Para as amostras de Arabidopsis e os primers de PCR interessados ​​agradecemos o professor Jaakko Kangasjärvi e seu grupo, O Grupo de estresse da planta, Biologia Vegetal, Departamento de Biociências, Universidade de Helsinque. Os experimentos com o método tradicional foram realizadas pela Sra. Airi Lamminmäki. Amostras de camundongos transgênicos foram fornecidos pelo Dr. Jaana Vesterinen, Instituto de Biomedicina / Bioquímica, da Universidade de Helsinki. Harris Uni-Core e Harris esteira de corte são marcas comerciais da Shunderson Communications Inc. Todas as outras marcas são de propriedade de Thermo Fisher Scientific Inc. e suas subsidiárias.

1. Genotipagem dos indivíduos planta Arabidopsis com protocolo direto <ol><li> Para começar o ensaio de genotipagem dCAPS directamente sobre a folha da planta Arabidopsis, primeiro formular 20 ou 50 ul de reacções de PCR utilizando a Usina Phire directa PCR Kit, como descrito na Tabela 1. </li><li> Em seguida, corte um soco 0,50 mm a partir de uma folha da planta Arabidopsis usando o Harris Uni-Core e Harris esteira de corte. Segurando o perfurador com firmeza, pressione a ponta para o tecido e gire o perfurador e para trás. </li><li> Pressione o êmbolo para ejetar o disco soco em uma mistura de reação de PCR. Certifique-se de que a amostra cai para dentro da solução de PCR e não aderem às paredes do tubo. </li><li> Limpe a ponta do perfurador entre cada amostra para evitar a contaminação cruzada, mergulhando-o em solução de hipoclorito de sódio a 2%. Pressione o êmbolo para cima e para baixo algumas vezes e limpe a ponta com uma toalha de papel. A placa de corte deve ser tambémenxaguado entre amostras. </li><li> Em seguida, utilizam uma Thermo Scientific Piko 24 cavidades Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko Placa PCR para realizar as reacções de PCR, utilizando as condições de ciclagem descritas na Tabela 2. As reacções de PCR pode também ser realizada em convencionais de PCR termocicladores. </li><li> Após a PCR, girar o material vegetal. Transferir 5 ul de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo. Adicionar 4 ul de água e 1 ul da enzima de restrição, SspI. Misturar suavemente e girada para baixo rapidamente para recolher o conteúdo na parte inferior do tubo. Incubar a mistura de reacção durante uma hora a 37 ° C. Inactivar a enzima de restrição, por incubação a 65 ° C durante 20 min. </li><li> Quando a amplificação do ADN directamente a partir de tecidos de plantas, os produtos de PCR de plantas e incluem PCR derivado de componentes que possam interferir com a enzima de digestão de restrição. Por isso, pode ser necessário diluir ou (por exemplo, 1:2 ou 1:3 em água), ou purificar o produto de PCR antes tele digestão subsequente, por exemplo, utilizando um kit comercial, tal como apropriado Thermo Scientific Purification Kit GeneJET PCR. </li><li> Após a digestão com enzimas de restrição, análise dos fragmentos resultantes num gel de agarose. Adicionar 2,5 uL de tampão de carga de 5x à reacção e de electroforese em gel de agarose a realizar com 10 uL da mistura resultante. </li></ol> 2. Amplificar fragmentos específicos de DNA a partir de Carvalho de 15 anos de idade, Folhas usando o protocolo de diluição <ol><li> Para começar, corte um soco 2 mm de folha de carvalho. </li><li> Colocar a amostra em 20 ul de tampão de diluição fornecido com a Usina direto Phire Kit PCR. Limpe a ponta do perfurador e corte tapete como antes. </li><li> Triturar a amostra de folha com uma ponta de pipeta de 100 uL, pressionando-o contra brevemente a parede do tubo. Dependendo do material de planta, o protocolo de diluição, por vezes, trabalha melhor sem esmagamento da amostra. </li><li> Girar as amostras brevemente numa microcentrífuga até tele reacções são no fundo dos tubos. </li><li> O sobrenadante pode ser utilizado directamente na PCR, ou pode ser diluído 1:10 ou 1:100 em água estéril, dependendo do tipo de amostra. Utilizar 0,5 ul de 1 ul do sobrenadante ou diluição como molde para uma reacção de PCR 20 ul. Preparar a reacção, tal como descrito na Tabela 1. </li><li> Uma vez que as reacções são preparados, empregar uma Thermo Scientific Piko 24 cavidades Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko Placa PCR para realizar as reacções de PCR, utilizando as condições de ciclagem descritas na Tabela 2. As reacções de PCR pode também ser realizada em convencionais de PCR termocicladores. </li><li> Após a PCR, adicionam-se 5 ul de tampão de carregamento de 5x à reacção e de electroforese em gel de agarose a realizar com 15 uL da mistura resultante. </li></ol> 3. Genotipagem de camundongos transgênicos que utilizam o protocolo de diluição <ol><li> Iniciar o protocolo de diluição em ratinhos transgénicos, colocando um perfurador 2 mm da mouse orelha em 20 ul de tampão de diluição contendo 0,5 uL de Aditivo DNARelease fornecido com o Kit de tecido animal Phire PCR directo. </li><li> Incubar as amostras à temperatura ambiente, durante 2 min, seguido de 2 minutos de incubação a 98 ° C. </li><li> Girar as amostras brevemente numa microcentrífuga até que as reacções estão na parte inferior dos tubos. </li><li> Use 1 ul de sobrenadante como molde para uma reacção de PCR 20 uL, preparado tal como descrito na Tabela 3. Qualquer sobrenadante que não está a ser utilizado pode ser imediatamente transferida para um novo tubo e armazenado a -20 ° C. </li><li> Em seguida, utilizam uma Thermo Scientific Piko 24 cavidades Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko Placa PCR para realizar as reacções de PCR, utilizando as condições de ciclagem descritas na Tabela 4. Mais uma vez, as reacções de PCR pode também ser realizada em termocicladores convencionais de PCR. </li><li> Seguindo PCR, adicionam-se 5 ul de tampão de carregamento de 5x à reacção e de electroforese em gel de agarose a executar wul 15 i da mistura resultante. </li></ol> 4. Resultados representativos Na técnica dCAPS o sítio de restrição dentro do SNP de interesse é introduzida ou destruídos ou usando um iniciador de PCR, com uma ou mais diferenças para o DNA-alvo. A genotipagem de indivíduos de plantas de Arabidopsis foi realizada com a técnica dCAPS directamente a partir de punções de folha. Os produtos amplificados foram digeridos e os fragmentos resultantes revelando o genótipo de cada indivíduo foram analisados ​​por electroforese em gel (Figura 2). Neste exemplo, os 160 pb produtos de PCR contendo o local SNP de interesse (G ou alelo A), no genoma de Arabidopsis foram amplificados a partir de punções de folha da planta com a planta directa Phire Kit PCR. O iniciador directo continha uma incompatibilidade na extremidade 3 &#39;, criando um local de restrição SspI-específica no ADN alvo, que inclui o SNP de interesse (alelo A), mas nãono outro alelo do SNP (Figura 2B). Protocolos de diluição é necessária para material de planta desafiador, tais como a folha de carvalho, devido à sua elevada concentração de compostos fenólicos. Usando o protocolo de diluição descrito aqui, o fragmento de 297 pb de DNA cloroplástico foi amplificado utilizando o protocolo de três passos. Amostras de folhas de carvalho com diferentes diluições são mostrados na Figura 3, para além dos controlos positivo e negativo. O animal Phire Tissue Kit de PCR directo foi empregado com um protocolo de desafio em que apenas um conjunto de iniciadores foi utilizado para a amplificação de dois fragmentos com uma diferença de tamanho grande, resultando em rendimentos abundantes de ambos os produtos correctamente tamanho de 1500 pb para ratos transgénicos e 200 pb para ratinhos de tipo selvagem (Figura 4). A banda mais fraca superior com camundongos heterozigotos é devido à concorrência de ambos os modelos (alelos) para o par de primers mesmo, porém, o genotyping resultados são inequívocos. A estabilidade das amostras preparadas utilizando o protocolo de diluição foi também testado. Os resultados mostram que as amostras de diluição podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos um ano. Além disso, repetidos de congelamento / descongelamento não afectou significativamente a reacção (Figura 5). Também é mostrado a amplificação a partir de amostras de rato robusto orelha tecido com Phire polimerase de DNA e do método de PCR directa em comparação com hot start Taq polimerase e DNA purificada (Figura 6). <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componentes </td><td fo:width=".75in"> Reacção de 20 uL </td><td fo:width=".75in"> 50 reação ul </td><td fo:width=".75in"> Conc final. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> adicionar 20 ul </td><td> adicionar a 50 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Planta PCR buffer </td><td> 10 ul </td><td> 25 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Um iniciador </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> iniciador B </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start DNA Polimerase II </td><td> 0,4 ul </td><td> 1 ul </td><td></td></tr><tr><td> Amostra / protocolo direto </td><td></td><td> 0,50 milímetros perfurador </td><td></td></tr><tr><td> Amostra / diluição protocolo </td><td> 0,5-1 ul </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1.<html> Condições de reação para Usina de PCR utilizado neste protocolo. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Passo ciclo </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tempo </td><td fo:width=".4in"> Ciclos </td></tr><tr><td> Desnaturação inicial </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Desnaturação Recozimento * Extensão </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 seg 5 seg 20 sec </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Extensão final </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min segurar </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Condições do ciclismo para Usina de PCR utilizado neste protocolo. * A calculadora Tm emoscientific.com / pcrwebtools &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools é recomendado para a determinação da Tm para primers a serem usados ​​com ADN polimerase Hot Phire Iniciar II. A temperatura recomendada para recozimento primers ≤ 20 nt é igual a Tm mais baixa dado pela ferramenta web. Para iniciadores&gt; 20 nt, utilizar uma temperatura de recozimento de 3 ° C mais elevada do que a Tm mais baixa dado pela ferramenta web. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Componentes </td><td fo:width=".75in"> Reacção de 20 uL </td><td fo:width=".75in"> Conc final. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> adicionar 20 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire tecido animal PCR buffer </td><td> 10 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Um iniciador </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> iniciador B </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start DNA Polimerase II </td><td> 0,4 ul </td><td></td></tr><tr><td> Amostra / diluição protocolo </td><td> 1 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Condições de reacção para tecidos animais PCR utilizada neste protocolo. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Passo ciclo </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Tempo </td><td fo:width=".4in"> Ciclos </td></tr><tr><td> Desnaturação inicial </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Desnaturação Recozimento * Extensão </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 seg 5 seg 20 seg ≤ 1 kb 20 seg / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Extensão final </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min Segurar </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Condições do ciclismo para tecidos animais PCR utilizados neste protocolo. * O calculador de Tm em <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> é recomendado para a determinação da Tm para primers para ser usado com Phire Hot DNA Polymerase Iniciar II. A temperatura recomendada para recozimento primers ≤ 20 nt é igual ao Tm mais baixa dado pela ferramenta web. Para iniciadores&gt; 20 nt, utilizar uma temperatura de recozimento de 3 ° C mais elevada do que a mais baixa Tm determinada pela ferramenta web. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. PCR directo do fluxo de trabalho. Directo de PCR pode ser realizada utilizando dois protocolos alternativos. No protocolo direto uma pequena quantidade de amostra é adicionado diretamente ao PCR reacção. O protocolo de diluição emprega um passo de pré-incubação breve, antes da PCR para libertar o DNA do material da amostra. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A genotipagem de indivíduos de plantas de Arabidopsis com dCAPS técnica directamente a partir de punções de folha. A) A figura 2A mostra o princípio do ensaio dCAPS realizada. O sítio de restrição dentro do SNP de interesse é introduzido ou removido ou por PCR utilizando um iniciador com uma ou mais diferenças para o DNA-alvo. Os produtos de PCR são digeridos, e os fragmentos resultantes revelar o genótipo de cada indivíduo, quando analisado por electroforese. B) 0,50 milímetros punções de folhas das plantas foram colocadas directamente em 50 ul de reacções de PCR. Os 160 pb a produtos de PCR contendo o local SNP (G ou alelo A) foram amplificadas com iniciadores a introdução de um sítio único SspI para o alelo. Os produtos de PCR foram não purificados digestãoted com a enzima de restrição Sspl. Fragmentos resultantes foram analisados ​​num gel de agarose a 3%. Pista M é o marcador de tamanho; pistas A e G correspondem aos alelos do SNP de cada amostra. Os resultados obtidos foram confirmadas por análise convencional de extracção de ADN, seguido por PCR e digestão de restrição (dados não mostrados). As reacções de controlo negativo sem ADN molde foram incluídos no conjunto de ensaio, e corrido num gel de agarose separado em paralelo com as reacções de PCR actuais antes de realizar as digestões (dados não mostrados). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Figura 3. Protocolo de diluição utilizando-se amostras de folhas de carvalho. O protocolo de diluição foi usado para amplificar o fragmento de 297 pb de DNA cloroplástico em amostras de folhas de carvalho (3-passo do protocolo, hibridação a 62 ° C) em diluições diferentes (1:100, 1:10, 1 : 1 e 2:1) e con positivo e negativotrols [C +: controlo positivo de DNA purificada (Arabidopsis), C-: controlo negativo sem ADN]. A nomenclatura amostra representa o local de coleta da amostra (cidades na Finlândia) e da amostra de numeração. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. A genotipagem de ratinhos transgénicos com um par de iniciadores, utilizando o protocolo de diluição. Tecidos da orelha dos nove ratinhos individuais (pistas 1-9) foram colocados em 20 ul de tampão de diluição incluindo Aditivo DNARelease. Após as incubações à temperatura ambiente e 98 ° C, 1 ml de sobrenadante foi utilizado como molde na reacção de PCR 20 ul. Tamanhos de fragmentos: 1500 bp (transgênicos) e 200 pb (tipo selvagem). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. As amostras preparadas de acordo com o protocolo de diluição são estáveis ​​durante o armazenamento a longo prazo. Amostras de tecidos da orelha de rato foram inc<html> ubated em 20 ul de tampão de diluição incluindo Aditivo DNARelease e submetidos a congelamento repetido / descongelamento (pista 1), armazenado a -20 ° C durante um ano (pista 2), ou utilizada imediatamente para PCR (pista 3). Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram de 900 pb, 1500 pb e 3200 pb. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Phire tecido animal directa PCR Kit supera um sistema de purificação de ADN comercial combinado com um hot start Taq DNA polimerase. Quatro amplicons (0,5-1,5 kb) foram amplificados a partir de tecidos de rato da orelha utilizando o protocolo de diluição do Tissue Phire directa animal Kit PCR. Para efeitos de comparação, o ADN foi primeiro purificado utilizando um kit comercial de extracção de ADN e os mesmos fragmentos foram amplificados utilizando um hot start Taq ADN polimerase de acordo com as recomendações dos fabricantes. Apenas com o Animal Tissue Phire directa PCR Kit foram todos os quatro fragmentos amplificados com sucesso amplificados. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Universal comparação do fluxo de trabalho com a estimativa dos tempos / reagentes consumidos. Thermo Scientific directa abordagem de PCR é comparada com a abordagem de isolamento de ADN, a abordagem de tampão de extracção, e a abordagem de tampão PCR. O tempo previsto para cada abordagem, antes da etapa de PCR é listada em texto vermelho. A Thermo Scientific direto abordagem PCR leva apenas 0-4 minutos para a preparação da amostra antes da PCR. Abaixo de cada método, os reagentes consumidos são listados. A Thermo Scientific direto abordagem PCR usa a menor quantidade de reagentes em comparação com os outros métodos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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	<li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li><li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP.">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li><li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCAPS,+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms:+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics.">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> The Plant Journal. 14, 387-392 (1998).</li><li>Michaels, S. D., Amasino, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+method+for+detecting+single-nucleotide+changes+as+polymorphic+markers+by+PCR.">A robust method for detecting single-nucleotide changes as polymorphic markers by PCR.</a> The Plant Journal. 14, 381-385 (1998).</li><li>John, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+RNA+and+DNA+from+plants+containing+polyphenolics.">An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenolics.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2381-23 (1992).</li><li>Wang, Z., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+mouse+tails.">Extraction of DNA from mouse tails.</a> BioTechniques. 41, 410-412 (2006).</li><li>Malumbres, M., Mangues, R., Ferrer, N., Lu, S., Pellicer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+High+Molecular+Weight+DNA+for+Reliable+Genotyping+of+Mice.">Isolation of High Molecular Weight DNA for Reliable Genotyping of Mice.</a> BioTechniques. 22, 1114-1119 (1997).</li><li>Yang, Y., Kim, J. Y., Soh, M. S., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+gene+amplification+from+Arabidopsis+Leaves+Using+AnyDirect+system.">A simple and rapid gene amplification from Arabidopsis Leaves Using AnyDirect system.</a> Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40, 444-447 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory. , (1989).</li><li>Meldgaard, M., Bollen, P. J. A., Finsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+method+for+sampling+and+extraction+of+mouse+DNA+for+PCR.">Non-invasive method for sampling and extraction of mouse DNA for PCR.</a> Laboratory Animals. 3, 413-441 (2004).</li></ol>

Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Thermo Fisher Scientific, Inc.

A abordagem de PCR directo demonstrado aqui permite a amplificação por PCR directamente a partir de pequenas quantidades de amostras não purificadas, reduzindo o tempo necessário e simplificar o fluxo de trabalho para a planta e genotipagem do animal (Figura 7). Demonstraram também aqui é o uso do protocolo de diluição em combinação com a metodologia de PCR directo (Figura 3). O protocolo de diluição é recomendado com amostras difíceis (por exemplo, folhas de plantas idade, espécies de plantas que contêm compostos interferir) ou com comprimento (ou GC-rico) amplicons. Este protocolo é particularmente útil quando se inicia um novo experimento de PCR direto, permitindo a otimização da reação. O protocolo pode servir como uma ferramenta para resolver as dificuldades ocasionais, tais como rendimentos de produto são reduzidas devido a diferenças no material de tecido e / ou de iniciadores utilizados. Além disso, durante a execução de reacções múltiplas da mesma amostra, a utilização do protocolo de diluição assegura a totalidade da amostra não é consumida numareacção. A fim de purificar DNA a partir de plantas para a PCR, a convenção foi realizar a lise das células, seguido por isolamento do ADN, utilizando vários componentes que podem potencialmente interferir com a análise de PCR 8. Para plantas particularmente difícil, com elevado teor de compostos fenólicos, a adição de polivinilpirrolidona foi tradicionalmente usado para remover os compostos que se ligam ao DNA após a lise das células de 2,5. Como evidente, estas complicadas, demoradas etapas pode ser evitado através da utilização da planta Phire directa PCR Kit para detectar o DNA-alvo. A lise celular e passos de isolamento de DNA pode ser omitido utilizando as técnicas dCAPS sensíveis directamente a partir de folhas de plantas de Arabidopsis (Figura 2). Como demonstrado aqui, o protocolo de diluição gere eficazmente a presença de componentes problemáticos que podem interferir com a PCR (figura 3). Tradicionalmente, um pré-requisito para genotipagem de animais foi isolation de DNA genómico a partir de tecido animal por meio de um tóxico, processo que consome tempo de incubação caracteriza-se por uma longa com proteinase K para digerir a pele e tecido conjuntivo, seguido por extracção com solvente orgânico, a precipitação de álcool, e os passos de centrifugação 6,9,10. Tal como demonstrado aqui, a simplificação deste processo é conseguido através do uso do Animal Tissue Phire directa PCR Kit, permitindo que ratinhos transgénicos para ser genotipados sem purificação prévia de ADN (Figura 4). O exemplo demonstrado neste artigo é particularmente difícil uma vez que apenas um conjunto de iniciadores foi utilizado para a amplificação de dois fragmentos com um tamanho grande diferença. Apesar de dificuldade inata do protocolo, o uso da metodologia de PCR directo em conjunto com o protocolo de diluição simples resultou em rendimentos elevados dos dois produtos de PCR (Figura 4). PCR baseado em detecção de DNA-alvo tem muitas aplicações na pesquisa, incluindo a análise para identificar o genótipoo papel dos genes na fisiologia, desenvolvimento e doença. Devido à tolerância inibidor das ADN-polimerases especializadas, os protocolos podem ser concluídas em um tempo mínimo de ADN sem purificação prévia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Phire Planta directa PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 reacções (50 uL cada uma) </td></tr><tr><td> Phire tecido animal direto PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 ul cada) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,35 mm (rosa) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Qtd: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,50 milímetros (azul) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Qtd: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris corte Mat 6,4 × 7,6 centímetros </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Qty: 5 </td></tr><tr><td> SspI </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 ul (100 reacções) </td></tr><tr><td> Cycler Piko 24-Bem térmica </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Bem Piko Placas PCR </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Purification Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotyping of plant and animal samples without prior dna purification

A abordagem de PCR directo facilita a amplificação por PCR directamente a partir de pequenas quantidades de amostras não purificadas e é demonstrado aqui para várias plantas e tecidos animais (Figura 1). Directo de PCR baseia-se especialmente projetados Thermo Scientific Phusion e polimerases de ADN Phire, que incluem um domínio de ADN de cadeia dupla ligação que lhes confere propriedades únicas, tais como a tolerância elevada de inibidores. PCR baseado em detecção de DNA-alvo tem inúmeras aplicações na pesquisa de plantas, incluindo a análise de plantas genótipo e verificação de transgenes. PCR a partir de tecidos de planta tradicionalmente envolve uma etapa inicial de isolamento de ADN, o que pode requerer reagentes caros e tóxicos. O processo é demorado e aumenta o risco de contaminação cruzada 1, 2. Por outro lado, usando Thermo Scientific Phire Planta directa PCR Kit o ADN alvo pode ser facilmente detectado, sem extracção prévia de ADN. No modelo aqui demonstrado, umaexemplo de derivado análise da sequência clivada polimórfico amplificado (dCAPS) 3,4 é feita directamente a partir de folhas de plantas de Arabidopsis. ensaios dCAPS genotipagem podem ser utilizados para identificar um polimorfismo (SNP) por SNP digestão com endonucleases de restrição específica de alelo 3. Algumas amostras de plantas tendem a ser mais difícil quando se utiliza métodos directos de PCR em que contêm componentes que interferem com a PCR, tais como compostos fenólicos. Nestes casos, um passo adicional para remover os compostos é tradicionalmente requerido de 2,5. Aqui, este problema é resolvido por meio de um protocolo de diluição rápida e fácil se amplificação por PCR directo (Figura 1). Quinze anos folhas de carvalho são usadas como um modelo para plantas difíceis como a amostra contém grandes quantidades de compostos fenólicos, incluindo taninos. A transferência de genes em ratos é largamente utilizada para estudar o papel de genes em desenfisiologia volvimento, e a doença humana. A utilização destes animais requer triagem para a presença do transgene, geralmente com PCR. Tradicionalmente, isto envolve um tempo de passo de isolamento de ADN de consumo, durante a qual o ADN para análise de PCR é purificado a partir da cauda do ouvido, ou dedo do pé tecidos 6,7. No entanto, com as Thermo Scientific Phire tecido animal diretos PCR Kit ratos transgênicos podem ser genotipados sem purificação de DNA antes. Neste protocolo de rato transgénico genotipagem é obtida directamente a partir de tecidos da orelha do rato, tal como demonstrado aqui para um exemplo desafiador onde apenas um conjunto de primer é usado para a amplificação de dois fragmentos que diferem muito de tamanho.

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Genotipagem de Amostras de Plantas e Animais sem Purificação Prévia de DNA | Biologia | Vídeo

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

A abordagem de PCR directo apresentado aqui facilita a amplificação por PCR directamente a partir de pequenas quantidades de planta não purificada e do tecido animal.

Genotipagem de amostras de plantas e animais, sem purificação DNA Antes

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

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Vídeo: Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

Purificação simplificada do DNA plasmidial das culturas Procarióticas

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in 73 different countries throughout Africa, Asia, Europe, New Zealand, Oceania and the Americas1-2. Cogongrass forms rapidly-spreading, monodominant stands that displace a large variety of native plant species and in turn threaten the native animals that depend on the displaced native plant species for forage and shelter. To add to the problem, an ornamental variety [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] is widely marketed under the names of Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, and Japanese blood grass (JBG). This variety is putatively sterile and noninvasive and is considered a desirable ornamental for its red-colored leaves. However, under the correct conditions, JBG can produce viable seed (Carol Holko, 2009 personal communication) and can revert to a green invasive form that is often indistinguishable from cogongrass as it takes on the distinguishing characteristics of the wild-type invasive variety4 (Figure 1). This makes identification using morphology a difficult task even for well-trained plant taxonomists. Reversion of JBG to an aggressive green phenotype is also not a rare occurrence. Using sequence comparisons of coding and variable regions in both nuclear and chloroplast DNA, we have confirmed that JBG has reverted to the green invasive within the states of Maryland, South Carolina, and Missouri. JBG has been sold and planted in just about every state in the continental U.S. where there is not an active cogongrass infestation. The extent of the revert problem in not well understood because reverted plants are undocumented and often destroyed.
Application of this molecular protocol provides a method to identify JBG reverts and can help keep these varieties from co-occurring and possibly hybridizing. Cogongrass is an obligate outcrosser and, when crossed with a different genotype, can produce viable wind-dispersed seeds that spread cogongrass over wide distances5-7. JBG has a slightly different genotype than cogongrass and may be able to form viable hybrids with cogongrass. To add to the problem, JBG is more cold and shade tolerant than cogongrass8-10, and gene flow between these two varieties is likely to generate hybrids that are more aggressive, shade tolerant, and cold hardy than wild-type cogongrass. While wild-type cogongrass currently infests over 490 million hectares worldwide, in the Southeast U.S. it infests over 500,000 hectares and is capable of occupying most of the U.S. as it rapidly spreads northward due to its broad niche and geographic potential3,7,11. The potential of a genetic crossing is a serious concern for the USDA-APHIS Federal Noxious Week Program. Currently, the USDA-APHIS prohibits JBG in states where there are major cogongrass infestations (e.g., Florida, Alabama, Mississippi). However, preventing the two varieties from combining can prove more difficult as cogongrass and JBG expand their distributions. Furthermore, the distribution of the JBG revert is currently unknown and without the ability to identify these varieties through morphology, some cogongrass infestations may be the result of JBG reverts. Unfortunately, current molecular methods of identification typically rely on AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) and DNA sequencing, both of which are time consuming and costly. Here, we present the first cost-effective and reliable PCR-based molecular genotyping method to accurately distinguish between cogongrass and JBG revert.

A PCR-based Genotyping Method to Distinguish Between Wild-type and Ornamental Varieties of Imperata cylindrica

We provide a cost-effective and rapid molecular genotyping protocol that employs variety-specific PCR primers that target DNA sequence differences within the chloroplast trnL-F spacer region to differentiate between varieties of Imperata cylindrica (cogongrass) that cannot be distinguished by morphology alone. These varieties include the federally listed noxious weed, cogongrass and closely-related, wide-spread ornamental variety, I. cylindrica var. koenigii (Japanese blood grass).

Um método de genotipagem baseados em PCR para distinguir entre variedades do tipo selvagem e Ornamental de Imperata cylindrica</em

Wild-type I. cylindrica (cogongrass) is one of the top ten worst invasive plants in the world, negatively impacting agricultural and natural resources in ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and microbial communities, a comprehensive workflow for DNA and RNA extraction was developed. The workflow concurrently generates viral and microbial metagenomes, as well as metatranscriptomes, from a single sample for next-generation sequencing. The coupling of these approaches provides an overview of both the taxonomical characteristics and the community encoded functions. The presented methods use Cystic Fibrosis (CF) sputum, a problematic sample type, because it is exceptionally viscous and contains high amount of mucins, free neutrophil DNA, and other unknown contaminants. The protocols described here target these problems and successfully recover viral and microbial DNA with minimal human DNA contamination. To complement the metagenomics studies, a metatranscriptomics protocol was optimized to recover both microbial and host mRNA that contains relatively few ribosomal RNA (rRNA) sequences. An overview of the data characteristics is presented to serve as a reference for assessing the success of the methods. Additional CF sputum samples were also collected to (i) evaluate the consistency of the microbiome profiles across seven consecutive days within a single patient, and (ii) compare the consistency of metagenomic approach to a 16S ribosomal RNA gene-based sequencing. The results showed that daily fluctuation of microbial profiles without antibiotic perturbation was minimal and the taxonomy profiles of the common CF-associated bacteria were highly similar between the 16S rDNA libraries and metagenomes generated from the hypotonic lysis (HL)-derived DNA. However, the differences between 16S rDNA taxonomical profiles generated from total DNA and HL-derived DNA suggest that hypotonic lysis and the washing steps benefit in not only removing the human-derived DNA, but also microbial-derived extracellular DNA that may misrepresent the actual microbial profiles.

Using the cystic fibrosis airway as an example, the manuscript presents a comprehensive workflow comprising a combination of metagenomic and metatranscriptomic approaches to characterize the microbial and viral communities in animal-associated samples.

Purificando o Impure: Sequenciação metagenomes e metatranscriptomas do Complexo amostras associadas a animais

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Um Método Seccionamento melhorado para amostras de tecidos de plantas recalcitrante

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Genotipagem de amostras de plantas e animais, sem purificação DNA Antes

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