Arabidopsis 샘플 및 관련 PCR의 프리 머 위해 우리는 교수 Jaakko Kangasjärvi와 그의 그룹, 식물 스트레스 그룹 식물 생물학, Biosciences학과, 헬싱키 대학 감사드립니다. 기존의 방법의 실험은 부인의 Airi Lamminmäki에 의해 실시되었다. 유전자 변형 마우스 샘플은 박사 Jaana Vesterinen, 생물 의약 / 생화학 연구소, 헬싱키 대학에서 제공되었습니다. 해리스 유니 코어 및 해리스 절단 매트는 기타 모든 상표는 열 피셔 과학 주식회사와 그 자회사의 자산입니다 Shunderson 통신 주식회사의 등록 상표입니다.

1. 직접 프로토콜과 Arabidopsis 식물 개인의 Genotyping <ol><li> Arabidopsis 식물 잎에 직접 dCAPS의 genotyping 분석을 시작하려면 먼저 표 1에 설명되어있는 Phire 공장 직접 PCR 키트를 사용하여 20 또는 50 μl PCR 반응을 수립. </li><li> 다음, 해리스 유니 코어 및 해리스 절단 매트를 사용하여 Arabidopsis 식물 잎에서 0.50 mm 펀치를 잘라. 단단히 주먹 개최하는 것은 조직에 첨단을 눌러 앞뒤로 구멍을 뚫는를 회전 할 수 있습니다. </li><li> PCR 반응 혼합물에 펀치 디스크를 추출하는 플런저를 누르십시오. 샘플 PCR 솔루션으로 떨어지고 튜브 벽에 남아 있지 않은지 확인하십시오. </li><li> 2퍼센트 NaClO 솔루션에를 찍어하여 교차 오염을 방지하기 위해 각 샘플 사이의 구멍을 뚫는의 최첨단를 청소합니다. 플런저를 눌러 아래로 몇 번하고 깨끗한 종이 타월로 최첨단을 닦으십시오. 절단 매트도 있어야합니다샘플 사이에 헹구어. </li><li> 다음, 열 과학을 채용 Piko 자전거 타는 사람 및 열 과학 Piko PCR 플레이트는 표 2에 설명 된 자전거 조건을 사용하여 PCR 반응을 수행 할 24도 열. PCR 반응은 기존의 PCR 열 cyclers에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> PCR 후, 식물 재료를 스핀 다운. 새로운 microcentrifuge 관에 표면에 뜨는 5 μl를 전송합니다. 물 4 μl 및 제한 효소, SSPI 1 μl를 추가합니다. 부드럽게 섞어서 튜브의 바닥에 내용을 수집하기 위해 간략하게 스핀 다운. 37 한 시간 동안 반응 혼합물을 품어 ° C. 20 분에 65 ° C에서 잠복기에 의해 제한 효소를 비활성화. </li><li> 식물 조직에서 직접 D​​NA를 증폭 할 때 PCR 제품은 제한 소화 효소를 방해 할 수 있습니다 식물과 PCR-파생 구성 요소가 포함되어 있습니다. 따라서 어느 희석 (예 : 1시 2분 또는 물에 1시 3분) 또는 t 전에 PCR 제품을 정화 할 필요가있을 수 있습니다그는 이러한 열 과학 GeneJET PCR 정화 키트로 적합한 상용 키트를 사용하여 예를 들어 다음 소화. </li><li> 제한 효소는 소화 후, 아가로 오스 젤에 대한 결과 조각을 분석 할 수 있습니다. 반응에 5 배를로드하는 버퍼의 2.5 μl를 추가하고 그 결과 혼합물의 10 μl와 아가로 오스 겔 전기 영동을 수행합니다. </li></ol> 2. 15 세의 오크에서 특정 DNA 조각을 증폭하는 것은 희석 프로토콜을 사용하여 잎 <ol><li> 시작하려면, 오크 잎의 2mm 펀치를 잘라. </li><li> Phire 공장 직접 PCR 키트와 함께 제공된 희석 버퍼 20 μl로 샘플을 놓습니다. 주먹의 첨단을 청소하고 이전처럼 매트를 절단. </li><li> 튜브 벽을 짧게 눌러 100 μl 피펫 팁과 잎 샘플을 크러시. 식물 재료에 따라 희석 프로토콜은 때때로 샘플을 분쇄하지 않고 더 나은 작동합니다. </li><li> t까지 microcentrifuge에 간단히 샘플을 스핀그는 반응 튜브의 하단에 있습니다. </li><li> 표면에 뜨는는 PCR에서 직접 사용할 수 있습니다, 또는 그것은 샘플 종류에 따라 멸균 물에 1시 10분 또는 1:100을 희석 할 수 있습니다. 20 μl PCR 반응을위한 템플릿으로 표면에 뜨는 또는 희석 1 μl에 0.5 μl를 사용합니다. 표 1에 설명 된대로 반응을 준비합니다. </li><li> 반응이 준비되면, 열 과학을 채용 Piko 자전거 타는 사람 및 열 과학 Piko PCR 플레이트는 표 2에 설명 된 자전거 조건을 사용하여 PCR 반응을 수행 할 24도 열. PCR 반응은 기존의 PCR 열 cyclers에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> PCR 후, 반응에 5 배를로드하는 버퍼의 5 μl를 추가하고 결과 혼합물의 15 μl와 아가로 오스 겔 전기 영동을 수행합니다. </li></ol> 3. 희석 프로토콜을 사용하여 트렌스 제닉 마우스의 Genotyping <ol><li> m의 2mm 펀치를 삽입하여 형질 전환 생쥐에 희석 프로토콜을 시작Phire 동물 조직 직접 PCR 키트와 함께 제공된 DNARelease 첨가제의 0.5 μl를 포함하는 희석 버퍼 20 μl의 ouse 귀. </li><li> 98시 2 분 부화에 이어 2 분, ° C.에 대한 샘플을 상온를 품다 </li><li> 반응 튜브의 바닥에까지 microcentrifuge에 간단히 샘플을 봐. </li><li> 표 3에 설명 된대로 준비 20 μl PCR 반응을위한 템플릿으로 표면에 뜨는 1 μl를 사용하십시오. 바로 사용 할 수 없습니다 모든 표면에 뜨는는 새로운 튜브로 이동하고 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> 다음, 열 과학 Piko 24도 열 자전거 타는 사람 및 열 과학 Piko PCR 플레이트는 표 4에 설명되어있는 자전거 조건을 사용하여 PCR 반응을 수행 할 수 사용합니다. 다시 PCR 반응은 기존의 PCR의 cyclers에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> PCR 후, 반응에 5 배를로드하는 버퍼의 5 μl를 추가하고 아가로 오스 겔 전기 영동 w를 수행결과 혼합물의 i 번째 15 μl. </li></ol> 4. 대표 결과 dCAPS 기술에 대한 관심이 SNP 내에서 제한 사이트 중 도입하거나 대상 DNA에 하나 이상의 불일치와 PCR 프라이머를 사용하여 파괴된다. Arabidopsis 식물 개인의 Genotyping 직접 잎 주먹에서 dCAPS 기법으로 수행되었다. 증폭 제품은 소화 된 각 개인의 유전자형을 드러내는 결과 조각은 (그림 2) 겔 전기 영동에 의해 분석 하였다. 이 예에서 Arabidopsis 게놈에 대한 관심의 SNP 사이트 (G 또는 A allele)를 포함하는 160 BP PCR 제품은 Phire 공장 직접 PCR 키트와 함께 식물 잎 주먹에서 증폭되었다. 앞으로 입문서는 관심 SNP (A allele)하지만 포함 대상 DNA의 SSPI 별 제한 사이트를 제작, 3 &#39;끝 부분에 하나 불일치를 포함SNP (그림 2B)의 다른 allele 인치 희석 프로토콜은 페놀 화합물의 높은 농도로 인해 같은 참나무 잎으로 도전 식물 재료, 필​​요합니다. 희석 프로토콜을 사용하면 여기에 설명 chloroplastic DNA의 297 BP 조각은 3 단계 프로토콜을 사용하여 증폭되었다. 다른 dilutions와 오크 잎 표본은 긍정적이고 부정적인 컨트롤에 추가, 그림 3에 표시됩니다. Phire 동물 조직 직접 PCR 키트는 용 유전자 변형 마우스의 1500 BP 200 BP의 두 제대로 크기의 제품의 풍부한 생산량의 결과로 하나의 프라이머 세트는 대형의 차이에 두 조각 증폭에 사용 된 도전 프로토콜과 고용 된 야생 형 생쥐 (그림 4). heterozygote 마우스와 약자 상단 밴드 같은 프라이머 쌍 모두에 템플릿 (대립 유전자)의 경쟁 때문입니다하지만, genotypING 결과가 모호합니다. 희석 프로토콜을 사용하여 준비 샘플의 안정성도 테스트되었습니다. 결과는 희석 샘플은 최소한 1 년에 -20 ° C에서 저장 될 수 있습니다 보여줍니다. 또한, 반복 동결 / 해동주기는 크게 반응 (그림 5)에 영향을주지 않았다. 또한 Phire의 DNA 중합 효소와 따뜻한 시작 DNA 형성 촉매의 중합 효소 및 정화 DNA (그림 6)에 비해 직접 PCR 방법을 사용하여 마우스 귀 조직 샘플에서 강력한 증폭이되어 표시. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> 구성 요소들 </td><td fo:width=".75in"> 20 μl 반응 </td><td fo:width=".75in"> 50 μl 반응 </td><td fo:width=".75in"> 최종 Conc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 20 μl에 추가 </td><td> 5 추가0 μl </td><td></td></tr><tr><td> 배 Phire 공장 PCR 버퍼 </td><td> 10 μl </td><td> 25 μl </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 프라이머 </td><td> X μl </td><td> X μl </td><td> 0.5 μM </td></tr><tr><td> 프라이머 B </td><td> X μl </td><td> X μl </td><td> 0.5 μM </td></tr><tr><td> Phire 핫 스타트 II의 DNA 중합 효소 </td><td> 0.4 μl </td><td> 1 μl </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 / 직접 프로토콜 </td><td></td><td> 0.50 mm 펀치 </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 / 희석 프로토콜 </td><td> 0.5-1 μl </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 1.<html> 공장 PCR을위한 반응 조건은이 프로토콜에 사용됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> 사이클 단계 </td><td fo:width=".5in"> 온도. </td><td fo:width=".5in"> 시간 </td><td fo:width=".4in"> 사이클 </td></tr><tr><td> 초기 변성 </td><td> 98 ° C </td><td> 5 분 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturing * 어닐링 확장 </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 초 5 초 20 초 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> 최종 확장 </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 분 보유 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 표 2. 공장 PCR을위한 사이클링 조건이 프로토콜에 사용됩니다. 에 * TM 계산기oscientific.com / pcrwebtools &quot;대상 =&quot;Phire 온천 시작 II의 DNA 중합 효소와 함께 사용되는 프리 머에 대한 TM을 결정할 때 _blank는 &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools을 권장합니다. 프리 머에 대한 권장 소둔 온도가 ≤ 20 NT와 동일합니다 WebTool을 제공 한 낮은 TM는. 프리 머&gt; 20 NT를 들어, 어닐링 온도 3을 사용 ° C WebTool을 제공 한 낮은 TM보다.주세요 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> 구성 요소들 </td><td fo:width=".75in"> 20 μl 반응 </td><td fo:width=".75in"> 최종 Conc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 20 μl에 추가 </td><td></td></tr><tr><td> 배 Phire 동물 조직 PCR 버퍼 </td><td> 10 μl </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 프라이머 </td><td> X μl </td><td> 0.5 μM </td></tr><tr><td> 프라이머 B </td><td> X μl </td><td> 0.5 μM </td></tr><tr><td> PH분노 핫 스타트 II의 DNA 중합 효소 </td><td> 0.4 μl </td><td></td></tr><tr><td> 샘플 / 희석 프로토콜 </td><td> 1 μl </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 동물 조직 PCR을위한 반응 조건은이 프로토콜에 사용됩니다. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> 사이클 단계 </td><td fo:width=".5in"> 온도. </td><td fo:width=".5in"> 시간 </td><td fo:width=".4in"> 사이클 </td></tr><tr><td> 초기 변성 </td><td> 98 ° C </td><td> 5 분 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturing * 어닐링 확장 </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 초 5 초 20 초 ≤ 1킬로바이트 20 초 / 킬로바이트&gt; 1킬로바이트 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> 최종 확장 </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 분 보유 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 표 4.이 프로토콜에 사용되는 동물 조직 PCR을위한 사이클링 조건. *에서 TM 계산기 <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools는</a> Phire 온천 시작 II의 DNA 중합 효소와 함께 사용되는 프리 머에 대한 TM을 결정할 때 권장합니다. 프리 머 ≤ 20 NT 용 권장 어닐링 온도는 WebTool을 제공 한 낮은 TM 동일합니다. 프리 머&gt; 20 NT를 들어, 어닐링 온도 3을 사용 ° C WebTool을 제공 한 낮은 TM보다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 직접 PCR 워크 플로우. 직접 PCR은 두 다른 프로토콜을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 직접 프로토콜에서 샘플의 작은 금액은 PC에 직접 추가됩니다R 반응. 희석 프로토콜 샘플 자료에서 DNA를 출시 할 PCR 전에 간단한 사전 부화 단계를 고용합니다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 잎 펀치에서 직접 dCAPS 기술과 Arabidopsis 식물 개인의 Genotyping. A) 그림 2A는 dCAPS 분석의 원칙이 수행 보여줍니다. 관심 SNP 내에서 제한 사이트 중 도입하거나 대상 DNA에 하나 이상의 불일치와 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제거됩니다. PCR 제품은 소화와 전기 영동하여 분석 할 때 발생하는 파편은 각 개인의 유전자형을 알 수있다. B) 식물의 잎에서 0.50 mm의 주먹 50 μl PCR 반응에 직접 배치 된 수 있습니다. SNP 사이트 (G 또는 A allele)를 포함 160 BP PCR 제품은 프리 머의 A-allele에 고유 한 SSPI 사이트를 소개로 증폭되었다. unpurified PCR 제품은 diges했다SSPI 제한 효소와 테드. 결과 조각은 3 % 아가로 오스 젤에 분석 하였다. 레인은 M은 크기 표시입니다, 레인은 A와 G 각 샘플의 SNP의 대립 유전자에 해당합니다. 얻은 결과는 PCR과 제한 소화 (데이터 미도시)에 의해 다음 DNA 추출의 통상적 인 분석을 통해 확인되었다. 템플릿 DNA가없는 대조군 반응이 설정 테스트에 포함되어 있으며 digestions을 (데이터가 게재되지 않음) 수행하기 전에 실제 PCR 반응과 병렬로 별도의 아가로 오스 젤에서 실행되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="그림 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> 그림 3. 희석 프로토콜은 참나무 잎 샘플을 사용합니다. 희석 프로토콜 (1:100, 1시 10분, 1 다른 dilutions에 오크 잎 샘플 (3 단계 프로토콜, 62 ° C에서 어닐링)에서 chloroplastic DNA의 297 BP 조각을 증폭하는 데 사용 된 : 1 2:1)와 긍정적이고 부정적인 사기꾼trols [C + : C-: 아니요 템플릿 DNA와 대조군 정화 DNA (Arabidopsis)에서 긍정적 인 제어]. 샘플 명칭은 샘플 수집 사이트 (핀란드 마을)와 번호 샘플을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 희석 프로토콜을 사용하여 하나 프라이머 쌍의 유전자 변형 생쥐의 Genotyping. 구 개별 마우스 (차선 1-9)의 귀 조직은 DNARelease 첨가제 등의 희석 버퍼 20 μl에 배치되었다. 상온에서 incubations 후 및 98 ° C, 표면에 뜨는 1 μl를 20 μl PCR 반응의 템플릿으로 사용되었다. 조각 크기 : 1,500 BP (유전자 변형) 200 BP (wildtype). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 샘플 장기 저장을 위해 안정적입니다. 마우스 귀 조직의 샘플은 주식회사 있었다 희석 프로토콜에 따라 준비<html> DNARelease 첨가제 등의 희석 버퍼 20 μl에 ubated 반복 냉동 / 해동 (레인 1) 대상이 1 년 (차선 2) -20 ° C에서 저장 또는 PCR (레인 3)에 즉시 사용됩니다. 증폭 조각 크기는 900 BP, 1500 BP와 3,200 BP했다. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="그림 6" /> 6 그림. Phire 동물 조직 직접 PCR 키트는 뜨거운 시작 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소와 결합 된 상업 DNA 정화 시스템을 능가하는 성능을. 네 amplicons (0.5-1.5 킬로바이트)가 Phire 동물 조직 직접 PCR 키트의 희석 프로토콜을 사용하여 마우스 귀 조직에서 증폭되었다. 비교를 들어, DNA가 먼저 상용 DNA 추출 키트를 사용하고 같은 조각 제조업체의 권장 사항에 따라 뜨거운 시작 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를 사용 증폭되었습니다 정화되었습니다. 만 Phire 동물 조직 직접 PCR 키트와 함께 성공적으로 증폭 네 가지 amplicons였다. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. 회 / 소비 시약.의 추정과 워크 플로우의 보편적 인 비교 열 과학 직접 PCR 접근 방식은 DNA 절연 방식, 추출 버퍼 접근 방법, 그리고 PCR 버퍼 방식과 비교됩니다. 전에 PCR 단계 각 접근 방식에 대한 추정 시간은 빨간색 텍스트로 표시됩니다. 열 과학 직접 PCR의 접근 방식은 PCR하기 전에 샘플 준비 만 0-4 분 정도 소요됩니다. 각 방법 아래 소비 시약가 나열됩니다. 열 과학 직접 PCR의 접근 방법은 다른 방법에 비해 시약의 최소 금액을 사용합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

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여기를 입증 직접 PCR의 접근 방법은 시간이 필요한 줄이고 식물과 동물의 genotyping (그림 7)의 워크 플로우를 간소화 직접 unpurified 샘플 소량의 PCR 증폭 할 수 있습니다. 또한 여기에 증명하면 직접 PCR 방식 (그림 3)와 함께 희석 프로토콜의 사용이다. 희석 프로토콜은 어려운 샘플 (화합물을 방해 포함 된 예를 들면 노인 식물 잎, 식물 종) 또는 긴 (또는 GC 풍부한) amplicons으로 권장합니다. 반응의 최적화를 허용하는 직접 PCR 실험을 시작할 때이 프로토콜은 특히 유용합니다. 프로토콜은 조직 물질 및 / 또는 사용 프리 머의 차이로 인해 낮은 제품 수율로 가끔씩 문제를 해결하기위한 도구로 제공 할 수 있습니다. 희석 프로토콜은 전체 샘플은 하나에서 소비되지 않은 보장에 또한, 동일한 샘플에서 여러 반응을 실행할 때 사용반응. PCR을위한 식물에서 DNA를 정화하기 위해 대회는 잠재적으로 PCR 분석 8 영향을 줄 수 있습니다 다양한 구성 요소를 사용하여 DNA 절연 다음 세포 용해를 수행하는 것이 었습니다. 높은 페놀 콘텐츠, polyvinylpyrrolidone의 추가로, 특히 도전 식물 전통적으로 세포 용해 2,5에 따라 DNA에 바인딩 화합물을 제거하는 데 사용되었다. 분명 여기, 이러한 복잡하고, 시간이 많이 단계는 대상 DNA를 감지 할 수있는 Phire 공장 직접 PCR Kit의 사용을 통해 방지 할 수 있습니다. 세포 용해와 DNA의 분리 단계는 직접 Arabidopsis 식물 잎 (그림 2)에서 민감한 dCAPS 기술을 사용하여 생략 할 수 있습니다. 여기에 시연으로, 희석 프로토콜은 효율적으로 PCR (그림 3)를 방해 할 수 있습니다 문제가 구성 요소의 존재를 관리합니다. 전통적으로, 동물 genotyping에 대한 전제 조건은 isolati했습니다유기 용매 추출, 알코올 강수량, 그리고 원심 분리 단계 6,9,10 다음 피부와 결합 조직을 소화 할 수 proteinase K와 긴 부화 특징으로 독성, 시간이 소요되는 과정을 통해 동물의 조직에서 게놈 DNA의 있습니다. 여기를 시연,이 과정의 단순화는 유전자 변형 마우스는 이전에 DNA 정화 (그림 4)없이 genotyped 할 수 있도록, Phire 동물 조직 직접 PCR Kit의 ​​사용을 통해 달성된다. 이 문서에서 보여준 예는 특히 하나의 프라이머 세트는 대형의 차이에 두 조각 증폭에 사용 된로 도전하고 있습니다. 프로토콜의 본래 어려움에도 불구하고, 간단한 희석 프로토콜은 두 PCR 제품 (그림 4)의 높은 수율의 결과와 함께 직접 PCR 방식 중 하나를 사용하십시오. PCR 기반 대상 DNA 검출 식별 할 수 유전자형 분석 등의 연구에 많은 응용 프로그램이 있습니다개발, 생리학과 질병의 유전자의 역할. 전문의 DNA polymerases의 억제제 허용으로 인해, 프로토콜은 이전 DNA 정화없이 최소한의 시간에 완료 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Phire 공장 직접 PCR 키트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-130 </td><td> 200 반응 (50 μl 각) </td></tr><tr><td> Phire 동물 조직 직접 PCR 키트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 μl 각) </td></tr><tr><td> 해리스 유니 코어 0.35 mm (핑크) </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-180S / L </td><td> 수량 : 25분의 5 </td></tr><tr><td> 해리스 유니 코어 0.50 mm (파란색) </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-185S / L </td><td> 수량 : 25분의 5 </td></tr><tr><td> 해리스는 매트 6.4 × 7.6 cm를 절단 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> F-190 </td><td> 수량 : 5 </td></tr><tr><td> SSPI </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> ER0771 </td><td> 100 μl (100 반응) </td></tr><tr><td> Piko 24 자 열 자전거 타는 사람 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24 자 Piko PCR 플레이트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR 정화 키트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 최상의 상태로 준비합니다 250 최상의 상태로 준비합니다 </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 샘플의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게하고, 여러 식물과 동물의 조직 (그림 1)은 여기를 증명하고 있습니다. 직접 PCR은 그들에게 이러한 억제제의 높은 내성 등의 고유 속성을 제공하는 이중 좌초 된 DNA 결합 도메인을 포함 특별히 설계 열 과학 Phusion 및 Phire의 DNA Polymerases에 따라 달라집니다. PCR 기반 대상 DNA 검출은 공장 유전자형 분석 및 transgenes의 인증 등의 식물 연구에 많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 식물 조직에서 PCR은 전통적으로 고가 또는 독성 시약을 필요로 할 수 있습니다 초기 DNA 절연 단계를 포함한다. 이 과정은 많은 시간이 소요됩니다 및 교차 오염 1, 2의 위험을 증가시킵니다. 반대로, 열 과학 Phire 공장 직접 PCR 키트를 사용하여 대상 DNA 쉽게 전에 DNA 추출없이 검색 할 수 있습니다. 모델에서 여기 시연파생 흘리고 증폭 다형성 서열 분석 (dCAPS) 3,4의 예제는 Arabidopsis 식물 잎에서 직접 수행됩니다. dCAPS genotyping의 assays는 SNP allele 특정 제한 endonuclease의 소화 3 단일 염기 polymorphisms (SNPs)를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 일부 식물 샘플은 이러한 페놀 화합물 등의 PCR 방해 요소를 포함로 직접 PCR 방법을 사용하는 경우 더 많은 도전이 될 경향이 있습니다. 이러한 경우에는 화합물을 제거 할 추가 단계는 전통적으로 2,5 필요합니다. 여기,이 문제는 직접 PCR 증폭 (그림 1) 다음 빠르고 쉽게 희석 프로토콜을 사용하여 극복 할 수 있습니다. 표본이 tannins 등의 페놀 화합물의 높은 양의가 포함되어 열 다섯 살 참나무 잎은 어려운 식물의 모델로 사용됩니다. 마우스에 유전자 송금이 크게 develo의 유전자의 역할을 연구하는 데 사용됩니다pment, 생리학 및 인간 질병. 이 동물의 사용은 일반적으로 PCR과 함께 transgene의 존재에 대한 검사가 필요합니다. 전통적으로,이 귀, 꼬리 나 발가락 조직 6,7에서 정화되어 PCR 분석을위한 DNA되는 동안 시간이 소요 DNA 절연 단계를 포함한다. 그러나, 열 과학 Phire 동물의 조직 직접 PCR 키트 유전자 변형 마우스로 전에 DNA 정화없이 genotyped 할 수 있습니다. 이 프로토콜 유전자 변형 마우스 genotyping에서와 같이 하나의 프라이머 세트의 크기는 크게 서로 다른 두 조각의 증폭에 사용되는 도전 예를 들어 여기 시연, 마우스 귀 조직에서 직접 이루어집니다.

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Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

여기에 제시된 직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 식물과 동물 조직의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게한다.

이전 DNA의 정제없이 식물과 동물 샘플의 Genotyping

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

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31.0K 조회수.  Thermo Fisher Scientific. 여기에 제시된 직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 식물과 동물 조직의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게한다.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

Prokaryotic 문화 플라스미드 DNA의 유선형 정화

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

의 야생 - 타입과 장식 품종을 구별하기 PCR 기반 Genotyping 방법 Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

진핵 세포에서 염색체 외 원형 DNA의 게놈 차원의 정화

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.