Pour les échantillons d&#39;Arabidopsis et les amorces de PCR concernés, nous remercions le professeur Jaakko Kangasjärvi et son groupe, le Groupe stress des plantes, biologie végétale, Département des sciences biologiques, Université de Helsinki. Les expériences avec la méthode traditionnelle ont été réalisés par Mme Airi Lamminmäki. Échantillons de souris transgéniques ont été fournies par le Dr Jaana Vesterinen, Institut de biomédecine / Biochimie, Université d&#39;Helsinki. Harris Uni-Core et Tapis de découpe Harris sont des marques de Shunderson Communications Inc Toutes les autres marques sont la propriété de Thermo Fisher Scientific Inc et de ses filiales.

1. Le génotypage des individus plante Arabidopsis avec le protocole Direct <ol><li> Pour commencer le test de génotypage dCAPS directement sur ​​la feuille de la plante Arabidopsis, tout d&#39;abord formuler des 20 ou 50 pi de réactions de PCR utilisant l&#39;Phire usine direct kit PCR comme décrit dans le tableau 1. </li><li> Ensuite, découpez un coup de poing de 0,50 mm à partir d&#39;une feuille de la plante Arabidopsis en utilisant le Harris Uni-Core et Tapis de découpe Harris. Tenir fermement le perforateur, appuyez sur le bord de coupe dans le tissu et faire tourner le poinçon d&#39;avant en arrière. </li><li> Appuyer sur le piston pour éjecter le disque coup de poing dans un mélange réactionnel de PCR. Assurez-vous que l&#39;échantillon tombe dans la solution de PCR et ne colle pas aux parois du tube. </li><li> Nettoyez la pointe du poinçon entre chaque échantillon pour éviter la contamination croisée en le plongeant dans une solution de NaClO 2%. Appuyez sur le piston vers le haut et vers le bas à quelques reprises et essuyer le bord de coupe avec une serviette en papier propre. Le tapis de découpe doit également êtrerincées entre les échantillons. </li><li> Ensuite, utiliser un Thermo Scientific Piko de 24 puits et Thermocycleur PCR Thermo Scientific Piko Plaque pour effectuer les réactions de PCR utilisant les conditions décrites à vélo dans le tableau 2. Les réactions de PCR peut également être effectuée dans conventionnels thermocycleurs PCR. </li><li> Après PCR, le ralentissement de la matière végétale. Transférer 5 pl du surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 4 pi d&#39;eau et 1 ul d&#39;enzyme de restriction, Sspl. Mélanger doucement et centrifuger brièvement pour recueillir contenu dans le fond du tube. Incuber le mélange réactionnel pendant une heure à 37 ° C. Inactiver l&#39;enzyme de restriction par une incubation à 65 ° C pendant 20 min. </li><li> Lors de l&#39;amplification d&#39;ADN directement à partir de tissus végétaux, les produits de PCR comprennent des composants végétaux et PCR dérivé qui peuvent interférer avec l&#39;enzyme de digestion de restriction. Par conséquent, il peut être nécessaire de diluer ce soit (par exemple 1:2 ou 1:3 dans l&#39;eau) ou de purifier le produit de PCR avant til digestion ultérieure, par exemple en utilisant un kit commercial approprié tel que Thermo Scientific GeneJET kit de purification PCR. </li><li> Après digestion par des enzymes de restriction, analyse des fragments résultants sur un gel d&#39;agarose. Ajouter 2,5 ul de tampon de chargement 5x à la réaction et une électrophorèse sur gel d&#39;agarose avec 10 ul du mélange résultant. </li></ol> 2. Amplifier des fragments d&#39;ADN spécifiques de chêne de 15 ans Feuilles en utilisant le protocole de dilution <ol><li> Pour commencer, couper un poinçon 2 mm de feuille de chêne. </li><li> Placer l&#39;échantillon dans 20 ul de tampon de dilution fourni avec la centrale Phire direct Kit PCR. Nettoyez la pointe du poinçon et tapis de découpe comme avant. </li><li> Écraser la feuille d&#39;échantillon avec une pointe de pipette 100 ul en appuyant brièvement contre la paroi du tube. En fonction de la matière végétale, le protocole de dilution fonctionne parfois mieux sans écraser l&#39;échantillon. </li><li> Faites tourner les échantillons brièvement dans une microcentrifugeuse jusqu&#39;à til ya des réactions dans le fond de tubes. </li><li> Le surnageant peut être utilisé directement dans la PCR, ou il peut être dilué 1:10 ou 1:100 dans de l&#39;eau stérile en fonction du type d&#39;échantillon. Utiliser 0,5 à 1 ul ul du surnageant ou de dilution comme modèle pour un 20 réactif PCR. Préparer la réaction comme décrit dans le tableau 1. </li><li> Une fois que les réactions sont préparés, employer un Thermo Scientific Piko de 24 puits et Thermocycleur PCR Thermo Scientific Piko Plaque pour effectuer les réactions de PCR utilisant les conditions décrites à vélo dans le tableau 2. Les réactions de PCR peut également être effectuée dans conventionnels thermocycleurs PCR. </li><li> Après PCR, ajouter 5 pl de tampon de chargement 5x à la réaction et une électrophorèse sur gel d&#39;agarose avec 15 ul du mélange résultant. </li></ol> 3. Le génotypage des souris transgéniques en utilisant le protocole de dilution <ol><li> Commencer la procédure de dilution sur des souris transgéniques en plaçant un poinçon 2 mm de la mouse oreille dans 20 ul de tampon de dilution contenant 0,5 ul de l&#39;additif DNARelease fourni avec le kit de tissus animaux Phire PCR directe. </li><li> Incuber les échantillons à température ambiante pendant 2 min, suivie d&#39;une incubation de 2 min à 98 ° C. </li><li> Tourner les échantillons brièvement dans une microcentrifugeuse jusqu&#39;à ce que les réactions sont au fond des tubes. </li><li> Utilisez 1 pl de surnageant comme modèle pour un 20 réactif PCR, préparé comme décrit dans le tableau 3. Toute surnageant qui ne doit pas être utilisé tout de suite peut être transférée dans un nouveau tube et stockés à -20 ° C. </li><li> Ensuite, utiliser un Thermo Scientific Piko de 24 puits et Thermocycleur PCR Thermo Scientific Piko Plaque pour effectuer les réactions de PCR utilisant les conditions décrites à vélo dans le tableau 4. Encore une fois, les réactions PCR peut également être effectuée dans les thermocycleurs PCR conventionnelles. </li><li> Suite à la PCR, ajouter 5 pl de tampon de chargement 5x à la réaction et d&#39;effectuer l&#39;électrophorèse sur gel d&#39;agarose wvec 15 ul du mélange résultant. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Dans la technique dCAPS le site de restriction dans le SNP d&#39;intérêt est introduit ou détruits à l&#39;aide d&#39;une amorce PCR avec une ou plusieurs mésappariements de l&#39;ADN cible. Le génotypage d&#39;individus végétaux Arabidopsis a été réalisée avec la technique dCAPS directement à partir de poinçons feuilles. Les produits amplifiés ont été digérés et les fragments résultants révélant le génotype de chaque individu ont été analysés par électrophorèse sur gel (Figure 2). Dans cet exemple, les 160 pb produits de PCR contenant le site SNP d&#39;intérêt (G ou allèle) dans le génome d&#39;Arabidopsis ont été amplifiés à partir de poinçons feuilles des plantes avec l&#39;usine Phire direct Kit PCR. L&#39;amorce sens contient un mésappariement à l&#39;extrémité 3 &#39;, la création d&#39;un site de restriction Ssp spécifique dans l&#39;ADN cible, qui comprend le SNP d&#39;intérêt (allèle), mais pasdans l&#39;autre allèle du SNP (figure 2B). Protocoles de dilution sont nécessaires pour le matériel végétal difficiles, comme la feuille de chêne, en raison de sa forte concentration en composés phénoliques. En utilisant le protocole de dilution décrit ici, le fragment de 297 pb de l&#39;ADN chloroplastique a été amplifié en utilisant le protocole 3-étape. Échantillons de feuilles de chêne avec différentes dilutions sont présentés dans la figure 3, en plus des contrôles positifs et négatifs. L&#39;animal Phire Tissue Kit PCR directe a été utilisée avec un protocole exigeant où un seul ensemble d&#39;amorces a été utilisé pour l&#39;amplification de deux fragments avec une différence de taille importante, ce qui entraîne des rendements abondantes de ces deux produits de taille correcte de 1.500 pb pour les souris transgéniques et 200 pb pour souris de type sauvage (figure 4). Le faible bande supérieure avec des souris hétérozygotes est due à la concurrence des deux modèles (allèles) pour la paire d&#39;amorces même, mais le génotypagerésultats décevants sont sans ambiguïté. La stabilité des échantillons préparés en utilisant le protocole de dilution a également été testé. Les résultats montrent que les échantillons de dilution peut être conservé à -20 ° C pendant au moins un an. Par ailleurs, à plusieurs reprises cycles gel / dégel n&#39;a pas affecté significativement la réaction (Figure 5). On voit également l&#39;amplification robuste à partir d&#39;échantillons de tissus de souris oreille en utilisant l&#39;ADN polymérase Phire et la méthode PCR directe par rapport à début polymérase Taq chaude et de l&#39;ADN purifié (figure 6). <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Composants </td><td fo:width=".75in"> Réaction de 20 ul </td><td fo:width=".75in"> Réactionnel de 50 ul </td><td fo:width=".75in"> Conc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> ajouter à 20 pi </td><td> ajouter à 50 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire usine tampon PCR </td><td> 10 pl </td><td> 25 pi </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Une amorce </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> amorce B </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start ADN polymérase II </td><td> 0,4 pi </td><td> 1 pl </td><td></td></tr><tr><td> Exemple / Direct Protocol </td><td></td><td> 0,50 mm poinçon </td><td></td></tr><tr><td> Échantillon / dilution protocole </td><td> 0,5 à 1 ul </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1.<html> Les conditions de réaction PCR de végétaux utilisés dans le présent protocole. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Etape cycle de </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Temps </td><td fo:width=".4in"> Cycles </td></tr><tr><td> Dénaturation initiale </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Dénaturation Recuit * Extension </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Extension finale </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min tenir </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Conditions vélo pour Plant PCR utilisée dans le présent protocole. * La calculatrice à Tmoscientific.com / pcrwebtools &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools est recommandé lors de la détermination de la Tm des amorces pour être utilisés avec Phire Hot Start ADN polymérase II. La température recommandée pour le recuit amorces ≤ 20 nt est égale à inférieure à la Tm proposée par l&#39;outil Web. Par amorces&gt; 20 nt, utiliser une température de recuit 3 ° C supérieure à la Tm inférieure proposée par l&#39;outil Web. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Composants </td><td fo:width=".75in"> Réaction de 20 ul </td><td fo:width=".75in"> Conc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> ajouter à 20 pi </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire tissu animal tampon PCR </td><td> 10 pl </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Une amorce </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> amorce B </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start ADN polymérase II </td><td> 0,4 pi </td><td></td></tr><tr><td> Échantillon / dilution protocole </td><td> 1 pl </td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 3. Conditions de réaction pour les tissus animaux PCR utilisée dans le présent protocole. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Etape cycle de </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Temps </td><td fo:width=".4in"> Cycles </td></tr><tr><td> Dénaturation initiale </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Dénaturation Recuit * Extension </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 ko 20 sec / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Extension finale </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min Tenir </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Conditions vélo pour les tissus animaux PCR utilisés dans le présent protocole. * La calculatrice Tm à <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> est recommandé lors de la détermination de la Tm des amorces pour être utilisés avec Phire Hot Start ADN polymérase II. La température recommandée pour le recuit amorces ≤ 20 nt est égale à la plus faible Tm donnée par l&#39;outil Web. Pour des amorces&gt; 20 nt, utiliser une température de recuit 3 ° C supérieure à la Tm inférieure proposée par l&#39;outil Web. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. PCR directe flux de travail. Direct PCR peut être effectuée en utilisant deux protocoles alternatifs. Dans le protocole directement une petite quantité d&#39;échantillon est ajouté directement à l&#39;ordinateurR réactionnel. Le protocole de dilution emploie une mémoire de pré-incubation avant l&#39;étape de PCR pour libérer l&#39;ADN de l&#39;échantillon. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Le génotypage d&#39;individus végétaux Arabidopsis avec la technique dCAPS directement à partir de poinçons feuilles. A) La figure 2A montre le principe de l&#39;essai effectué dCAPS. Le site de restriction dans le SNP d&#39;intérêt est introduit ou retiré par PCR en utilisant une amorce avec un ou plusieurs mésappariements de l&#39;ADN cible. Les produits de PCR sont digérés et les fragments résultants révéler le génotype de chaque individu lorsqu&#39;il est analysé par électrophorèse. B) 0,50 mm poinçons de feuilles de plantes ont été placées directement dans 50 pi de réactions PCR. Les 160 pb produits de PCR contenant le site SNP (G ou allèle) ont été amplifiés avec des amorces introduisant un site unique Sspl à l&#39;A-allèle. Les produits non purifiés PCR étaient digestionted l&#39;enzyme de restriction Ssp. Fragments résultants ont été analysés sur un gel d&#39;agarose à 3%. Lane M est le marqueur de taille; voies A et G correspondent aux allèles SNP de chaque échantillon. Les résultats obtenus ont été confirmés par l&#39;analyse conventionnelle de l&#39;extraction d&#39;ADN suivie par PCR et digestion de restriction (données non présentées). Les réactions de contrôle négatif sans ADN matrice ont été inclus dans l&#39;essai mis en place et exécuté sur un gel d&#39;agarose séparé en parallèle avec les réactions de PCR réels avant d&#39;effectuer les digestions (données non présentées). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Figure 3. Protocole de dilution en utilisant des échantillons de feuilles de chêne. Le protocole de dilution a été utilisé pour amplifier le fragment 297 pb de l&#39;ADN chloroplastique dans des échantillons de feuilles de chêne (3-étape du protocole, un recuit à 62 ° C) à différentes dilutions (1:100, 1:10, 1 : 1 et 2:1) et con positifs et négatifscontrôles [C +: contrôle positif de l&#39;ADN purifié (Arabidopsis), C-: témoin négatif sans ADN matrice]. La nomenclature échantillon représente le site de prélèvement de l&#39;échantillon (villes de Finlande) et l&#39;échantillon de numérotation. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Le génotypage des souris transgéniques avec une paire d&#39;amorces en utilisant le protocole de dilution. Tissus d&#39;oreille de neuf souris individuelles (voies 1-9) ont été placés dans 20 ul de tampon de dilution, y compris l&#39;additif DNARelease. Après incubation à la température ambiante et 98 ° C, 1 pl de surnageant a été utilisé comme modèle dans les années 20 réactif PCR. Taille des fragments: 1.500 pb (transgénique) et 200 pb (type sauvage). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Les échantillons préparés selon le protocole de dilution sont stables pour le stockage à long terme. Échantillons de tissus de l&#39;oreille de souris sont TTC<html> ubated dans 20 ul de tampon de dilution, y compris l&#39;additif DNARelease et soumis à une congélation répétée / dégel (piste 1), conservés à -20 ° C pendant une année (piste 2), ou utilisées immédiatement pour PCR (piste 3). La taille des fragments amplifiés étaient 900 pb, 1500 pb et 3200 pb. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Phire tissu animal Direct PCR Kit surpasse un système de purification d&#39;ADN commerciale associée à une ADN polymérase Taq de démarrage à chaud. Quatre amplicons (0,5 à 1,5 kb) ont été amplifiés à partir de tissus de l&#39;oreille de souris en utilisant le protocole de dilution directe des tissus animaux Phire Kit PCR. A titre de comparaison, l&#39;ADN a été purifié en utilisant un kit ADN commerciale d&#39;extraction et les mêmes fragments ont été amplifiés en utilisant une polymérase Taq ADN de démarrage à chaud selon les recommandations du fabricant. Ce n&#39;est qu&#39;avec l&#39;Phire tissu animal Direct Kit PCR étaient les quatre amplicons amplification réussie. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Figure 7" /> Figure 7. Comparaison universelle du flux de travail avec une estimation de fois / réactifs consommés. Thermo Scientific PCR directe approche est comparée à l&#39;approche isolement de l&#39;ADN, l&#39;approche Tampon d&#39;extraction, et l&#39;approche du tampon de PCR. Le temps estimé pour chaque approche avant l&#39;étape de PCR est répertorié en rouge. Le Thermo Scientific PCR directe approche ne prend que 0-4 minutes pour la préparation des échantillons avant la PCR. En dessous de chaque méthode, les réactifs consommés sont répertoriés. Le Thermo Scientific PCR directe approche utilise le minimum de réactifs par rapport aux autres méthodes. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Production et le libre accès à cet article est sponsorisé par Thermo Fisher Scientific, Inc

L&#39;approche directe PCR a démontré ici permet l&#39;amplification par PCR directement à partir de petites quantités d&#39;échantillons non purifiés, ce qui réduit le temps nécessaire et en simplifiant le flux de production pour l&#39;usine et le génotypage des animaux (Figure 7). Également démontré ici est l&#39;utilisation du protocole de dilution en combinaison avec l&#39;approche directe par PCR (figure 3). Le protocole de dilution est recommandée avec des échantillons difficiles (par exemple les feuilles des plantes âgées, les espèces végétales qui contiennent des substances perturbatrices) ou longues (ou riche en GC) amplicons. Ce protocole est particulièrement utile lorsque vous commencez une nouvelle expérience directe PCR, permettant une optimisation de la réaction. Le protocole peut servir d&#39;outil pour résoudre les difficultés occasionnelles telles que les rendements des produits faibles en raison de différences de matériel tissulaire et / ou amorces utilisées. En outre, lors de l&#39;exécution de multiples réactions dans le même échantillon, l&#39;utilisation du protocole de dilution assure la totalité de l&#39;échantillon n&#39;est pas consommée dans unréaction. Afin de purifier l&#39;ADN de plantes pour la PCR, la convention était d&#39;effectuer la lyse cellulaire suivie d&#39;isolement de l&#39;ADN en utilisant divers composants qui pourraient potentiellement interférer avec l&#39;analyse par PCR 8. Pour les plantes en particulier difficile avec fort contenu phénolique, plus de polyvinylpyrrolidone a été traditionnellement utilisé pour éliminer les composés qui se lient à l&#39;ADN après 2,5 lyse cellulaire. Comme on le voit ici, ces temps compliqués, à forte intensité étapes peuvent être évités grâce à l&#39;utilisation de l&#39;usine Phire direct Kit PCR pour détecter l&#39;ADN cible. La lyse des cellules et des mesures d&#39;isolement d&#39;ADN peut être omis en utilisant les techniques dCAPS sensibles directement à partir de feuilles de plantes d&#39;Arabidopsis (Figure 2). Comme démontré ici, le protocole de dilution gère efficacement la présence de composants problématiques qui peuvent interférer avec la PCR (Figure 3). Traditionnellement, une condition préalable à l&#39;animal génotypage a été isolatisur de l&#39;ADN génomique à partir de tissus d&#39;origine animale grâce à une substance toxique, processus fastidieux caractérisé par une incubation prolongée avec la protéinase K pour digérer les tissus cutanés et conjonctifs, suivie d&#39;extraction par solvant organique, précipitation à l&#39;alcool, et les étapes de centrifugation 6,9,10. Comme démontré ici, la simplification de ce processus est réalisé grâce à l&#39;utilisation de l&#39;Phire tissu animal Direct Kit PCR permettant souris transgéniques pour être génotypés sans purification de l&#39;ADN avant (figure 4). L&#39;exemple montré dans cet article est particulièrement difficile car un seul ensemble d&#39;amorces a été utilisé pour l&#39;amplification de deux fragments avec une différence de taille importante. Malgré la difficulté innée du protocole, l&#39;utilisation de l&#39;approche directe par PCR en conjonction avec le protocole simple dilution donné des rendements élevés des produits de PCR deux (figure 4). Basée sur la PCR de détection d&#39;ADN cible a de nombreuses applications dans la recherche, y compris l&#39;analyse du génotype d&#39;identifierle rôle des gènes dans le développement, la physiologie et la maladie. En raison de la tolérance inhibiteur des ADN polymérases spécialisées, les protocoles peut être complété en un minimum de temps sans purification de l&#39;ADN avant.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Phire usine directe PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 réactions (50 pi chacun) </td></tr><tr><td> Phire tissu animal Direct PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 pi chacun) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,35 mm (rose) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Qté: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,50 mm (bleu) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Qté: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Tapis de coupe 6,4 × 7,6 cm </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Quantité: 5 </td></tr><tr><td> Sspl </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 pi (100 réactions) </td></tr><tr><td> Piko 24-Eh bien Thermocycleur </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well Piko Plaques PCR </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Kit de purification </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

L&#39;approche directe PCR facilite l&#39;amplification par PCR directement à partir de petites quantités d&#39;échantillons non purifiés, et se manifeste ici pour plante plusieurs et tissus animaux (Figure 1). Direct PCR est basée sur Phusion spécialement conçu Thermo Scientific et ADN polymérase Phire, qui comprennent un domaine d&#39;ADN double brin contraignant qui leur confère des propriétés uniques telles que la tolérance élevée d&#39;inhibiteurs. Basée sur la PCR de détection d&#39;ADN cible a de nombreuses applications dans la recherche végétale, y compris l&#39;analyse génotype de la plante et la vérification des transgènes. PCR à partir de tissus végétaux implique traditionnellement une étape initiale d&#39;ADN isolée, ce qui peut nécessiter des réactifs coûteux ou toxiques. Le processus prend du temps et augmente le risque de contamination croisée 1, 2. A l&#39;inverse, en utilisant Thermo Scientific Phire usine direct kit PCR de l&#39;ADN cible peut être facilement détectée, sans extraction de l&#39;ADN avant. Dans le modèle montré ici, unpar exemple des dérivés analyse clivée séquence polymorphe amplifié (dCAPS) 3,4 est effectuée directement à partir de feuilles de la plante Arabidopsis. dCAPS tests de génotypage peuvent être utilisés pour identifier les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) par SNP allèle-spécifique digestion par une endonucléase de restriction 3. Certains échantillons de plantes ont tendance à être plus difficile lors de l&#39;utilisation directe des méthodes de PCR car ils contiennent des composants qui interfèrent avec la PCR, tels que les composés phénoliques. Dans ces cas, une étape supplémentaire pour éliminer les composés sont traditionnellement tenus 2,5. Ici, ce problème est résolu en utilisant un protocole de dilution simple et rapide suivie d&#39;une amplification par PCR directe (figure 1). Quinze feuilles de chêne ans sont utilisés comme un modèle pour les plantes difficiles que l&#39;échantillon contient de grandes quantités de composés phénoliques dont les tanins. Le transfert de gènes chez la souris est largement utilisé pour étudier le rôle des gènes dans dévepement, la physiologie et les maladies humaines. L&#39;utilisation de ces animaux nécessite le dépistage de la présence du transgène, généralement par PCR. Traditionnellement, il s&#39;agit d&#39;une étape longue durée isolement de l&#39;ADN, au cours de laquelle l&#39;ADN pour l&#39;analyse PCR est purifié à partir de tissus d&#39;oreille, la queue ou de l&#39;orteil 6,7. Cependant, avec les Thermo Scientific Phire animaux souris transgéniques tissus directs PCR kit peuvent être génotypés sans purification de l&#39;ADN avant. Dans ce protocole de génotypage de souris transgénique est obtenu directement à partir de tissus de l&#39;oreille de souris, comme en témoigne ici pour un exemple stimulant où un seul ensemble d&#39;amorces est utilisée pour l&#39;amplification de deux fragments de taille très différentes.

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Génotypage d'échantillons végétaux et animaux sans purification préalable de l'ADN | Biologie | Vidéo

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

L&#39;approche présentée ici PCR directe facilite l&#39;amplification par PCR directement à partir de petites quantités de plantes non purifié et tissus d&#39;origine animale.

Le génotypage des échantillons de plantes et d&#39;animaux sans purification d&#39;ADN Avant

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

Purification simplifiée d&#39;ADN plasmidique de cultures procaryotes

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Une méthode de génotypage basé sur la PCR pour distinguer les variétés de type sauvage et les plantes ornementales de Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purifier l&#39;impur: séquençage métagénomes et Metatranscriptomes de complexes échantillons d&#39;animaux associés

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l&#39;ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

Purification de l&#39;ensemble du génome de l&#39;ADN extrachromosomique circulaire à partir de cellules eucaryotes

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Une méthode Sectionnement améliorée pour les échantillons de tissus végétaux récalcitrantes

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopie électronique à balayage (MEB) Protocoles pour Problematic plantes, Oomycètes et échantillons Fungal

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...