよび精製されたDNA（ 図6）に比べPHIRE DNAポリメラーゼおよびダイレクトPCR法を用いたマウス耳組織サンプルからの堅牢な増幅が示されている。 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> コンポーネント </td><td fo:width=".75in"> 20μlの反応 </td><td fo:width=".75in"> 50μlの反応 </td><td fo:width=".75in"> 最終濃度。 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 20μlに追加</td><td> 5に追加0μlの</td><td></td></tr><tr><td> 2倍PHIRE植物のPCRバッファー</td><td> 10μlの</td><td> 25μlの</td><td> 1X </td></tr><tr><td>プライマー</td><td> μlのX </td><td> μlのX </td><td> 0.5μMで</td></tr><tr><td>プライマーB </td><td> μlのX </td><td> μlのX </td><td> 0.5μMで</td></tr><tr><td> PHIREホットスタートII DNAポリメラーゼ</td><td> 0.4μL </td><td> 1μlの</td><td></td></tr><tr><td>サンプル/ダイレクトプロトコル</td><td></td><td> 0.50ミリメートルパンチ</td><td></td></tr><tr><td>サンプル/希釈プロトコル</td><td> 0.5から1μL </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表1。<html>植物のPCRの反応条件は、このプロトコルで使用される。 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> サイクルステップ </td><td fo:width=".5in"> Tempです。 </td><td fo:width=".5in"> 時間 </td><td fo:width=".4in"> サイクル </td></tr><tr><td>初期変性</td><td> 98℃ </td><td> 5分</td><td> 1 </td></tr><tr><td>変性 *をアニーリング 延長</td><td> 98℃ X℃で 72℃ </td><td> 5秒 5秒 20秒</td><td> 40 </td></tr><tr><td>最後の伸長</td><td> 72℃ 4℃ </td><td> 1分 ホールド</td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 表2植物のPCR用のサイクリング条件は、このプロトコルで使用される。 * Tmは電卓でoscientific.com / pcrwebtools &quot;ターゲット=&quot; PHIREホットスタートII DNAポリメラーゼで使用するプライマーのTmを決定する際には、_blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtoolsが推奨されます。プライマーの推奨アニール温度が≤20 NTに等しいWebツールによって与えられる低いTmはプライマー&gt; 20 NTの場合は、アニーリング温度を使用して3°Webツールによって与えられる低いTmよりC高い。 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> コンポーネント </td><td fo:width=".75in"> 20μlの反応 </td><td fo:width=".75in"> 最終濃度。 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 20μlに追加</td><td></td></tr><tr><td> 2倍PHIRE動物組織PCRバッファー</td><td> 10μlの</td><td> 1X </td></tr><tr><td>プライマー</td><td> μlのX </td><td> 0.5μMで</td></tr><tr><td>プライマーB </td><td> μlのX </td><td> 0.5μMで</td></tr><tr><td>ペーハー怒りホットスタートII DNAポリメラーゼ</td><td> 0.4μL </td><td></td></tr><tr><td>サンプル/希釈プロトコル</td><td> 1μlの</td><td></td></tr></tbody></table> 表3動物の組織PCRの反応条件は、このプロトコルで使用される。 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> サイクルステップ </td><td fo:width=".5in"> Tempです。 </td><td fo:width=".5in"> 時間 </td><td fo:width=".4in"> サイクル </td></tr><tr><td>初期変性</td><td> 98℃ </td><td> 5分</td><td> 1 </td></tr><tr><td>変性 *をアニーリング 延長 </td><td> 98℃ X℃で 72℃ </td><td> 5秒 5秒 20秒≤1キロバイト 20秒/ KB&gt; 1キロバイト</td><td> 40 </td></tr><tr><td>最後の伸長</td><td>72℃ 4℃ </td><td> 1分 ホールド</td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 表4は、このプロトコルで使用される動物の組織PCRのサイクル条件。 で* Tmは電卓<a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtoolsは</a> PHIREホットスタートDNAポリメラーゼIIで使用するプライマーのTmを決定する際に推奨されます。プライマー≤20 ntのための推奨アニーリング温度はWebツールによって与えられる低いTmに等しい。プライマー&gt; 20 NTの場合は、下のTmよりも℃高いWebツールによって与えアニール温度3を使用します。 <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。ダイレクトPCRワークフロー。ダイレクトPCRは2代替のプロトコルを使用して実行できます。直接のプロトコルでは、試料の少量をPCに直接追加されますRの反応。希釈プロトコルは、試料物質からDNAを放出するためのPCRの前に簡単なプレインキュベーション工程を採用しています。 <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。直接リーフパンチからdCAPS技術とシロイヌナズナ植物個体の遺伝子型別。 A）は、図2Aは、実行dCAPSアッセイの原理を示す。目的のSNP内の制限部位はどちら導入または標的DNAへの1つまたはそれ以上のミスマッチを持つプライマーを用いたPCRによって除去される。 PCR産物を消化し ​​、電気泳動で分析したときに得られた断片は、それぞれの個体の遺伝子型を明らかにする。B）は 、植物の葉から0.50 mmのパンチは50μlのPCR反応に直接置かれている。 SNP部位（Gまたは対立遺伝子）を含む160bpのPCR産物がアレルにユニークなSSPIの部位を導入するプライマーを用いて増幅した。未精製のPCR産物はdigesだったSSPIの制限酵素でテッド。得られた断片を3％アガロースゲル上で分析した。レーンMはサイズマーカーで、レーンがあり、G各サンプルのSNP対立遺伝子に対応しています。得られた結果は、PCRや制限酵素処理（データは示していない）が続いてDNA抽出の従来の分析によって確認した。テンプレートDNAなしのネガティブコントロール反応を消化した（データは示していない）を実行する前に、テストの設定と実際のPCR反応と並行して別々のアガロースゲル上で実行に含まれていた。 <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> 図3。希釈プロトコルはオークの葉のサンプルを使用した。希釈プロトコルが（1:100、1:10、1異なる希釈でオークの葉のサンプル（3ステップのプロトコル、62℃でアニール）の葉緑体DNAの297塩基対の断片を増幅するために使用されました：1と2:1）と、正と負の詐欺trols [C + +：C：いいえ、鋳型DNAとネガティブコントロール精製DNA（ シロイヌナズナ ）からポジティブコントロール]。サンプルの命名法は、試料捕集サイト（フィンランドの町）と番号のサンプルを表しています。 <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。希釈プロトコルを使用して1つのプライマー対を持つトランスジェニックマウスの遺伝子型別。9個々のマウス（レーン1-9）の耳の組織はDNARelease添加剤を含む希釈緩衝液20μlに入れた。室温および98℃でインキュベーションした後、上清1μlを20μlのPCR反応の鋳型として用いた。フラグメントサイズ：1500 BP（トランスジェニック）および200bp（野生型）。 <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。サンプルは、希釈プロトコルに従って調製長期保存のために安定している。マウス耳組織のサンプルはincあっ<html> DNARelease添加剤を含む希釈バッファー20μlにubated、繰り返し凍結/解凍（レーン1）にかけ、1年間（レーン2）、​​-20℃で保存し、またはPCR（レーン3）のために直ちに使用。増幅断片のサイズは900bpの、1500 bpと3200 bpであった。 <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="図6" /> 図6。 PHIRE動物組織ダイレクトPCR KitはホットスタートTaq DNAポリメラーゼと結合し、市販のDNA精製システムよりも優れています。四リコン（0.5-1.5 KBは）PHIRE動物組織ダイレクトPCRキットの希釈プロトコルを使用して、マウスの耳組織から増幅した。比較のために、DNAは最初、市販のDNA抽出キットを用いて、同一のフラグメントは、製造業者の推奨に従ってホットスタートTaq DNAポリメラーゼを用いて増幅した精製した。のみPHIRE動物組織ダイレクトPCRキットで正常に増幅4つのすべてのアンプリコンがあった。 トン &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="図7" /> 図7。回/消費試薬の推定を伴うワークフローのユニバーサル比較。サーモサイエンティフィックダイレクトPCR法は、DNA単離アプローチ、抽出バッファーのアプローチ、およびPCRバッファアプローチと比較されます。 PCRの前工程へのそれぞれのアプローチのための推定時間が赤文字で表示されています。サーモサイエンティフィックダイレクトPCR法は、PCRの前に試料調製のための唯一の0から4分かかります。各メソッドの下に、消費された試薬が記載されています。サーモサイエンティフィックダイレクトPCR法は他の方法と比較して試薬の最小量を使用しています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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ここで示したダイレクトPCR法は、必要な時間を短縮し、未精製サンプルの少量から直接PCR増幅を可能にし、植物や動物のジェノタイピング（ 図7）のワークフローを簡素化します。また、ここで示したダイレクトPCR法（ 図3）との組み合わせで希釈プロトコルを使用することである。希釈プロトコルが困難なサンプル（ 例えば高齢者の植物の葉は、干渉化合物を含有する植物種）または長い（またはGCリッチ）アンプリコンとをお勧めします。新しいダイレクトPCR実験を開始するときに、このプロトコルは、反応の最適化を可能にする、特に便利です。プロトコルは、このような組織材料および/または使用したプライマーの違いに起因する低い生成物の収率として時折困難に対処するためのツールと​​して機能することができます。また、同じサンプルから複数の反応を実行するとき、希釈プロトコルの使用はサンプル全体が一つに消費されないことを保証し反応。 PCRのための植物からDNAを精製するためには、規則は潜在的にPCR解析8に干渉する可能性があるさまざまなコンポーネントを使用して、DNA単離に続く細胞溶解を行うことでした。高フェノール含量、ポリビニルピロリドンを加えて特に難しい植物のため、伝統的に細胞溶解2,5続くDNAに結合する化合物を除去するために使用されていました。ここで明らかなように、これらの複雑な、時間のかかるステップは標的DNAを検出するためにPHIRE工場ダイレクトPCRキットを使用することによって回避することができます。細胞溶解とDNA分離ステップが直接シロイヌナズナ植物の葉（ 図2）から、敏感dCAPS技術を使用して省略することができます。ここに示したように、希釈プロトコルは効果的にPCR法（ 図3）に干渉することが問題の成分の存在を管理します。 伝統的に、動物タイピングするための前提条件であったisolati有機溶媒抽出、アルコール沈殿、遠心ステップ6,9,10続く皮膚や結合組織を消化するプロテイナーゼKとの長いインキュベーションによって特徴付け毒性、時間のかかるプロセスを通じて、動物組織からのゲノムDNAの上に。ここで示したように、このプロセスの簡素化は、トランスジェニックマウスは、従来のDNA精製（ 図4）を使用せずに遺伝子型を特定することができるように、PHIRE動物組織ダイレクトPCRキットの使用によって達成される。唯一つのプライマーセットが大きいサイズの差を持つ2つの断片の増幅のために使用されたとして、この記事で紹介例は特に困難である。プロトコルの生得の難しさにもかかわらず、単純な希釈プロトコルの組み合わせは直接PCR法の使用は、2つのPCR産物（ 図4）の高収率が得られた。 PCRベースの標的DNAの検出は、識別するために、遺伝子型解析を含め、研究に多くのアプリケーションを持っている開発、生理学と疾患における遺伝子の役割。特殊なDNAポリメラーゼの阻害剤の許容範囲により、プロトコルが前にDNAを精製することなく、最小限の時間で完了することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td>会社</td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> PHIREプラントダイレクトPCRキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> F-130 </td><td> 200反応液（50μlずつ） </td></tr><tr><td> PHIRE動物組織ダイレクトPCRキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> F-140 </td><td> 200 reations（50μLずつ） </td></tr><tr><td>ハリスユニコア0.35ミリメートル（ピンク） </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> F-180S / L </td><td>数量：5月25日</td></tr><tr><td>ハリスユニコア0.50ミリメートル（青） </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> F-185S / L </td><td>数量：5月25日</td></tr><tr><td>ハリスカッティングマット6.4×7.6センチメートル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> F-190 </td><td>数量：5 </td></tr><tr><td> SspIで</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> ER0771 </td><td> 100μL（100回分） </td></tr><tr><td>ピコピコ24ウェルサーマルサイクラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェルPCRプレートピコピコ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR 精製キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> K0701 K0702 </td><td> 50プレップ 250プレップ</td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

ダイレクトPCR法は、未精製サンプルの少量から直接PCR増幅を容易にし、いくつかの植物や動物の組織（ 図1）のためにここに例示されている。ダイレクトPCRは、彼らにこのような阻害剤の耐性が高いなどのユニークな特性を与える二本鎖DNA結合ドメインを含む特別に設計されたサーモサイエンティフィックPhusionとPHIRE DNAポリメラーゼ、に基づいています。 PCRベースの標的DNAの検出は、導入遺伝子の植物の遺伝子型解析と検証を含む、植物研究の多数のアプリケーションを持っています。植物組織からPCR法は、伝統的に高価なまたは有毒な試薬を必要とするかもしれない最初のDNA単離工程を伴う。プロセスは時間がかかり、クロスコンタミネーション1,2のリスクを増大させる。逆に、サーモサイエンティフィックPHIREプラントダイレクトPCRキットを用いて、標的DNAは簡単に前にDNAを抽出することなく検出することができる。モデルでは、ここに示さ派生切断増幅多型配列を解析した例（dCAPS）3,4は、 シロイヌナズナ植物の葉から直接実行されます。 dCAPSジェノタイピングアッセイは、SNP対立遺伝子特異的な制限エンドヌクレアーゼ消化によって3個の一塩基多型（SNP）を同定するために用いることができる。 いくつかの植物試料は、彼らがそのようなフェノール化合物としてPCRを妨害する成分を含んでいるため直接PCR法を用いている場合にはより挑戦的になる傾向があります。これらのケースでは、化合物を除去するために追加の手順が伝統的に2,5を必要とされる。ここでは、この問題は直接PCR増幅（ 図1）に続いて迅速かつ簡単に希釈プロトコルを使用することによって克服される。標本はタンニンを含むフェノール化合物を大量に含んでいるため十五歳のオークの葉は厳しい植物のモデルとして使用されています。 マウスへの遺伝子導入は大まかdeveloの遺伝子の役割を研究するために使用されpment、生理学や人間の病気。これらの動物の使用は、通常のPCRで、導入遺伝子の存在をスクリーニングする必要があります。伝統的に、これはPCR解析用DNAは耳、尾やつま先組織6,7から精製されている間の時間がかかるのDNA単離工程を伴う。しかし、サーモサイエンティフィックPHIRE動物組織ダイレクトPCRキットトランスジェニックマウスとの事前のDNA精製せずに遺伝子型を決定することができます。唯一つのプライマーセットはサイズが大きく異なる2つのフラグメントの増幅のために使用されている挑戦的な例については、ここを実証されるように、このプロトコルトランスジェニックマウスのジェノタイピングでは、マウスの耳組織から直接得られる。

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事前の DNA 精製を行わない植物および動物サンプルのジェノタイピング |生物学 |ビデオ

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

ここで紹介するダイレクトPCR法は、未精製の植物および動物組織の少量から直接PCR増幅を容易にします。

前のDNA精製せずに植物や動物のサンプルの遺伝子型

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

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31.0K ビュー.  Thermo Fisher Scientific. ここで紹介するダイレクトPCR法は、未精製の植物および動物組織の少量から直接PCR増幅を容易にします。

ビデオ: Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

原核生物培養液からプラスミドDNAの合理化精製

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

の野生型と観賞用品種を区別するPCRベースのジェノタイピング法チガヤ</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的RNAを単離(英語)

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...